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微生物比浊法测定硫酸庆大霉素注射液的效价
李哲媛;康勇;范兵
【期刊名称】《中国药业》
【年(卷),期】2005(14)3
【摘要】目的:建立测定硫酸庆大霉素注射液效价的微生物比浊法.方法:分别采用微生物比浊法和管碟法对硫酸庆大霉素的含量进行测定和比较研究.结果:硫酸庆大霉素的线性范围为0.5～1.3 U/mL,r=0.994 8,平均回收率为
100.94%,RSD=0.23%.结论:微生物比浊法具有简便、精确、快速的特点,可以应用于该产品的质量控制.
【总页数】2页(P38-39)
【作者】李哲媛;康勇;范兵
【作者单位】云南省药品检验所,云南,昆明,650011;云南省药品检验所,云南,昆明,650011;云南省药品检验所,云南,昆明,650011
【正文语种】中文
【中图分类】R927.12;R978.1+2
【相关文献】
1.微生物比浊法测定妥布霉素地塞米松眼膏的效价 [J], 王洪家;郭福庆
2.微生物比浊法测定妥布霉素、硫酸妥布霉素注射液及妥布霉素滴眼液的效价 [J], 郭福庆;王洪家
3.微生物比浊法测定注射用替考拉宁的效价含量 [J], 张文杰
4.微生物比浊法测定硫酸庆大霉素颗粒效价 [J], 张胜波;屈胜环
5.微生物比浊法测定硫酸安普霉素效价的研究 [J], 刘远声;种利红;周志霞;李玉平;张永旺
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制药GMP管理文件一．目的：制定硫酸庆大霉素内控质量标准，规范公司硫酸庆大霉素的采购与生产。
二．适用范围：适用于硫酸庆大霉素的采购与验收。
三．责任者：生产部经理、质管部经理、检验员四．正文：硫酸庆大霉素本品按无水物计算，每1mg的效价不得少于590庆大霉素单位。
【性状】本品为白色或类白色的粉末；无臭；有引湿性。
本品在水中易溶，在乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶。
比旋度取本品，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml 中约含50mg的溶液，依法测定，比旋度为+107°至+121°。
【鉴别】（1）取本品约5mg，加水1ml溶解后，加0.1%茚三酮的水饱和正丁醇溶液1ml与吡啶0.5ml，在水浴中加热5分钟，即显紫蓝色。
（2）取本品与庆大霉素标准品，分别加水制成每1ml中含20mg 的溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2ul，分别点于同一硅胶G薄层板（临用前于105℃活化2小时）上；另取三氯甲烷-甲醇-浓氨溶液(1：1：1)混合振摇，放置1小时，分取下层混合液为展开剂，展开，取出于20~25℃晾干，置碘蒸气中显色，供试品溶液所显主斑点数、位置和颜色应与标准品溶液斑点数、位置和颜色相同。
（3）本品的红外吸收图谱应与对照的图谱一致。
（4）本品的水溶液显硫酸盐的鉴别反应。
【检查】酸度取本品，加水制成每1ml中含40mg的溶液，依法测定，PH值应为4.0～6.0。
溶液的澄清度与颜色取本品5份，各0.4g，分别加水5ml使溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色2号标准比色液比较，均不得更深。
硫酸盐取本品约0.125g，精密称定，加水100ml使溶解，用浓氨溶液调节PH值至11，精密加氯化钡滴定液（0.1mol/L）10ml及酞紫指示液5滴，用乙二胺四醋酸二钠滴定液（0.05mol/L）滴定，注意保持滴定过程中的PH值保持为11，滴定至紫色开始消褪，加乙醇50ml，继续滴定至紫蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。
