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A4:甲胎蛋白（AFP）测定(免疫荧光干式定量法) A4.1首页内容XX医院检验科操作规程文件号：XXXX第1版共4页20XX年X月X日起实施本规程每2年复审一次复审日期：20XX年XX月XX日复审人：XXX(签名)规程编写者：XXX，XXX审批者：XXX批准日期：20XX年X月X日文件分发部门和/或个人：医务科：保管者：XXX(签名)院长办公室：保管者：XXX(签名)院档案室：保管者：XXX(签名)检验科：主任：XXX(签名)检验科XX检验室：XXX(签名)A4．2检测原理甲胎蛋白检测采用的是免疫荧光定量测试技术，干化学层析方法。
即将检测缓冲液和血液样本进行混合，缓冲液中的荧光标记抗AFP抗体和血液中的AFP抗原结合形成抗原抗体复合物，当该复合物被加入到反应板上并通过毛细管作用扩散到硝化纤维基质的测试带上，被测试带上的抗AFP抗体所捕获。
因此，血液样本中的AFP越多，测试带上的复合物积聚得越多，荧光抗体的信号强度反映了被捕获的AFP数量，通过i-CHROMA Reader免疫荧光分析仪检测出血液样本中AFP 的浓度。
i- CHROMA Reader免疫荧光分析仪默认检测结果单位为ng/mL。
A4.3标本要求A4.3.1 使用人的血清样本来进行测定。
A4.3.2 使用血清样本，将血液收集于一个不加抗凝剂的试管中，待其凝固后，尽快将血清吸出，以防止其溶血的发生。
A4.3.3 在测试前样本必须处在室温环境下,并且要保证样本均质性。
冷冻样本必须被彻底解冻并恢复至室温后方可使用。
避免反复冻融。
应尽量避免溶血情况的发生，如发现样本已经发生溶血，则应重新采集样本。
A4.4试剂A4.4.1 每个试剂均购自XX公司。
1) 反应板 25T/盒2) ID芯片 1个/盒3) 检测缓冲液 25管/盒A4.4.2 试剂准备从冰箱中取出检测缓冲液后需要在室温环境中放置30分钟，使其恢复至室温后方可使用。
反应板在密封情况下可存于4～30℃的环境下，在此环境下反应板可稳定18个月（如果存放在2～8℃环境中的反应板，需要在室温环境中放置30分钟，使其恢复至室温后方可使用）。
1.检验目的：本试剂盒用于定量测定人血清和（或）血浆中的甲胎蛋白。
2.检验原理：3.性能参数：3.1线性范围：用线性参考品进行测定，在1.0ng/mL ～1500.0ng/mL 范围内。
3.2最低检测限：≤1.0 ng/mL 。
3.3准确度：测量结果的相对偏差应在±10.0%范围内。
3.4重复性:变异系数（CV ）应不大于10.0%。
3.5批间差:3个批号试剂之间的批间变异系数（CV ）应不大于15.0%。
4.样品要求：4.1检测标本：血清和血浆（肝素锂、肝素钠、EDTA 和柠檬酸钠抗凝）是推荐使用的样本类型。
尚未验证其他抗凝剂能否适用。
4.2采集及处理：在进行离心操作前需让血清样本完全凝结（凝结时间不小于1小时）。
所有的待测样本在测试前均应进行离心操作。
顶部含脂质的离心样本，需转移澄清、无脂质的部分到新的样本管中。
在测试前，确保已去除了残余的纤维蛋白和细胞类物质。
应小心处理患者样本，避免交叉污染。
在测试前，确保患者样本、校准品、质控品均已平衡至环境温度（20-25°C ）。
为避免蒸发可能带来的影响，样本和校准品应在上机后2小时内完成测试。
4.3样品储存：在室温（20-25°C ）下，样本保存时间不得超过8小时。
若在8小时内无法完成测试，应将样本在2～8°C 冷藏保存。
在2～8°C 的保存情况下，标本保存时间不得超过3天。
长期保存，应将样本在-20°C 保存。
冷冻样本在融化后必须进行充分混匀。
