双光子激光共聚焦显微镜

设备名称双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜2.数量3.设备用途说明4.工作条件电源220V+10%, 50HZ室温：20'25 “C貝他：防尘，除湿，抗鳶动工作台：牢固•稳定，防夜5.规格、技术要求及参数5.1双光子飞秒激光器局部5JJ Ax 激光：458nui > 488nm. 514nm» 25mW5j ・ 2 HeNe 激光：543nm, ImW5j - 3 HeNe 激光：633nm, 5mW5j 4 405 激光：405nm, 30mW5. L5 •红外飞秒脉冲激光器，波长范围：680・1080nm,包含负色散补偿功能5J・6根据标木的情况利用飞秒激光器的双光子可观看800微米深度样品数据。

5丄7 去稳定的可见光A0TF,同时控制激光各波长的激光强度，8通道，切换时间V5微秒。

A0TF对激光强度的控制连续可调(0-100%)，步进0・1%) °5J・8毎支激光器通过独立的光纤连接到扫描器局部，光纤即插即用，无需校准。

5J -9光纤末端具有可对激光进行聚焦的集光镜，电动调节。

5J J 0具有8个激光光路接口和红外飞秒激光器直接耦合端口。

5 • 2扫描器521 扫描器(含检测器〉与显微镜直接连接于显微镜端口(非光纤连接人一体化设ih 一体化像差及色差校正。

5・2・2壳整个光路的光学设计适用波长范围为360nm-1000nm全光谱范围。

523 每个荧光检测器具有独立的10级可调数码增益。

525去光栅分光方式，并且具有减少信号损失的循环光路设计。

526各荧光检测通道均不采用发射光滤光片，荧光信号经光栅分光后可直接到达检527•共聚焦成像通道：具备34个荧光检测通道，可以同时采集10个荧光通道和1 个透射光通道图像，10种荧光染料可同时别离成像，1个透射光通道〔明场DIC效果〉5・2・8协扫描器〔含检测器〕必须内置高灵敏度GaAsPspectial检测器，而且该仪器能够整合FCS技术，使影像品B 〔S/N ratio〕信噪比有2X提升，具有检测微弱的单分子荧光的功能・529 一个可用于明场和DIC观察的透射光检测通道。

各荧光检测方法简介（流式、荧光显微镜、共聚焦、全内反射与双光很多细胞实验都要检测荧光，为方便大家选择合适的方法，在此简单说一下各种荧光检测方法的特点。

不足的地方，欢迎大家补充：1、流式，优点是速度快，非常适合做大数量统计，且样品只被检测一次，完全不用担心荧光淬灭的问题。

缺点是只能检测荧光的有无、强度大小，无法提供空间定位信息，无法做荧光定位变化的实验；由于样品只被检测一次，因此无法对同一个样品进行连续观察。

例如，做膜蛋白定位时会得到这么一个结果——用流式可以检测出信号，但是用显微镜却看不到东西，排除仪器和滤光片选择问题，很可能是核的自发荧光或非特异标记造成流式的假阳性结果。

2、荧光显微镜，刚好与流式互补，可很好地进行空间观察，判断目标蛋白的定位，但是不适合做大流量检测，估计没人能经得起时间的考验。

有不同倍率的物镜选择，可以使用高倍物镜看精细结构，或用小倍率物镜做少量统计。

与之搭配的CCD和软件，是系统能否发挥性能的关键。

尤其是CCD，从那么多商品里选一款合适的不容易，需要了解很多知识否则只能听别人忽悠。

3、共聚焦，荧光显微镜的升级产品，具有很好的光学层切效果，能得到很好三维定位信息。

但是，如果使用共聚焦的目的仅仅是为你的样品拍一张靓照，取得一张好看的图片，就让人觉得可惜了。

共聚焦基本都是全自动系统，可随意定义照明区域、选择多个荧光通路和设定定时取图，所以，做Time-laps、FRAP和FRET有其独到的优势。

另外，4Pi和 STED又是其中的极品，具有超高的空间分辨率，只是使用不方便，未必适合做生物实验。

4、全内反射，荧光显微镜的另一种升级产品，属于近场光学范畴，只适合且最适合做膜研究，无法看到胞内信息。

也是用CCD成像，但是对CCD的要求更高——个人甚至觉得对CCD的要求是没有上限的。

5、双光子，另一种共聚焦，因使用长波激发荧光，故能做深层检测（突破共聚焦的100微米极限），最典型的应用是观察活体脑组织。

激光共聚焦显微镜原理
激光共聚焦显微镜（Laser Confocal Microscope）是一种光学显微技术，它可以利用激光光束在工作距离内产生一个比空间分辨率更高的光斑，利用这种技术可以获得高空间分辨率和高清晰度的图像。

