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食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定1 范围本标准规定了食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量的测定方法。
本标准第一法适用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定；第二法适用于酱油、水果汁、果酱中苯甲酸、山梨酸的测定。
第一法液相色谱法2原理样品经处理后，用液相色谱分离，紫外检测器检测，外标法定量。
3试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂3.1.1氨水（NH3•H2O）。
3.1.2氢氧化钠（NaOH）。
3.1.3硫酸（H2SO4）。
3.1.4亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6•3H2O）。
3.1.5乙酸锌（Zn(CH3COO)2•2H2O）。
3.1.6氯化钠（NaCl）。
3.1.7酒石酸（C4H6O6）。
3.1.8硅酮树脂。
3.1.9磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）。
3.1.10磷酸二氢钾（KH2PO4）。
3.1.11中性氧化铝。
3.1.12甲醇（CH3OH）：色谱纯。
3.1.13乙酸铵（CH3COONH4）。
3.2 试剂配制3.2.1 氨水（1+1）：氨水与水等体积混合，经微孔滤膜过滤后备用。
3.2.2 氢氧化钠溶液（4 g/L）：称取4 g氢氧化钠，溶于水并稀释至1000 mL。
3.2.3硫酸溶液（0.5 mol/L）：移取30 mL浓硫酸（约70%）边搅拌边慢慢加入至500 mL水中，冷却至室温后，转移至1000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
3.2.4亚铁氰化钾溶液（92 g/L）：称取106 g亚铁氰化钾加水至1000 mL。
3.2.5 乙酸锌溶液（183 g/L）：称取220 g乙酸锌溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，加水稀释至1000 mL。
3.2.6 酒石酸溶液（15%）：称取15 g酒石酸，用水定容100 mL。
3.2.7的磷酸盐缓冲液（pH 7.2）：分别称取16.72 g磷酸二氢钠和2.72 g磷酸二氢钾，用水溶解后定容至1000 mL，经微孔滤膜过滤后备用。
高效液相色谱法同时测定食品中5种添加剂唐 奕（邵阳市食品药品检验所，湖南邵阳 422000）摘 要：采用高效液相色谱法同时测定食品中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠和脱氢乙酸等5种添加剂。
样品经前处理，使用C18柱，以甲醇∶0.02 mol/L乙酸铵溶液（7∶93）为流动相，在波长230 nm，流速1 mL/min，柱温40 ℃的条件下测定。
经多次试验，该方法线性关系好，相关系数均在0.999 9以上，平均回收率为82.6%～104.4%，相对标准偏差为1.3%～4.6%。
该方法简单、快速、回收率高及精密度好，适用于食品中5种添加剂的同时检测。
关键词：高效液相色谱法；同时测定；食品添加剂Simultaneous Determination of Five Additives in Food by High Performance Liquid ChromatographyTANG Yi(Shaoyang Food and Drug Inspection Institute, Shaoyang 422000, China) Abstract: Five additives including acesulfame potassium, benzoic acid, sorbic acid, sodium saccharin and dehydroacetic acid in food were simultaneously determined by high performance liquid chromatography. The sample was pretreated, using a C18 column, methanol∶0.02 mol/L ammonium acetate solution (7∶93) as the mobile phase, and the wavelength was 230 nm, the flow rate was 1 mL/min, and the column temperature was 40 ℃. After many experiments, the method has a good linear relationship, the correlation coefficient