LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数

Zeiss LSM 780 激光扫描共聚焦显微镜光路设置和不同扫描模式的使用作者：李华丽来源：《科技创新与应用》2015年第27期摘要：对于使用激光扫描共聚焦显微镜的研究者来说，实验设计、样品准备、仪器操作和后期图片处理是一个实验至关重要的四步，前两步是任何一个研究者都必须具备的能力，否则无从谈起上机实验，后期图片处理无非就是修饰润色使图片从视觉上更美观，而对大多数从事生物学医学领域的研究者来说，仪器的操作可能是最关键的一步，而仪器操作中光路的设置和不同扫描模式的选择可能是最难掌握和最难学习的模块，因为这部分可能涉及一些物理光谱学的知识。

文章就以自己实验室Zeiss LSM 780激光扫描共聚焦显微镜为例，简要介绍其三种光路设置和五种不同扫描模式如何选择使用，希望对使用者有所帮助。

关键词：激光扫描共聚焦显微镜；光路设置；扫描模式引言随着现代科学技术的飞速发展，各种荧光蛋白、荧光染料和精密光学元件不断出现[1-5]，激光扫描共聚焦显微镜技术得到了极大的发展，各种公司，各种型号的共聚焦系统不间断问世或完善，广泛应用在细胞生物学医学领域[6-8]。

广泛的应用使得这一设计精密又操作复杂的仪器必须让有需要的研究者方便学习和掌握。

就以蔡司公司为例，科学技术的发展和适应市场的需要，不同型号的共聚焦系统逐步上市和使用，LSM 510、510 Meta、700、710、780等在硬件技术提高的同时，操作软件也在一步步简化。

文章以华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室的一台超高灵敏度检测Zeiss LSM 780系统为例，介绍其光路设置和不同扫描模式的选择，因为它是目前蔡司公司推出的上述普通激光扫描共聚焦显微镜中型号最高的一款，它的光路设置和扫描模式的配置将集上述所有型号系统的内置设置于一身，希望能给实验者提供较全面的指导。

1 Zeiss LSM 780 激光扫描共聚焦显微镜三种光路设置（1）最“傻瓜式”一键操作：Zeiss LSM 780使用Zen 2011软件，软件操作界面有一个Resue按钮。

附件3：激光共聚焦显微镜技术需求一、产品技术总体要求：通过光栅控制的自动聚焦装置，实现微观三维形貌图像的获取并具备测量显微镜功能.实现对样品的三维形貌观察及表面测量与分析，具备专用粗糙度分析模块。

并通过硬件解决照片拍摄时产生的噪声，保证测量数值的准确精度与重复精度，符合国际计量追溯体系。

二、技术参数要求1分辨率：*1.1二维分辨率要求达到0.12微米。

1.2垂直分辨率0.01微米。

2光源要求：*2.1激光部分：采用405nm短波长半导体激光器，安全等级CLASS 2（输出功率≤1mW），寿命≥10000小时。

2.2可见光部分：长寿命LED光源，使用寿命≥30000小时。

2.3采用双光路共焦系统。

3观察方式及范围3.1不少于激光观察、可见光观察、激光+DIC观察、可见光+DIC观察。

3.2垂直单次扫描范围不小于10mm 。

*3.3可观察试样高度0—100mm。

4获取图像种类：不少于激光二维与三维图像、彩色二维与三维图像、等高线二维与三维图像。

5载物台要求：5.1载物台驱动方式：超声波电动驱动。

5.2载物台控制方式：软件或控制手柄控制载物台XY方向移动。

5.3载物台步进精度≤0.5微米。

5.4载物台行程范围：X向不小于100mm，Y向不小于100mm。

6物镜要求：6.1 提供不少于5X、10X、20X、50X、100X及100X长工作距离物镜共计6颗。

*6.2其中20X、50X、100X均为405纳米激光专用平场复消色差（APO）物镜。

数值孔径（N.A.）分别不小于0.60、0.95、0.95。

6.3 100X长工作距离物镜工作距离（W.D.）不小于3.4mm。

7物镜转换器*7.1 6孔或6孔以上电动编码型物镜转换器。

7.2具有自动避让功能。

8放大倍数110倍——17000倍。

9显微镜有硬件处理噪声的能力；软件具有处理多种形貌样品噪声功能。

10测量精度要求：10.1 XY方向测量准确度要求：测量值的±2%以内。

共聚焦荧光显微镜技术参数1技术规格（配置）1. 激光照射部分(1) 系统激光器应覆盖可见光，三个激光器单独分立：红光HeNe激光器633nm；绿光HeNe激光器543nm；多线蓝光Ar激光器458/488/514nm。