激光共聚焦显微镜是一种高精度的光学显微镜，它利用激光束来聚焦，从而可以观察到极微小的生物样品或者其它小物体，比如细胞，细菌和病毒等。

激光共聚焦显微镜的工作原理是：当激光束聚焦到一个小物体的表面时，激光束会产生一个强度较高的热斑，这个热斑可以用来检测目标物体的表面特征，比如细胞或病毒的大小、形状、结构等。

当激光束通过物体表面时，一部分激光束会被物体反射，而另一部分激光束会被物体吸收。

这样，就可以得到物体表面的一维和二维图像，从而获得物体表面各种特征的信息。

激光共聚焦显微镜具有空间分辨率高、操作简单、检测结果可靠等优点，可以用来检测病毒的大小、形状、结构等，也可以用来检测细胞的结构、细胞内分子的活性变化等。

目前，激光共聚焦显微镜已经广泛应用于生物学、医学、材料科学等领域，为科学研究带来了许多便利。

激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。

它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。

本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。

一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。

在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。

与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。

换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。

对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。

二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。

1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。

在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。

荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。

2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。

双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。

在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。

激光共聚焦显微镜原理和应用共聚焦显微镜的发展历史1955年，Marvin Minsky利用共焦原理搭建了一台共焦显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。

1957年，Marvin Minsky申请了共聚焦显微镜的专利。

1970年，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世。

1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到非常清晰的图像。

1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜。

共聚焦显微镜最大的优点就是可以只检测一个聚焦平面的信号。

样品聚焦平面和检测器（光电倍增管）之前均有一个针孔，针孔的设置可以有效地滤除非聚焦平面的信号，增加显微镜的信噪比。

激光扫描显微镜能够逐点和诸行对样品进行扫描，最终根据象素信息形成一个高对比度和高分辨率的图像。

通过逐层对样品扫描并把每一层的图像组合成一个整体，激光扫描显微镜能够对样品进行三维分析，非常适合于超厚样品的检测。

传统显微镜是一次性照明整个视野中的样品，因此可以用眼睛直接观察或者用CCD获取图像，没有时间延迟；而共聚焦显微镜是逐点成像，无法用眼睛成像，也无法用CCD获取图像，只能用探测器收集每个象素点的信号，再通过软件重构图象，有一定的时间延迟。

How a Confocal Image is FormedCondenser Lens Pinhole 1Pinhole 2Objective LensSpecimen DetectorWide Microscopy and Confocal MicoscopyWide Field Confocal Field Wide Field Confocal FieldConfocal Principle630 nm BandPass FilterTransmitted LightWhite Light Source620 -640 nm LightTransmitted LightLight Source520 nm Long Pass Filter>520 nm LightTransmitted Light Light Source575 nm Short Pass Filter<575 nm Light Standard Short Pass FiltersOptical FiltersDichroic Filter/Mirror at 45 degReflected light Transmitted Light Light Source 510 LP dichroic Mirror生命科学院的激光共聚焦显微镜Beam Path of Zeiss CLSM 510 METAThe unique scanning module is thecore of the LSM 510 META. It containsmotorized collimators, scanning mirrors,individually adjustable and positionablepinholes, and highly sensitive detectorsincluding the META detector. All thesecomponents are arranged to ensureoptimum specimen illumination andefficient collection of reflected oremitted light. A highly efficient opticalgrating provides an innovative way ofseparating the fluorescence emissions inthe META detector. The gratingprojects the entire fluorescencespectrum onto the 32 channels of theMETA detector. Thus, the spectralsignature is acquired for each pixel ofthe scanned image and subsequently canbe used for the digital separation intocomponent dyes.Focus ConeSpecimen X/Y ImageXYTo get an 2 D image, the excitation spot has to be moved over the specimen3 D information is acquired by moving the excitation focus not only in XY direction but also in Z direction. The result is a 3 D data stack consisting of number of XY images representing different optical sections from the specimenX/Y/Z StackZ-Driveoptical slice共聚焦显微镜的三维信息采集zxy# z sections =#imagesA confocal data set is similar to a book. A book has many pages, and Each page shows information only available if you move down to that page and ready it. Reading a page in a book, is just like scanning with a confocal microscope –you remove all of the other pages!z xy zyy The advantage of confocal microscopy is that you can visualize frames from a 3D object even in planes that you don’t image directly. This is called “slicing” an object and is an important component of confocal imaging.三维数据重构建荧光共振能量转移荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子标尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。