is above 0.999 9, the average recovery rate is 82.6%～104.4%, and the relative standard deviation is 1.3%～4.6%. The method is simple, fast, high in recovery rate and good in precision, and is suitable for the simultaneous detection of five kinds of additives in food.Keywords: high performance liquid chromatography; simultaneous determination; food additives食品企业在产品中添加甜味剂（安赛蜜、糖精钠）和防腐剂（苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸），以改善食品的口感、延长保质期[1]。
食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的不确定度评估试验作者：暂无来源：《中国食品》 2019年第12期文杨蒙衡利辰张刚磊刘梅陈明慧邳州市市场监督综合检验检测中心测量不确定度一般简称为不确定度，是标准不确定度、合成标准不确定度、A类标准不确定度等各种不确定度的一个总称，也是测量结果可疑程度的一种表述。
本文对GB 5009.28－2016（第一法）测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠方法的测量不确定度进行评定，分析并找出影响该检测项目结果的各种因素，并计算合成不确定度和扩展不确定度，为该项检测方法的研究与检测结果的评估提供依据。
一、测量方法根据GB 5009.28－2016（第一法）高效液相色法规定，进行苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定。
环境条件。
温度（20±5）℃，相对湿度50－70％。
仪器设备。
高效液相色谱：Agilent1260，色谱柱Eclipse Plus C－18柱，柱长100mm，内径4.6mm，粒径3.5μm。
测试对象：柠檬水饮料。
不确定度被测变量评定公式。
被测变量＝样品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的浓度不确定度来源。
根据GB 5009.28－2016（第一法）高效液相色法测试流程，下列参数为不确定度的来源。
不确定度的量化评估。
为了评估不同分量的不确定度，进行精密度研究和真值研究两组实验，尽量覆盖条款4中需评估的不确定度来源，未能完全覆盖的其它分量将分别评估。
①精密度研究：精密度研究是在规定测试条件下，对同一测试样品，经过多次独立试验得到的结果之间的接近程度。
选择三个不同浓度添加样（10ug/ml、40ug/ml、60ug/ml）作为测试样品，测定苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量。
每一浓度由不同人员在不同日期进行四次独立测试。
每次测试需重新配置标准曲线。
结果汇总如下：②真值研究：通过回收率评估真值。
回收率的评估可从分析有证标准物质(CRMs)或添加样来得到。
把60ug/mL苯甲酸、山梨酸和糖精钠添加到一个已知不含苯甲酸、山梨酸和糖精钠的样品中，重复分析十次。
《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》（征求意见稿）编制说明一、标准起草的基本情况（包括简要的起草过程、主要起草单位、起草人等）一）简要起草过程1. 标准任务下达后，天津科技大学针对制定“食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定”国家标准的具体工作进行了认真研究，确定了总体工作方案，并于2014年6月，成立了标准起草工作小组。
2. 起草工作组收集和查阅了相关标准及编制说明，在参考和借鉴国内、国际苯甲酸、山梨酸和糖精钠的检测标准的基础上，结合标准的清理结论，编制了《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》标准初稿。
并由起草人撰写标准文本和编制说明。
3.从2014.9起，标准起草工作组在北京多次召开会议征求专家意见，认真学习研究了反馈的意见和建议，对标准文本及编制说明进行了修改和完善，形成了标准征求意见稿。
于2014年10月，上报食品安全国家标准审评委员会秘书处。
4. 该标准“公示征求意见稿”在卫生部网上向各相关部门及社会公开征求意见后，起草单位将根据反馈的意见对标准文本及编制说明进行进一步的修改和完善，形成标准“送审稿”。
二）主要起草单位、起草人标准负责起草单位：天津科技大学；标准参加起草单位：江西出入境检验检疫局；主要起草人：天津科技大学张颖；其他起草人：天津科技大学张健，江西出入境检验检疫局郭平。