样本冷冻次数不得超过1次。
5.设备和试剂：5.1仪器：iFlash 3000化学发光免疫分析仪。
5.2试剂：甲胎蛋白测定试剂盒（化学发光法）；包装量：2×50人份/盒； 5.3储存要求：（1）储存：存放在2-8°C ，保持竖直向上。
（2）有效期：试剂瓶及校准品未开封存放于2-8°C：可稳定365天；试剂瓶使用后存放于2-8°C或在机存储：可稳定28天；校准品复溶后在-20°C保存：可稳定28天（仅可冻融一次）。
人甲胎蛋白（AFP）说明书人甲胎蛋白（AFP）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中甲胎蛋白（AFP）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人甲胎蛋白（AFP）水平。
用纯化的人甲胎蛋白（AFP）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入甲胎蛋白（AFP），再与HRP标记的甲胎蛋白（AFP）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的甲胎蛋白（AFP）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人甲胎蛋白（AFP）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：45μg/L0.5ml×1瓶0.5m l×1瓶2-8℃保存标准品稀释液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
宁城县中蒙医院赤峰市精神病防治院检验科CLinLab.NCXZMYY(CFSJSBFZY)甲胎蛋白（AFP）标准操作程序编号：日期：版本：第页共页1、变动程序：由操作者提出，并经科主任审核。
2、范围：测定人血清、血浆、体液中的甲胎蛋白。
3、操作程序：使用仪器：日本东曹AIA-600II型全自动化学发光免疫分析仪生产厂商名称：日本东曹株式会社注册号：国食药监械（进）字2007第2400371号3.1、测定原理:本试剂盒使用的是高亲合性抗AFP抗体，并采用一步EIA夹心法定量检测人血清和体液中的AFP含量，可用于原发性肝细胞癌、肝炎、肝硬化、怀孕后期的诊断，治疗过程中的监视以及治疗后的效果评价3.2、试剂：E-test（TOSOH）Ⅱ（AFP）免疫反应试剂3.3 操作步骤3.3.1、在试剂Cup中加入100微升缓冲液和25微升标准品或稀释后的样品溶液，在磁石磁珠振动器上搅拌，在37℃下使抗原抗体反应进行10分钟3.3.2、用洗脱液冲洗试剂Cup，除去其中游离的酶联标记抗体和样品成分（B·F分离）。
3.3.3、加入基质液后，在磁石磁珠振动器上搅拌同时用荧光检测器检测荧光物质的荧光强度，激发波长363nm，荧光吸收波长447nm，并计算出荧光物质的生成速度。
3.3.4、根据标准液检测绘制的荧光物质生成速度标准曲线，计算出样品中AFP的浓度。
3.3.5、如果检测结果超过400ng/mL时，要用样品稀释液提高稀释倍数重新稀释，并按照（1-4）步骤检测。
3.4、结果判定3.4.1、应用E-test（TOSOH）Ⅱ（AFP）标准品试剂盒绘制标准曲线，从曲线中计算出样品中AFP的浓度。
3.4.2、分析225例健康者血清中AFP浓度的检测结果，所得的参考标准范围是0.9-7.6ng/ml。
其中，参考标准范围因为很容易受其他各种因素影响，所以希望各单位自行设定。
4、注意事项：1. 本品是一种体外诊断用试剂，禁止以其他目的使用。
1．目的规定AFP检测方法、程序、和相应操作。