庆大霉素标准品制备中效价测定及原材料选择的研究韩宁宁;徐嫄;于丽娜;郝利华;赵晖【摘要】在近期庆大霉素标准品制备过程中遇到两个问题——双圈与可靠性测验不符合规定.通过调整菌悬液浓度、抗生素浓度及上层菌液加入量使双圈现象得以抑制,以保证测量结果准确可靠.C组分测定结果显示原料药与标准品C组分差异较大,容易导致二者剂量反应直线不平行,进而影响可靠性测验结果.通过更换与标准品C组分更为相近的原料药使可靠性测验符合规定.上述改进措施保证了国家标准品赋值的准确性,以期为同业人员效价测定遇到类似问题提供借鉴.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2015(049)009【总页数】4页(P37-40)【关键词】庆大霉素;C组分;双圈;三剂量法;可靠性测验【作者】韩宁宁;徐嫄;于丽娜;郝利华;赵晖【作者单位】中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081【正文语种】中文【中图分类】S859.796庆大霉素(gentamicin，GM)是由小单孢菌属(Micromonosporapurpurea)发酵产生的一组结构相近的多组分氨基糖苷类抗生素，它们在结构上是由脱氧链霉胺(purposamine)、紫素胺和3-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺缩合成的苷。
临床上使用的庆大霉素主要由Cl、Cla、C2、C2a四个活性成分组成，另外还有其他几个微量组分，如西索米星(sisomicin)、庆大霉素C2b(也称为沙加霉素，sagalnicin)、二-氢氧-庆大霉素C2a(Antibiotic JI-20 B，它是Cl、C2和C2a的前导物)等[1-2]。
多组分抗生素对检定菌抑菌作用存在差异，易发生双圈现象，在兽药典抗生素微生物检定法[3]规定范围内，通过调整菌浓、加菌量、加药量等措施可使双圈得以抑制。
抗生素类药物分析练习试卷1(题后含答案及解析) 题型有：1. A1型题 2. B1型题 3. X型题1．β-内酰胺类抗生素药物的基本性质是A．分子结构中的共轭双键骨架，手性碳原子B．氢化噻唑环的羧基的酸性C．β-内酰胺环的不稳定性D．B+CE．A+B+C正确答案：E 涉及知识点：抗生素类药物分析2．β-内酰胺类药物的含量测定方法通常有A．碘量法和硫醇汞盐紫外法B．高效液相色谱法C．酸碱滴定法D．B+CE．A+C正确答案：E 涉及知识点：抗生素类药物分析3．青霉素类药物的含量测定，都适用的一组方法是A．高效液相色谱；容量沉淀法B．电化学法；分光光度法C．碘量法；铜盐法；酸碱滴定法D．旋光法；紫外分光光度法；比色法E．酸碱滴定法；紫外分光光度法；非水溶液滴定法正确答案：C 涉及知识点：抗生素类药物分析4．与茚三酮试液产生颜色反应(生成蓝紫色产物)的药物是A．维生素EB．醋酸泼尼松C．磺胺嘧啶D．司可巴比妥E．庆大霉素正确答案：E 涉及知识点：抗生素类药物分析5．下列药物与茚三酮试剂反应，显蓝紫色的是A．地西泮B．硝西泮C．青霉素D．对乙酰氨基酚E．丁卡因正确答案：C 涉及知识点：抗生素类药物分析6．坂口反应是下列药物的特征反应A．维生素EB．醋酸泼尼松C．四环素D．链霉素E．庆大霉素正确答案：D 涉及知识点：抗生素类药物分析7．青霉素类药物在pH=4的条件下不稳定，发生降解，其产物为A．青霉醛B．青霉噻唑酸C．青霉二酸D．青霉胺E．青霉烯酸正确答案：E 涉及知识点：抗生素类药物分析A．羟肟酸铁反应B．茚三酮颜色反应C．FeCl3反应D．麦芽酚反应E．坂口反应8．青霉素的鉴别反应是正确答案：A 涉及知识点：抗生素类药物分析9．庆大霉素的鉴别反应正确答案：B 涉及知识点：抗生素类药物分析10．链霉素的鉴别反应是正确答案：D 涉及知识点：抗生素类药物分析11．头孢唑林钠的鉴别反应是正确答案：A 涉及知识点：抗生素类药物分析12．金霉素的鉴别反应是正确答案：C 涉及知识点：抗生素类药物分析A．盐酸氯丙嗪B．青霉素钠C．氨苄西林D．葡萄糖注射液E．土霉素13．采用微生物检定法的是正确答案：E 涉及知识点：抗生素类药物分析14．采用非水滴定法的是正确答案：A 涉及知识点：抗生素类药物分析15．采用旋光度测定法的是正确答案：D 涉及知识点：抗生素类药物分析16．