起草人负责标准技术资料查询、收集、整理、标准文本及编制说明的编辑、撰写，行业内征求意见，组织专家对标准预审，标准送审等。
二、标准的重要内容及主要修改情况1.检测食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠现行的标准方法有GB/T 5009.29-2003、GB/T 5009.28-2003、GB/T 23495-2009、GB 21703-2010、SB/T 10389-2004、SN/T 2012-2007，这六项标准在试样处理和检测技术方面条件相似，因此，可以整合形成一项标准，同时，充分考虑GB 2760-2011规定的使用范围及限量，整合后的标准可以替代上述六项标准方法。
134 食品安全导刊 2020年9月Tlogy科技分析与检测食品很容易因为温湿度、环境等出现变质，给企业带来巨大经济损失，也会制约食品行业发展。
防腐剂的添加很好地延长了食品的保质期，因此被广泛添加到食品中。
目前常添加的有苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、丙酸及其盐、脱氢乙酸等。
甜味剂能够改善口感进而增加食欲，常用的甜味剂有糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、纽甜与阿力甜等[1]。
近些年的研究表明食品添加剂超量使用也会危害人体健康，食品安全国家标准对防腐剂和甜味剂的添加量作出明确规定，以保证食品安全[2]。
本文采用液相色谱法同时测定食品中所添加的苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、糖精钠和安赛蜜。
1 试验部分1.1 仪器与试剂Waters allianc acquity e2695液相色谱仪；涡旋混合器；HR/T20 MM 立式高速冷冻离心机；KH-250DB 数控型超声波清洗器。
甲醇（HPLC 纯）；乙酸铵、亚铁氰化钾、乙酸锌均为分析纯；标准试剂：山梨酸、安赛蜜、苯甲酸、糖精钠纯度均＞99%。
1.2 色谱条件色谱柱：C 18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相：甲醇+乙酸铵溶液=8+92；柱温：35 ℃；进样量：10 μL，检测波长：230 nm；流速：1 mL/min。
1.3 样品前处理取2.5 g 左右样品于50 mL 离心管中，加入25 mL 水涡旋振荡，加入2 mL 10.6%的亚铁氰化钾溶液涡旋20 s 混匀，再加入2 mL 22%的乙酸锌溶液涡旋1 min 后定容至刻度线，超声30 min，于10 000 r/min 离心10 min，上清液转移至50 mL 容量瓶中，残渣再加水混匀后离心提取一次，上清液合并至原容量瓶中，用水定容至刻度线混匀，取上清液2 mL 过 0.22 μm 滤膜，供液相色谱上机检测。
2 结果与讨论2.1 流动相条件的选择参照GB 5009.28-2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》检测标准，通过改变甲醇的比例[1]对比验证标准品目标峰的分离和出峰时间，最后确定流动相条件为：甲醇+乙酸铵溶液=8+92。
066苯甲酸、山梨酸、糖精钠是常用的食品添加剂，也是衡量食品卫生质量的重要指标。
苯甲酸、山梨酸具有防腐保鲜的作用，糖精钠是合成甜味剂，甜度比蔗糖甜300－500倍。
GB2760－2016《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》对这三者的添加范围和限量都有明确的规定，超范围或者超限量使用都是违法的。
GB5009.28－2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》对其检测方法做了规定，有高效液相色谱法和高效气相色谱法，其中高效液相色谱法为第一法仲裁法被广泛应用。
国标方法在使用前要进行方法验证，核查实验室能否满足检测方法的要求。
本研究针对高效液相色谱法测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的适用性、线性、检出限、定量限、加标回收率等进行了一一验证，均能够满足检测方法的要求。
一、仪器与试剂1.仪器。
高效液相色谱仪（紫外检测器，Y001），岛津LC－20AT；电子分析天平（Y033），BSA623S－CW，d ＝0.001g。
2.试剂。
苯甲酸钠标准品（唯一性标识3422003，纯度100.0％），北京坛墨质检科技有限公司；山梨酸标准品（唯一性标识3192003，纯度99.9％），北京坛墨质检科技有限公司；糖精钠标准品（唯一性标识3212005，纯度99.5％），北京坛墨质检科技有限公司；甲醇（色谱级），Aigma－Aldrich；乙酸铵（色谱级），aladdin；亚铁氰化钾、乙酸锌（分析纯），天津市天力化学试剂有限公司；实验室用水为自制超纯水。
二、实验与方法1.色谱条件。
（1）色谱柱：Diamonsil Plus 5um C 18，250×4.6mm；检测波长230nm；进样量10uL。