2、范围适用于本中心的AFP检测3、职责3．1 实验室操作人员严格按实验操作要求执行；3．2 实验人员填写原始记录及有关的质量记录；3．3 授权签字人签发检验报告。
4、工作程序4．1 样品采集、送检和保存：抽取静脉血，分离血清或血浆，2-8℃送检，-20℃低温保存。
4．2 设备和材料4．2．1 酶标仪、洗板机、恒温孵箱4．2．2 精确移液器：单通道可调5ul—50ul、50ul—250ul，专用试剂槽，超纯净水4．3 甲胎蛋白定量检测试剂盒必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批批检合格、在有效期内的试剂，使用省CDC、国家CDC推荐的试剂。
使用前将试剂盒从冰箱中取出，室温放置30min。
4．3．1 洗涤液配制用蒸馏水按试剂盒使用说明书稀释浓缩洗液，注明配制时间，配制好的洗板液封闭保存在2-8℃，可使用2周。
5、检测流程5．1 设定洗板程序：在全自动洗板机上编程，设定AFP检测洗板程序。
设定参数：每孔加洗液350ul，洗液在孔内停留20s , 然后将洗液吸干，重复5次。
5．2 实验操作（以试剂盒说明书为准）5．2．1 从试剂盒中取出酶联板，取出一定量的包被孔编号，设1个空白对照孔，其余孔用微量移液器依次加入50ul标准品及待测样品，随即加入酶结合物50ul，轻轻振荡混匀。
5．2．2 封板，置37℃孵育30分钟。
5．2．3 手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置20秒，甩干，重复5次后拍干。
洗板机洗板：选择洗涤5次程序洗板后拍干。
5．2．4 每孔加底物50ul，立即加入显色剂50ul，充分混匀，置37℃避光反应5分钟。
5．2．5 每孔加终止液50ul，终止反应。
5．3 用酶标仪读数，数值取波长450nm，先用空白孔校零，然后在终止反应后的10分钟内读取各孔OD值。
6．检测结果6．1 打开酶标仪，进行自检，确认酶标仪处在良好运行状态；6．2 对微孔位置确认，对酶标板编号并登记记录；6．3 调出读板程序，读板；6．4 读板并打印结果。
甲胎蛋白（AFP）检测作业指导书1.检验目的AFP来源于卵黄囊、未分化肝细胞和胎儿胃肠道。
70－95%的原发性肝癌患者的AFP升高，越是晚期，AFP含量越高。
但尚未发现AFP含量与肿瘤大小、恶性程度等有关系。
AFP含量显著升高一般提示原发性肝细胞癌。
在转移性肝癌中，AFP一般低于350-400 IU/ml。
AFP中度升高也常见于酒精性肝硬化、急性肝炎以及HBsAg携带者。
不推荐将AFP用于普通人群的癌症筛查。
孕妇血清或羊水AFP升高提示胎儿脊柱裂,无脑症,食管atresia或多胎,AFP降低(结合孕妇年龄)提示未出生的婴儿有Down's综合征的危险性2.检验原理：采用双抗体夹心法原理，整个过程18分钟完成。
·第1步：10μl标本、生物素化的抗AFP单克隆抗体和钌（Ru）标记的抗AFP单克隆抗体混匀，形成夹心复合物。
·第2步：加入链霉亲和素包被的微粒，让上述形成的复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上。
·第3步：反应混和液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。
·检测结果由机器自动从标准曲线上查出。
此曲线由仪器通过2点定标校正，3.性能参数：3.1 线性范围：线性检测结果见AFP方法学验证记录。
3.2精密度:批内n=20,批间n=20。
3.3准确度: 检测结果见临检中心/江苏省室间质评结果回报记录。
3.4 可报告范围: 0.605-60500 ng/ml，最大稀释倍数为50倍。