采用碘量法的是正确答案：C 涉及知识点：抗生素类药物分析17．采用硫酸汞盐紫外分光法的是正确答案：B 涉及知识点：抗生素类药物分析A．坂口反应B．二苯甲酮的检查C．戊烯二醛反应D．钯离子呈色反应E．酸性染料比色法18．地西泮的鉴别反应是正确答案：B 涉及知识点：抗生素类药物分析19．硫酸阿托品的鉴别反应是正确答案：E 涉及知识点：抗生素类药物分析20．链霉素的鉴别反应是正确答案：A 涉及知识点：抗生素类药物分析21．尼可刹米的鉴别反应是正确答案：C 涉及知识点：抗生素类药物分析22．盐酸氯丙嗪的鉴别反应是正确答案：D 涉及知识点：抗生素类药物分析A．外标液B．内标液C．供试液D．对照液E．标准液23．对照法鉴别头孢唑林钠需正确答案：D 涉及知识点：抗生素类药物分析24．紫外分光光度法测定盐酸利多卡因片需正确答案：C 涉及知识点：抗生素类药物分析25．药物中铁盐的检查需正确答案：D 涉及知识点：抗生素类药物分析26．HPLC法测定氢化可的松需正确答案：A 涉及知识点：抗生素类药物分析27．微生物法测定红霉素效价需正确答案：E 涉及知识点：抗生素类药物分析A．茚三酮试剂显蓝紫色B．三氯化铁试剂显红棕色C．羟肟酸铁反应呈红色D．硅钨酸试剂显白色沉淀E．Kober试剂反应，显桃红色28．雌二醇与正确答案：E 涉及知识点：抗生素类药物分析29．青霉素钠与正确答案：C 涉及知识点：抗生素类药物分析30．维生素B1与正确答案：D 涉及知识点：抗生素类药物分析31．盐酸四环素与正确答案：B 涉及知识点：抗生素类药物分析32．庆大霉素与正确答案：A 涉及知识点：抗生素类药物分析A．差向异构物B．游离肼C．其他甾体D．热原E．异常毒性33．皮质激素检查的是正确答案：C 涉及知识点：抗生素类药物分析34．硫酸庆大霉素检查的是正确答案：E 涉及知识点：抗生素类药物分析35．异烟肼检查的是正确答案：B 涉及知识点：抗生素类药物分析36．金霉素检查的是正确答案：A 涉及知识点：抗生素类药物分析37．葡萄糖注射液检查的是正确答案：D 涉及知识点：抗生素类药物分析A．大环内酯类B．氨基糖苷类C．四环素类D．4奶咖波长处E．麦芽酚反应38．四环素类抗生素采用比色法测定含量是在正确答案：D 涉及知识点：抗生素类药物分析39．链霉素特有的反应是正确答案：E 涉及知识点：抗生素类药物分析40．链霉素，卡那霉素，庆大霉素是正确答案：B 涉及知识点：抗生素类药物分析41．红霉素，麦迪霉素，阿奇霉素是正确答案：A 涉及知识点：抗生素类药物分析42．金霉素，强力霉素，多西环素是正确答案：C 涉及知识点：抗生素类药物分析A．链霉素B．庆大霉素C．青霉素D．四环素E．维生素A43．采用三氯化锑反应鉴别的药物是正确答案：E 涉及知识点：抗生素类药物分析44．采用麦芽酚反应鉴别的药物是正确答案：A 涉及知识点：抗生素类药物分析45．采用三氯化铁反应鉴别的药物是正确答案：D 涉及知识点：抗生素类药物分析46．采用茚三酮反应鉴别的药物是正确答案：B 涉及知识点：抗生素类药物分析47．采用坂口反应鉴别的药物是正确答案：A 涉及知识点：抗生素类药物分析A．深褐色B．紫堇色C．红棕色D．蓝色至紫红色E．橙褐色48．盐酸四环素与三氯化铁试液反应显正确答案：C 涉及知识点：抗生素类药物分析49．盐酸金霉素与三氯化铁试液反应显正确答案：A 涉及知识点：抗生素类药物分析50．盐酸土霉素与三氯化铁试液反应显正确答案：E 涉及知识点：抗生素类药物分析51．水杨酸与三氯化铁试液反应显正确答案：B 涉及知识点：抗生素类药物分析52．维生素A与三氯化锑试液反应显正确答案：D 涉及知识点：抗生素类药物分析53．β-内酰胺类抗生素经水解后，可以利用水解产物测定其含量，采用的方法是A．可见紫外分光光度法B．亚硝酸钠滴定法C．碘量法D．酸碱滴定法E．生物效价法正确答案：A,C,D 涉及知识点：抗生素类药物分析54．β-内酰胺类抗生素的鉴别反应是A．还原碘的反应B．羟肟酸铁反应C．还原酒石酸铜的反应D．硫酸-硝酸显色反应E．变色酸-硫酸显色反应正确答案：C,D,E 涉及知识点：抗生素类药物分析55．