（2）流动相：甲醇＋乙酸铵溶液（0.02mol/L）＝5＋95；流速1mL/min。
高效液相色谱法测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的方法验证2.样品前处理。
准确称取约2g（精确到0.001g）试样于50mL具塞离心管中，加水约25mL，涡旋混匀，于50℃水浴超声20min。
食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定1 范围本方法适用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量的测定。
2 依据GB/T 23495-2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定 高效液相色谱法》。
3 原理不同样品经提取后，将提取液过滤，经反相高效液相色谱分离测定，根据保留时间定性，外标峰面积定量。
.4 试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T 6682要求。
甲醇，乙酸铵等。
苯甲酸标准储备液：称取0.0638g 苯甲酸，用少量乙醇溶解并用水定容至100mL 。
山梨酸标准储备液：称取0.0766g 山梨酸，用少量乙醇溶解并用水定容至100mL 。
糖精钠标准储备液：称取0.0766g 糖精钠，用水溶解并定容至100mL 。
混合标准使用液：分别吸取不同体积苯甲酸、山梨酸和糖精钠标准储备溶液，将其稀释成适当浓度，见附后标准曲线图谱。
5 分析步骤 5.1 样品处理称取适量样品（雪菜）于小烧杯中，用50mL 水分数次将样品移入100mL 容量瓶中，80℃水浴提取30min ，冷却后定容、过滤，滤液待上机分析。
5.2 色谱条件a) Agilent 高效液相色谱仪；b) 色谱柱：C 18柱，250mm ×4.6mm ，5μm ；c) 流动相：0.02mol/L 乙酸铵溶液+甲醇（90+10）； d) 流速：1mL/min ； e) 检测波长：230nm ； f) 进样量：20μL ； g) 柱温：25℃。
5.3 测定取处理液和混合标准使用液各20μL 注入高效液相色谱仪进行分离，以其标准溶液峰的保留时间为依据定性，以其峰面积求出样液中被测物质含量。
6 结果计算样品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量按下式计算： X =式中：X ——样品中待测组分含量，g/kg ；c ×Vm ×1000c ——由标准曲线得出的样液中待测物的浓度，μg /mL ； V ——样品定容体积，mL ； m ——样品质量，g 。
一、编制目的为规范食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定方法，编制本指导书。
二、适用范围本指导书适用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定。
三、编制依据GB 5009.28-2016《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》四、实验原理样品经水提取，高脂肪样品经正己烷脱脂、高蛋白样品经蛋白沉淀剂沉淀蛋白，采用液相色谱分离、紫外检测器检测，外标法定量。
五、试剂和材料除非另有说明,所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
5.1 试剂5.1.1 氨水（NH3˙H2O）。
5.1.2 亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6˙3H2O]。
5.1.3 乙酸锌[Zn(CH3COON)2˙2H2O]。
5.1.4 无水乙醇（CH3CH2OH）。
5.1.5 正已烷（C6H14）。
5.1.6 甲醇（CH3OH）。
5.1.7 乙酸铵（CH3 C00NH4）：色谱纯。
5.1.8 甲酸（HCOOH）：色谱纯。
5.2 试剂配制5.2.1 氨水溶液（1+99）：取氨水1ml，加到99ml水中，混匀。
5.2.2 亚铁氰化钾溶液（92g/L）：称取106g亚铁氰化钾，加入适量水溶解，用水定容至1000ml。
5.2.3 乙酸锌溶液（183g/L）：称取220g乙酸锌溶于少量水中，加入30ml 冰乙酸，用水定容至1000ml。
5.2.4 乙酸锌溶液（20mmol/L）：称取1.54g乙酸锌，加入适量水溶解，用水定容至1000ml，经0.22um水相微孔滤膜过滤后备用。
5.2.5 甲酸-乙酸铵溶液（2mmol/L甲酸+20mmol/L乙酸铵）：称取1.54g 乙酸铵，加入适量水溶解，再加入75.2ul甲酸，用水定容至1000ml，经0.22um水相微孔过滤后备用。
5.3 标准品5.3.1 苯甲酸钠（C6H5COONa，CAS号：532-32-1），纯度≥99.0%；苯甲酸（C6H5COOH,CAS号：65-85-0），纯度≥99.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