3.5 测量区间：血清/血浆: 0.605-1210ng/ml。
高于检测范围的标本可用通用稀释液稀释。
稀释后的标本AFP含量必须高于20IU/ml(24ng/ml)。
如用手工稀释，结果应乘上稀释倍数。
如果是机器自动稀释，机器会自动计算结果。
3.6 灵敏度：0.605ng/ml3.7特异性：无4. 样本要求4.1血清：按标准常规方法采集。
甲胎蛋白测定标准操作规程1 检验申请单独检验项目申请：甲胎蛋白测定（缩写AFP）；组合项目申请：肿瘤标志物检查。
临床医生根据需要提出检验申请。
2 标本采集与处理2.1标本采集2.1.1常规静脉采血约2ml，不抗凝，置普通试管中。
或采用含分离胶的真空采血管。
也可采集血浆标本，用肝或EDTA抗凝。
2.1.2检验申请单和血标本试管标上统一且唯一的标识符。
2.1.3急诊标本采集后，在检验申请单上填写标本采集时间。
2.1.4标本采集后与检验申请单一起及时运送至检验科。
专人负责标本的接收并记录标本的状态，对不合格标本予以拒收。
2.1.5下列标本为不合格标本2.1.5.1标本量不足：少于0.3ml的全血标本，或少于0.1ml的血清或血浆。
2.1.5.2 对反应吸光度有干扰的标本，包括严重溶血、严重浑浊的标本。
2.1.5.3无法确认标本与申请单对应关系的。
2.1.5.4其他如标识涂改、标本试管破裂等。
2.2标本保存2.2.1接收标本后在60min内将标本离心分离出血清(浆), 避免溶血。
离心必须达到4000rpm×15min，离心后的血清中不能含有颗粒物或微量纤维蛋白。
2.2.2标本保存时间：室温（15～25℃）下可稳定8h，普通冰箱中（2～8℃）稳定2d，在-20℃最多可保存4周。
避免反复冻融。
2.2.3已完成测试的标本保持完整的识别号，置4～8℃冰箱内保存7d。
2.3标本采集的注意事项2.3.1采血前使受检者保持平静、松弛、避免剧烈活动。
3 方法原理甲胎蛋白测定采用双位点加心化学发光免疫分析法，其检测原理来如下：第一步：将标本与包被着AFP单克隆抗体的超顺磁性磁珠和另外一种小鼠AFP 单克隆抗体-碱性磷酸酶标记物添加到反应管中，经过孵化，标本中的AFP和包被在磁珠上的AFP抗体结合，同时AFP抗体-碱性磷酸酶标记物与样本中同一AFP 上不同的抗原结合位点结合。
在反应管内孵化完成后，结合在固相上的物质将之与一个磁场内被吸住，洗去未结合的物质。
肿瘤免疫学检查操作规程
甲胎蛋白（AFP）测定
【方法】
ELISA法。
【试剂】
本试验有商品试剂盒。
【操作】
按试剂说明书进行。
【结果判断】
1．定性：显色为阳性，无色为阴性；
2．定量：酶标仪测定，测492nm波长吸光度，查标准曲线（吸光度为纵坐标，AFP含量为横坐标），得出标本中AFP含量，乘以稀释倍数后发出定量报告。
【附注】
操作中有关要求可参考乙肝两对半试验。
定量的试剂目前以进口的ELISA法AFP测定试剂盒为佳。
此外，也可用放射免疫（双抗体）法对AFP进行定量测定，操作按市售放免
试剂盒说明书进行。
自身抗体──类风湿因子（RF）测定
类风湿性关节炎和红斑狼疮患者的血清中常存在高滴度的RF，国内普通使用胶乳凝集试验进行测定。
此外，也可用双抗原夹心ELISA法测定，其测定的操作程序按市售试剂盒进行。
【方法】
胶乳凝集试验。
【试剂】
市售试剂盒。
【操作】
按说明书进行。
【结果判断】
按说明书要求。
【附注】
1．每次试验必须设阴、阳对照；
2．RF胶乳试剂应于4~10℃保存，但不应冰冻贮藏。
使用前要摇匀，并使试剂温度与室温平衡；
3．本试验测得的RF主要是IgM型RF。
关于测定RF的IgG和IgA型的临床意义目前尚无明确定论。