《中国药典》(2000年版)规定鉴别硫酸链霉素的反应是A．茚三酮反应B．Kober反应C．坂口反应D．麦牙酚反应E．重氮化-偶合反应正确答案：C,D 涉及知识点：抗生素类药物分析56．β-内酰胺类抗生素的测定方法是A．高效液相色谱法B．紫外分光光度法C．碘量法D．汞量法E．酸碱滴定法正确答案：B,C,D 涉及知识点：抗生素类药物分析57．氨基糖苷类抗生素的特殊鉴别反应有A．坂口反应B．麦芽酚反应C．浓硫酸显色反应D．发烟硝酸反应E．Kober反应正确答案：A,B 涉及知识点：抗生素类药物分析58．链霉素的鉴别试验是A．脲酸铵反应B．麦芽酚反应C．茚三酮反应D．N-甲基葡萄糖胺反应E．坂口反应正确答案：B,C,D,E 涉及知识点：抗生素类药物分析59．四环素类抗生素的鉴别反应是A．三氯化铁反应B．溴水反应C．浓硫酸反应D．荧光反应E．坂口反应正确答案：A,C 涉及知识点：抗生素类药物分析60．和茚三酮试剂发生呈色反应的药物是A．苯巴比妥B．土霉素C．氨基酸D．链霉素E．庆大霉素正确答案：C,D,E 涉及知识点：抗生素类药物分析61．青霉素或头孢菌素采用碘量法测定含量，其主要条件包括A．需进行空白试验校正B．空白试验采用未经过水解的样品溶液进行C．反应液的pH应为4.5左右D．反应温度在24～26℃为宜E．采用青霉素标准品平行对照测定并计算含量正确答案：A,B,C,D,E 涉及知识点：抗生素类药物分析62．青霉素或头孢菌素可以采用酸碱滴定法测定含量，其操作要点为A．需进行空白试验校正B．空白试验采用未经过水解的样品溶液进行C．溶解样品的水为新沸放冷的水D．在强碱性条件下水解E．水解应在水浴中进行正确答案：A,C,D,E 涉及知识点：抗生素类药物分析63．青霉素类药物采用可见紫外分光光度法测定含量，以下叙述正确的有A．包括铜盐法和硫醇汞盐法B．其原理是利用酸性条件下的降解产物青霉烯酸在紫外区有强吸收C．加入铜盐或汞盐可以增加测定溶液的稳定性D．其原理是利用碱性条件下的降解产物青霉烯酸在紫外区有强吸收E．测定波长一般在320～345nm正确答案：A,B,C,E 涉及知识点：抗生素类药物分析。
用管碟法（2.2）法，测定链霉素活菌剂的效价，估计效价为1 000 000 u/g，供试品最终浓度为1.4u/ml 及0.7u/ml。
链霉素的效价测定抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效性）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
第一法管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液的制备枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液取枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。
用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)悬液取短小芽孢杆菌［CMCC(B)63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面,用培养基Ⅲ或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）悬液取大肠杆菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
三剂量浊度法庆大霉素效价测定的不确定度分析
韩宁宁;戴青;于丽娜;王静文;徐嫄;赵晖
【期刊名称】《中国兽医杂志》
【年(卷),期】2017(053)011
【摘要】为了对三剂量浊度法庆大霉素效价测定的不确定度进行评定,按照《测量不确定度评定与表示》(JJF1059.1-2012)中的规定进行计算.测定结果的扩展相对不确定度为U=14单位.庆大霉素原料的测定结果可以表示为639±14单位,k=2.稀释过程的标准操作所占不确定度分量比重最大,提示标准品标定赋值人员应注意操作的规范一致.