食品安全国家标准食品添加剂糖精钠1 范围本标准适用于以苯二甲酸酐为原料经化学合成制得的食品添加剂糖精钠。
2 分子式、结构式和相对分子质量2.1 分子式C7H4NNaO3S·2H2O2.2 结构式2.3 相对分子质量241.20（按2007年国际相对原子质量）3 技术要求3.1 感官要求感官要求应符合表1的规定。
表1 感官要求3.2 理化指标理化指标应符合表2的规定。
附录A 检验方法A.1 一般规定本标准所用试剂和水在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T 6682规定的三级水。
试剂中所用标准溶液、杂质测定用标准溶液、制剂和制品，在没有注明其他要求时均按GB/T 601、GB/T 602、GB/T 603之规定制备。
试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。
A.2 鉴别试验 A.2.1 试剂和材料 A.2.1.1 间苯二酚。
A.2.1.2 硫酸。
A.2.1.3 氢氧化钠溶液：40 g/L 。
A.2.1.4 盐酸溶液：1+9。
A.2.2 分析步骤A.2.2.1 取约20 mg 试样，加约40 mg 间苯二酚，混和后加硫酸10滴，用微火加热，至显深绿色，放冷，加10 mL 水与10 mL 的氢氧化钠溶液，即成绿色有荧光的溶液。
A.2.2.2 取铂丝，用盐酸溶液湿润后，蘸取试样，在无色火焰中燃烧，火焰即显鲜黄色。
A.2.3 熔点测定按GB/T 617规定的方法测定。
取约0.3 g 试样，加5 mL 水溶解后，加1 mL 稀盐酸，即析出结晶，过滤，滤渣用水洗净，经105 ℃±2 ℃干燥后测定其熔点应为226 ℃～230 ℃。
A.2.4 溶解性易溶于水，微溶于乙醇。
A.3 糖精钠含量的测定 A.3.1 试剂和材料 A.3.1.1 冰乙酸。
A.3.1.2 乙酸酐。
A.3.1.3 结晶紫指示液：5 g/L 。
A.3.1.4 高氯酸标准滴定溶液：c （HClO 4）=0.1 mol/L 。
食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定1 范围本标准规定了食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量的测定方法。
本标准第一法适用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定；第二法适用于酱油、水果汁、果酱中苯甲酸、山梨酸的测定。
第一法液相色谱法2原理样品经处理后，用液相色谱分离，紫外检测器检测，外标法定量。
3试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂3.1.1氨水（NH3•H2O）。
3.1.2氢氧化钠（NaOH）。
3.1.3硫酸（H2SO4）。
3.1.4亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6•3H2O）。
3.1.5乙酸锌（Zn(CH3COO)2•2H2O）。
3.1.6氯化钠（NaCl）。
3.1.7酒石酸（C4H6O6）。
3.1.8硅酮树脂。
3.1.9磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）。
3.1.10磷酸二氢钾（KH2PO4）。
3.1.11中性氧化铝。
3.1.12甲醇（CH3OH）：色谱纯。
3.1.13乙酸铵（CH3COONH4）。
3.2 试剂配制3.2.1 氨水（1+1）：氨水与水等体积混合，经微孔滤膜过滤后备用。
3.2.2 氢氧化钠溶液（4 g/L）：称取4 g氢氧化钠，溶于水并稀释至1000 mL。
3.2.3硫酸溶液（0.5 mol/L）：移取30 mL浓硫酸（约70%）边搅拌边慢慢加入至500 mL水中，冷却至室温后，转移至1000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
3.2.4亚铁氰化钾溶液（92 g/L）：称取106 g亚铁氰化钾加水至1000 mL。
3.2.5 乙酸锌溶液（183 g/L）：称取220 g乙酸锌溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，加水稀释至1000 mL。
3.2.6 酒石酸溶液（15%）：称取15 g酒石酸，用水定容100 mL。
3.2.7的磷酸盐缓冲液（pH 7.2）：分别称取16.72 g磷酸二氢钠和2.72 g磷酸二氢钾，用水溶解后定容至1000 mL，经微孔滤膜过滤后备用。
3.2.8中性氧化铝：层析用，100目~200目。
105℃干燥2 h，于干燥器中冷却至室温，每100 g中加入2 mL水降活，混匀后密封，放置12 h后使用；或按照使用量的不同，选择合适的活化温度及时间。
3.2.9乙酸铵溶液（1.54 g/L）：称取1.54 g乙酸铵，加水溶解并稀释至1000 mL，经微孔滤膜过滤后备用。