1.设备名称双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜2.数量1套3.设备用途说明4.工作条件电源220V±10%，50HZ室温：20~25℃其他：防尘，除湿，抗震动工作台：牢固，稳定，防震5.规格、技术要求及参数5.1 双光子飞秒激光器部分5.1.1Ar激光：458nm、488nm、514nm，25mW5.1.2HeNe激光：543nm，1mW5.1.3HeNe激光：633nm，5mW5.1.4405激光：405nm，30mW5.1.5*红外飞秒脉冲激光器，波长范围:680-1080nm, 包含负色散补偿功能5.1.6根据标本的情况利用飞秒激光器的双光子可观看800微米深度样品数据。

5.1.7*稳定的可见光AOTF，同时控制激光各波长的激光强度，8通道，切换时间<5微秒。

AOTF对激光强度的控制连续可调（0~100%），步进0.1%）。

5.1.8每支激光器通过独立的光纤连接到扫描器部分，光纤即插即用，无需校准。

5.1.9光纤末端具有可对激光进行聚焦的集光镜，电动调节。

5.1.10具有8个激光光路接口和红外飞秒激光器直接耦合端口。

5.2扫描器15.2.1扫描器（含检测器）与显微镜直接连接于显微镜端口（非光纤连接），一体化设计，一体化像差及色差校正。

5.2.2*整个光路的光学设计适用波长范围为360nm～1000nm全光谱范围。

5.2.3每个荧光检测器具有独立的10级可调数码增益。

5.2.4有可调大小的针孔，调节范围为连续调节，免维护。

5.2.5*光栅分光方式，并且具有减少信号损失的循环光路设计。

5.2.6各荧光检测通道均不采用发射光滤光片，荧光信号经光栅分光后可直接到达检测器。

5.2.7*共聚焦成像通道：具备34个荧光检测通道，可以同时采集10个荧光通道和1个透射光通道图像，10种荧光染料可同时分离成像，1个透射光通道（明场DIC效果）5.2.8*扫描器（含检测器）必须内置高灵敏度GaAsP spectral 检测器，而且该仪器能够整合FCS技术，使影像品質(S/N ratio)信噪比有2X提升，具有检测微弱的单分子荧光的功能。

激光共聚焦显微镜方法步骤
激光共聚焦显微镜（简称CLSM）是一种高分辨率的显微镜技术，常用于生物学、医学和材料科学领域。

下面我将从多个角度全面介
绍激光共聚焦显微镜的方法步骤。

1. 样品准备：
在进行CLSM观察之前，首先需要准备样品。

样品的准备包
括固定、染色和清洁等步骤。

固定样品可以使用化学试剂或生理盐水，染色则可以使用荧光染料或荧光蛋白等方法，以增强样品的对
比度和可见性。

2. 仪器设置：
在进行CLSM观察之前，需要对显微镜进行仪器设置。

这包
括选择合适的激光波长、光学滤波器和放大倍数等参数，以确保获
得清晰的荧光信号和高分辨率的图像。

3. 成像扫描：
接下来是进行成像扫描。

CLSM使用激光束来扫描样品，并
收集样品发出的荧光信号。

通过逐点扫描和逐层堆叠，可以获得样
品的三维图像。

4. 数据分析：
获得图像后，可以进行数据分析。

这包括图像处理和三维重
建等步骤，以获取更多关于样品结构和组织的信息。

5. 结果解释：
最后是结果的解释。

根据获得的图像和数据，可以对样品的
结构和功能进行解释和分析，从而得出科学研究或临床诊断的结论。

总的来说，激光共聚焦显微镜的方法步骤包括样品准备、仪器
设置、成像扫描、数据分析和结果解释。

这些步骤需要精确操作和
细致处理，以获得准确、可靠的显微镜图像和数据。