【总页数】3页(P97-99)
【作者】韩宁宁;戴青;于丽娜;王静文;徐嫄;赵晖
【作者单位】中国兽医药品监察所,北京海淀100081;中国兽医药品监察所,北京海淀100081;中国兽医药品监察所,北京海淀100081;中国兽医药品监察所,北京海淀100081;中国兽医药品监察所,北京海淀100081;中国兽医药品监察所,北京海淀100081
【正文语种】中文
【中图分类】R927
【相关文献】
1.分析测试中测量不确定度及评定第三部分分析测试中主要不确定度分量的评定[J], 曹宏燕
2.微生物检定法测定庆大霉素注射液含量的不确定度分析 [J], 董超琪;袁华峰
3.静脉用大剂量庆大霉素致呼吸抑制4例分析 [J], 刘大平;李梅
4.效价测定法标定标准品含量的不确定度分析 [J], 刘英
5.低浓度小剂量多次鼓室注射庆大霉素对单侧难治性梅尼埃病的疗效分析 [J], 纪小美;于雪君;李蔚;倪志军;任攀;刘进财
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・检验技术与方法・硫酸庆大霉素微生物法效价测定方法的改进周芝梅【文献标识码】B【中图分类号】R927.1;R978.1【文章编号】1007-1040(2002)04-0239-01【关键词】硫酸庆大霉素; 效价; 测定 依照《中国药典(2000年)版》二部提供的方法测定庆大霉素效价,现通过在供试品溶液制备时增加缓冲液中氯化钠的浓度,对测定庆大霉素效价的方法进行改进探讨,取得了比较满意的结果。
1 材料与方法(1)仪器、试剂及药品 Z-82B抑菌圈面积测定分析仪(南通无线电仪器厂);游标卡尺(精密0. 02mm);氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾;硫酸庆大霉素注射液。
按《中国药典(2000年)版》二部配制含氯化钠分别为2.0%、4.0%、6.0%、8.0%的磷酸盐缓冲溶液(pH值7.8～8.0)。
改进法为含氯化钠5.0%的磷酸盐缓冲溶液(pH值7.8～8.0)。
(2)供试品溶液 用于标准曲线测定的浓度为采用庆大霉素标准品分别配成1、3、5、7、9、11、13u/ml 的溶液,用于效价测定的浓度为:高剂量10u/ml;低剂量5u/ml。
其他操作方法均按《中国药典(2000年)版》二部规定进行。
2 结果与讨论【作者单位】淮北药业有限责任公司,安徽淮北 2350002.1 缓冲液中氯化钠浓度对抑菌圈直径的影响 庆大霉素微生物法效价测定在测试浓度、上层菌层培养基加菌量相等的情况下,高剂量抑菌圈直径随缓冲液中氯化钠浓度的增大而增大;而低剂量抑菌圈直径则随缓冲液中氯化钠浓度的增大变化较复杂。
当氯化钠浓度由0增大至2.0%时,抑菌圈直径增大;当氯化钠浓度由2.0%增大至8.0%时,抑菌圈直径变化不太大,当氯化钠浓度在4.0%以上时可形成直径为18～22mm的抑菌圈,高低剂量直径之差也增大,菌层生长密集,抑菌圈边缘较清晰,可用Z-82B抑菌圈面积测量分析仪直接测量,且测得结果的可信限率也较好(表1)。
表1 氯化钠浓度与庆大霉素抑菌直径的关系3氯化钠浓度(%)抑菌圈直径(mm)低剂量(5u/ml)高剂量(10u/ml)010.2212.632.014.3717.644.014.1318.556.013.8918.968.014.2620.38 3均为8个抑菌圈直径的平均值2.2 改进法与药典法标准曲线 庆大霉素在2～10u/ml浓度范围内,两法对数剂量与抑菌圈半径之平方均呈直线关系,但改进法比药典法直线斜率小,从而有利于检测的灵敏度与重现性。
实验三微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价一、概述由于抗生素多为结构复杂的多组分物质，异构体多，且不稳定，容易产生降解杂质，故各国药典均以微生物检定法为主要含量测定法，因为抗生素药品的医疗作用主要是它的抗菌活力，而微生物检定法正是以抗生素的抗菌活力为指标来衡量抗生素效价的一种方法，其测定原理与临床要求相一致，能直接反映抗生素医疗价值，因此一直为各国药典所采用的主要测定方法。
微生物检定法测定抗生素效价，一般可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法三类。
以琼脂扩散法应用最广泛，为目前国际上测定抗生素效价的通用方法。
琼脂扩散法，亦称管碟法。
系采用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
二、基本设备、用具和试验材料1. 基本设备(1) 抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。
该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。