3.3 标准品3.3.1 苯甲酸钠（C6H5COONa）：CAS：532-32-1，纯度≥99%。
3.3.2 山梨酸钾（C6H7KO2）：CAS：590-00-1，纯度≥99%。
3.3.3 糖精钠（C6H4CONNaSO2）：CAS：128-44-9，纯度≥99%。
3.4 标准溶液配制3.4.1苯甲酸钠标准储备液：准确称取0.2360 g苯甲酸钠，加水溶解并定容至200 mL。
此溶液每毫升相当于含苯甲酸1.00 mg。
3.4.2山梨酸钾标准储备液：准确称取0.2680 g山梨酸钾，加水溶解并定容至200 mL。
此溶液每毫升相当于含山梨酸1.00 mg。
3.4.3糖精钠标准储备液：准确称取0.2340 g糖精钠（120℃烘4 h），加水溶解并定容至200 mL。
此溶液中糖精钠的含量为1.00 mg/mL。
3.4.4 混合标准系列使用液：分别准确吸取不同体积苯甲酸钠、山梨酸钾和糖精钠标准储备溶液，将其稀释成苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量分别为0.000 mg/mL、0.020 mg/mL、0.040 mg/mL、0.080 mg/mL、0.160 mg/mL、0.320 mg/mL的混合标准系列使用液。
4仪器和设备4.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器。
4.2天平：感量为0.001 g和0.0001 g。
5 分析步骤5.1 试样制备5.1.1 液体样品5.1.1.1汽水等含气类样品：称取5 g~10 g（精确至0.001g）样品于小烧杯中，微温搅拌除去二氧化碳，用氨水（1+1）调节pH至近中性，用水定容至适当体积，经微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。
5.1.1.2预调酒等含醇类样品：称取10 g（精确至0.001g）样品于小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水（1+1）调节pH至近中性，用水定容至适当体积，经微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。
5.1.1.3 高蛋白类样品：贮藏在冰箱中的乳与乳制品，应在试验前预先取出，并达室温，称量20 g （精确至0.001g）样品于100 mL容量瓶中。
向容量瓶中加入25mL氢氧化钠溶液，混合后置于超声波水浴或70℃水浴中处理15 min。
冷却后，用硫酸溶液将pH调节到8（用pH计或pH试纸均可），然后加入2 mL亚铁氰化钾溶液和2 mL乙酸锌溶液。
剧烈振摇，静置15 min，混合后冷却到室温，再用水定容，静置15 min，上清液经微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。
5.1.1.4食醋样品：称取50.0 mL，加入40 g氯化钠，5 mL 15%酒石酸溶液，1滴硅酮树脂（作为消泡剂），加水至约200 mL，混匀后，进行蒸馏（蒸馏速度约为2.5 mL/min），收集约90 mL馏出液，用水定容至100 mL。
清液经微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。
5.1.1.5 其他液体样品：称取5 g~10 g （精确至0.001g ）样品，用氨水（1+1）调节pH 至近中性，用水定容至适当体积，经微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。
5.1.2 半固体、固体样品5.1.2.1 高油脂类样品：称取2 g~3 g （精确至0.001g ）样品于50mL 具塞离心管中，加入10 mL 磷酸盐缓冲液（pH 7.2），用旋涡混合器充分混合，然后于4,000 r/min 离心5 min ，小心吸出水层转移到25 mL 容量瓶中，再加入10 mL 磷酸盐缓冲液（pH 7.2）于具塞离心管中，重复上述步骤，合并两次水层液，用磷酸盐缓冲液（pH 7.2）定容至刻度，混匀，用微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。
5.1.2.2 高蛋白类样品：称取粉碎均匀的2 g~3 g （精确至0.001g ）样品于小烧杯中，用20 mL 水分数次清洗小烧杯，将样品移入25 mL 容量瓶中，超声振荡提取5 min ，取出后加2 mL 亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入2 mL 乙酸锌溶液，摇匀，用水定容至刻度。
移入离心管中，4,000 r/min 离心5 min 。
取上清液，用微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。
5.1.2.3 固态乳制品：称取3 g （精确至0.001g ）样品于100 mL 容量瓶中，加10 mL 水，用玻璃棒搅拌至完全溶解。