(2) 超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。
(3) 抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。
2.用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16-17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。
新购的双碟应按上述要求进行检查。
检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140-160℃干热灭菌2小时后备用。
(2) 陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。
(3) 不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。
(4) 小钢管放置器：四孔，一台。
硫酸庆大霉素片含量测定的不确定度评估邢以文【摘要】目的以统计学为工具建立硫酸庆大霉素片含量测定(微生物检定法)的测量不确定度评估方法.方法通过建立数学模型,找出影响其不确定度的因素,并对其不确定度各分量进行分析计算,最后计算出合成标准不确定度Uc和扩展不确定度U95.结果硫酸庆大霉素片含量测定结果可表示为(98.6±3.2)%;k=2.结论本文所建立的方法可用于该制剂含量的不确定度的评估.【期刊名称】《中国现代药物应用》【年(卷),期】2011(005)012【总页数】3页(P3-5)【关键词】含量测定;微生物检定法;不确定度;评估;硫酸庆大霉素片【作者】邢以文【作者单位】215002,江苏省苏州市药品检验所【正文语种】中文本品为氨基糖苷类广谱抗生素，对多种革兰阴性菌及阳性菌都具有抑菌和杀菌作用。
对绿脓杆菌、产气杆菌、肺炎杆菌、沙门氏菌属、大肠杆菌及变形杆菌等革兰阴性菌和金葡菌等作用较强，临床上用于金葡菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、克雷白杆菌、变形杆菌和其他敏感菌所引起的败血症、呼吸道感染、胆道感染、化脓性腹膜炎、颅内感染、尿路感染及菌痢等疾患。
本品按照《中国药典》2005年版二部二剂量法［1］检验，所得结果进行不确定度分析。
测量不确定度是衡量分析测试结果的质量的尺度。
不确定度越小，分析测试结果越可靠，因此，测量不确定度是测量结果质量的定量表征。
根据ISO/IEC17025［2］和CNAS-CL 07:2011《测量不确定度的要求》［3］的要求，检测实验室应该建立并实施测量不确定度评估程序。
1 仪器、试药及菌种仪器:智能抑菌圈测定仪(CAM-ⅢB型，上海波浦电脑系统工程有限公司);电恒温水浴锅(H.S型，上海医疗器械厂);隔水式电热恒温培养箱(PYX-DHS一40X5型，国营创新医疗器械厂);高压湿热蒸汽灭菌器(LMQ.C型，山东新华医疗器械有限公司);测定抗生素效价用培养皿(直径90 mm)，牛津杯，陶瓦盖等;电子天平(AE240型，Mettler Toledo(中国)有限公司);数字显示移液器(200～1000 μl Finnpipette，芬兰移液器有限公司)。
实验三微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价一、概述由于抗生素多为结构复杂的多组分物质，异构体多，且不稳定，容易产生降解杂质，故各国药典均以微生物检定法为主要含量测定法，因为抗生素药品的医疗作用主要是它的抗菌活力，而微生物检定法正是以抗生素的抗菌活力为指标来衡量抗生素效价的一种方法，其测定原理与临床要求相一致，能直接反映抗生素医疗价值，因此一直为各国药典所采用的主要测定方法。
微生物检定法测定抗生素效价，一般可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法三类。
以琼脂扩散法应用最广泛，为目前国际上测定抗生素效价的通用方法。
琼脂扩散法，亦称管碟法。
系采用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
二、基本设备、用具和试验材料1. 基本设备(1) 抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。
该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。
(2) 超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。
(3) 抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。
2.用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16-17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。
新购的双碟应按上述要求进行检查。
检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140-160℃干热灭菌2小时后备用。
(2) 陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。
(3) 不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。
(4) 小钢管放置器：四孔，一台。
(5) 游标卡尺：精密度0.02mm。
(6) 滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。
3. 试验材料(1) 培养基I：取胨5g、牛肉浸出粉3g、磷酸氢二钾3g和蒸馏水1000ml，加热融化，混合，调节pH使其值比最终的pH值略高0.2-0.4，加入琼脂20g，加热溶化过后，调节pH值使灭菌后为7.8-8.0，在115℃灭菌30分钟。
(2) 营养琼脂培养基：取胨10g、氯化钠5g和肉浸液1000ml，混合，调节pH 使比最终的pH值略高0.2-0.4，加入琼脂15-20g，加热溶化过后，调节pH值使灭菌后为7.2-7.4，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
(3) 磷酸盐缓冲液（pH7.8）：取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加蒸馏水使成1000ml，在115℃灭菌30分钟。
(4) 试验用菌种：短小芽孢杆菌(CMCC(B)63 202).短小芽孢杆菌菌悬液的制备和保存：取短小芽孢杆菌试验用菌种斜面1支，按无菌操作要求加入灭菌水2ml，将菌苔洗下，摇匀，取出1ml接种于盛有30ml营养琼脂培养基的100ml 三角瓶中，在35-37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml将芽孢洗下，制成悬液，在65℃水浴中加热30分钟，即得，置5℃冰箱中保存，可使用6个月。
4. 双碟的制备：取直径约90mm、高16-17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基I 20ml,使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。
另取培养基适量加热融化后，放冷至50-60℃，加入菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度）,摇匀，在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。
放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm）4个，用陶瓦圆盖覆盖备用。
三、二剂量检定法取照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2：1或4：1。
在35-37℃条件下培养14-16小时后，测量各个抑菌圈的直径（或面积），照生物检定统计法中的(2.2)法进行可靠性测验及效价计算。
四、硫酸庆大霉素的效价测定：1. 标准品溶液的配制：精密称取硫酸庆大霉素标准品适量，加乙醇溶解后，用灭菌水制成每1ml中含1000单位的溶液，作为贮备液，置5℃以下的冰箱中保存，可使用7日。
将贮备液加pH7.8磷酸盐缓冲液稀释，使标准品高剂量溶液和低剂量溶液每ml中分别含硫酸庆大霉素10U和5U。
2. 供试品溶液的配制：取硫酸庆大霉素肠溶片4片，研细，用乙醇适量（硫酸庆大霉素约0.25g，用乙醇25ml），分次研磨使硫酸庆大霉素溶解，并用水稀释成每1ml中约含1000单位的溶液，摇匀，静置，精密量取上清液适量，按（1）法同法配制，使供试品高剂量溶液和低剂量溶液按标示量计算每ml中含硫酸庆大霉素分别为10U和5U。
3. 测定法：按二剂量检定法测定效价，计算出供试品中含硫酸庆大霉素相当于标示量的百分数。
附录：生物检定统计法中的（2.2）法抗生素微生物检定法是以微生物为工具，不可避免地存在着较大的生物差异性，因此，必须借助于生物统计方法来减少生物差异对检定结果的影响，使结果达到一定的精确度。
英、美、日等国家药典附录中都详细地制定了生物检定方法的实验设计和统计分析，并根据生物统计的要求规定了各个品种的误差范围。
中国药典从1985年版起增加了生物检定法的实验设计和可靠性测验及误差估计等内容，这对判断检验质量及促使检验方法的改进等方面都具有重要意义。