再按“5.1.1.3高蛋白类样品”处理。
5.1.2.4 其他固体样品：称取2 g~3 g （精确至0.001g ）样品，加水适量，转移至25 mL 容量瓶中，再加水至约20 mL ，置60℃~70℃水浴中加热片刻，加塞，剧烈振摇使其分散均匀后，加氨水（1+1）调节pH 至近中性，加塞，剧烈振摇，使样品在水中分散均匀，置60℃~70℃水浴锅中加热30 min ，取出后趁热超声5 min ，冷却后用水定容至刻度，用微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。
5.2 色谱参考条件5.2.1 色谱柱：C 18柱，柱长250 mm ，内径4.6 mm ，粒径5 µm 或同等性能的色谱柱。
5.2.2 检测器：紫外检测器。
5.2.3 流动相：甲醇+乙酸铵溶液=5+95或相当性能的流动相。
5.2.4 流速：1 mL/min 。
5.2.5 检测波长：230 nm 。
5.2.6 进样量：10 µL 。
5.3 标准曲线的制作将混合标准系列使用液分别注入液相色谱仪中，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
5.4 试样溶液的测定将试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中苯甲酸钠、山梨酸钾和糖精钠的浓度，平行测定次数不少于两次。
6 结果计算试样中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量A 1按公式（1）计算： 100010001111⨯⨯⨯=m V c A (1)式中：A 1 ——样品中待测组分含量，单位为克每千克（g/kg ）；c 1 ——由标准曲线得出的样液中待测物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL ）； V 1——样品定容体积，单位为毫升（mL ）； m 1——样品质量，单位为克（g ）。
试验结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。
7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15 %。
8 其他取样量为2.5 g时，样品检出限：苯甲酸、山梨酸、糖精钠的检出限分别为2 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg；样品定量限：苯甲酸、山梨酸、糖精钠的检出限分别为6 mg/kg、6 mg/kg、9 mg/kg。
第二法气相色谱法8 原理试样酸化后，用乙醚提取出苯甲酸、山梨酸，用附氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，与标准系列比较，外标法定量。
9 试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
9.1 试剂9.1.1乙醚（C2H5OC2H5）：不含过氧化物。
9.1.2石油醚：沸程30℃~60℃。
9.1.3盐酸（HCl）。
9.1.4氯化钠（NaCl）。
9.1.5无水硫酸钠（Na2SO4）。
9.2 试剂配制9.2.1 盐酸溶液（1+1）：取100 mL盐酸，边搅拌边慢慢加入至50 mL水中，冷却至室温后，加水稀释至200mL。
9.2.2氯化钠酸性溶液（40 g/L）：于氯化钠溶液（40 g/L）中加少量盐酸（1+1）酸化。
9.2.3石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂：取150 mL石油醚和50 mL乙醚，混合。
9.3 标准品9.3.1 苯甲酸（C6H5COOH）：CAS：65-85-0，纯度≥99%。
9.3.2 山梨酸（C6H8O2）：CAS：110-44-1，纯度≥99%。
9.4 标准溶液配制9.4.1 苯甲酸、山梨酸标准储备液准确称取苯甲酸、山梨酸各0.2 g（精确至0.0001g），置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解后并稀释至刻度。
此溶液每毫升相当于2.0 mg苯甲酸或山梨酸。
9.4.2 苯甲酸、山梨酸标准系列工作液吸取适量的苯甲酸、山梨酸标准储备液，以石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂稀释至每毫升相当于50 µg、100 µg、150 µg、200 µg、250 µg苯甲酸或山梨酸。
10 仪器和设备10.1 气相色谱仪：具有氢火焰离子化检测器（FID ）。
10.2 天平：感量为0.001 g 和0.0001 g 。
11 分析步骤 11.1 试样制备称取2.5 g （精确至0.001g ）事先混合均匀的试样，置于25 mL 具塞量筒中，加0.5 mL 盐酸（1+1）酸化，用15 mL 和10 mL 乙醚提取两次，每次振摇1 min ，将上层乙醚提取液吸入另一个25 mL 具塞量筒中，合并乙醚提取液。