1.可靠性测验抗生素微生物检定法按照观察的方法和生物反应的类型属量反应，即观察每一反应本身所表现的程度，可以用量来表示。
实验设计采用供试品（T ）和已知效价的标准品（S ）对比试验的平行线原理。
由于平行线测定的计算原理是在一定剂量范围内T 和S 的对数剂量与反应或反应的特定函数呈直线关系以及在T 和S 两条直线互相平行（当T 和S 的活性组分基本相同时）的基础上，因此，可靠性测验就是运用统计方法来验证实验结果是否符合量反应的平行线设计原理，是否显著偏离了直线性和平行性，以便评价实验结果的可靠性。
对不是显著偏离平行偏离直线（在一定的概率水平下）的实验结果，认为可靠性成立，方可按有关公式计算供试品的效价和可信限。
(1)可靠性测验的统计方法抗生素微生物检定法的可靠性测验采用F 测验，即实验结果的方差分析。
方差分析为测验多组均数之间的差别是否显著。
通过统计运算求得试品间、回归、偏离平行、剂间及碟间项的方差，并以统计得的以上各项方差和误差项方差（S 2）的比值称F 值（各项F 值=)S 误差项方差（各该项方差）作为指标来观察其差别的显著性程度。
将实验结果求得的F 值，按相应各项的自由度及误差项的自由度查F 值表来判断实验结果求得的F 值是大于还是小于F 值表上()05.021f f F ⋅和()01.021f f F ⋅的F 值。
若大于()05.021f f F ⋅的F 值，则P<0.05,表示差别有显著意义。
若大于()01.021f f F ⋅的F 值，则P<0.01,表示差别有非常显著意义。
若小于()05.021f f F ⋅的F 值，则P>0.05,表示差别无显著意义。
P 称概率，即某一事件在一定条件下可能发生的机会，P 就是机会的定量表现形式，用数量的形式来反映出事情必然性的规律，它是生物统计的基础，一般在统计中评定实验结果的可靠程度以P 表示，P=0.05，即表示可靠性有95%的把握，P=0.01，即表示可靠性有99%的把握。
可靠性测验一般分为下述两个步骤：①实验结果的方差分析：从实验数据的总变异差方和中分出剂间变异和碟间变异的差方和后，即为误差项的差方和，其方差以S 2表示。
首先按剂量组将各反应值y （抑菌圈的直径）列成方阵见表1。
表1 实验结果 双碟数剂 量 组总 和 总和平方 (1)(2) (3) … （K ） Σy m [Σy m ]2 1 2 3m y 1(1) y 2(1) y 3(1)y m(1) y 1(2) y 2(2) y 3(2)y m(2) y 1(3) y 2(3) y 3(3)y m(3) … … …… y 1(k) y 2(k) y 3(k)y m(k) Σy 1 Σy 2 Σy 3Σy m [Σy 1]2 [Σy 2]2 [Σy 3]2[Σy m ]2 总 和 Σy (k)Σy (1)Σy (2)Σy (3)…Σy (k)Σy总 和 Σ[Σy m ]2总和平方 [Σy (k)]2[Σy (1)]2 [Σy (2)]2 [Σy (3)]2 …[Σy (k)]2总 和 Σ[Σy (k)]2y 2的总和 Σy 2表1中，K 为S 和T 的剂量组数，m 为各组内y 的个数（即双碟数），各组的m 应相等，n 为反应的总个数，n=m ×k 。
各项变异的差方和及自由度（f ）的计算差方和（总）=Σy 2— ny 2)(∑f (总)=n — 1式中 ny 2)(∑=校正数差方和（剂间）=my k 2)(][∑∑— 校正数f (剂间)=K —1 差方和（碟间）=ky m 2)(][∑∑— 校正数f (碟间)=m — 1差方和（误差）=差方和（总）—差方和（剂间）—差方和（碟间） f (误差)=f (总)—f (剂间)—f (碟间)=（k —1）（m —1） 方差=该项自由度该项差方和S 2=()()误差误差差方和f或S 2=)1)(1(][][][222)(2--∑+∑∑⋅-∑∑⋅-∑⋅m K Km y y m y K y Km m k②剂间变异的分析：剂间变异的显著性测验主要包括S 和T 试品间、回归、平行性及直线性等变异内容。
各项变异的差方和及自由度（f ）按表2二剂量法和表3三剂量法可靠性测验正交多项系数表计算。
表2 二剂量法可靠性测验正交多项系数表变异来源Σy (k)差 方 和自 由 度S 1 S 2T 1T 2正交多项系数（Ci ）试 品 间-1-11122)(]}[{Ci m y Ci k ∑∑⋅∑1回 归 -11-1122)(]}[{Ci m y Ci k ∑∑⋅∑1偏离平行 1-1-1122)(]}[{Ci m y Ci k ∑∑⋅∑1表中正交多项系数用Ci 表示，Σy （k ）为各剂量组反应值之和。
各项变异的差方和=22)(]}[{Ci m y Ci k ∑⋅∑⋅∑，除以该项的自由度即等于方差。
以各变异项的方差与误差项的方差（S 2）的比值作为指标，进行F 测验，以判断各项变异来源差异是否有显著意义。