(2) 具有独立电动机械光闸，以降低声光调制器的漏光现象。

(3) 激光器强度由各独立AOM控制，调节由计算机的激光共聚焦扫描软件系统控制，与整个系统偶合程度高，电噪声小，安全。

2. 扫描检测部分(1) 激光扫描系统通过照相端口与显微镜相连，不影响传统荧光观察效果，并且使扫描系统在正置与倒置显微镜通用。

与所接显微镜一体化设计，一体化像差及色差校正，以保证高质量，高分辨率成像。

软件对硬件应有效控制，使系统有优异的稳定性及可维护性。

光纤藕合表面应有专用防反射涂层，以提高激光传输效率(2) 检测器：①传统荧光检测器：三个荧光扫描检测器+一个透射光DIC（明场/相差/微分干涉）扫描检测器②专用光谱检测器：32个通道(3) 光谱/荧光检测系统：①光谱检测通道与传统荧光检测通道分别工作，不相互影响②采用多阳极PMT灵敏度矫正技术，可以对每个光谱检测通道的灵敏度误差以及波长透射属性进行矫正，使测量误差和偏差降至最低③光谱检测通道可自由选择光谱的波长范围、光谱分辨率及当前工作的通道数，通过一次扫描即可获取完整的最大32个通道的光谱图像，能精确地对光谱进行分析。

可以任意指定软件只显示选定的波段，相当于拥有了一个可编程的荧光阻挡滤光片④光谱检测器上具有可移动的激光遮光片，可以屏蔽任意波长的激光，这样即增加了激光的应用种类，又提高了PMT的利用率⑤光谱探测器可同时拍摄透射和共聚焦图像，为定位荧光标记，提供手段⑥三个传统荧光通道和一个透射光DIC通道可同时进行快速扫描⑦多个传统荧光通道的图像可即时叠加、荧光图像与透射光DIC图像即时叠加⑧使用者可自行更换传统荧光检测系统中所有的滤色镜，这样可以在使用新的探针和染料不会存在兼容性问题(4) 光谱扫描系统：①高速32通道光谱分析和扫描，可获得透射光谱图像②光谱分辨率：2.5nm、5nm、10nm（用衍射光栅方式保证精度）③光谱扫描范围：400-750nm④光谱扫描步进：0.2nm⑤使用光栅线性拆分光谱，保证光谱精度⑥使用DEES 衍射效率增强技术，提高光栅衍射效率⑦使用DISP 双积分信号处理技术，以提高曝光精度和光谱数据精度，从而提高图像的信噪比⑧光谱数据来源：用户指定/用户自建/厂家预设(5) 扫描速度：①标准模式下扫描速度：≥1.68us/pixel（512×512 pixels）②光谱扫描速度：≥2.4ms/pixel (512×512pixels 32通道同步记录)③扫描速度可调节(6) 共聚焦针孔：可变，电动切换(7) 扫描分辨率及灰度级：①分辨率：≥2048×2048 pixels②灰度级：≥12bit(8) 扫描方式：X-Y-Z-t-λ任意组合，可实现点扫描及任意区域扫描、光谱波长扫描等①点扫描获取样品中一指定点的荧光强度随时间变化的点扫描图像②平面扫描X-Y横切面、X-Z纵切面、X-Y-t，任意方向旋转，任意角度扫描，步进1°③ X-Y-Z, X-Y-Z-t扫描任意方向，任意角度④局部放大扫描1X---≥1000X，步进1X⑤光谱模式下多通道同时扫描，可进行：X-Y-λ、X-Y-Z-λ、X-Y-t-λ、X-Y-Z-t-λ扫描：分别获取横切面XY平面或纵切面XZ平面虽光谱λ变化的系列图像，并支持任意角度旋转扫描(9) 扫描旋转、光学放大（变倍）：①旋转扫描：任意角度自由旋转（旋转步进：1度），旋转扫描的同时可做DIC扫描②光学放大扫描：1X---≥1000X，连续可调，调节步进1X③共聚焦扫描视野：≥18mm(10) 可即时或延时进行扫描，扫描时间无限制，扫描时可结合ROI(region of interesting，感兴趣区域)，实现样品中多点位置的荧光强度变化的图象、曲线和数值的实时（real time）显示；时间扫描时可单通道或多通道同时进行,并可实现可变延迟(11) 光谱扫描具有极佳精度，可使在充分保证荧光信号通量（特别是一些弱荧光信号）的情况下，消除串色（混色）问题；同时也有利于对荧光样品的定量检测；在遇到发射光谱相近的探针同时存在的情况，要保证在实际操作中可以分开相差5nm的相近光谱(12) 可对光谱图像进行动态拍摄，进行光谱型FRET试验的观察，并同步生成光谱曲线，即时监视光谱变化(13) 在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无须很复杂地对仪器参数重新设置；避免频繁重新设置扫描参数，减少样品不必要的激光照射时间，减少荧光的无谓淬灭是荧光定量检测的根本保证(14) 有记忆功能，使仪器可在不同时间对样品进行同一仪器测试设置的扫描，保证样品间可靠的定量比较；可智能化取像，以便在不了解染料特性是自动取像(15) 有专用的图象数据库：有利众多图象的浏览这种数据库不但满足对图象的浏览，而且利用上述“记忆”功能，使仪器可在不同时间对样品进行同一仪器测试设置的扫描，保证样品间可靠的定量比较，在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无须很复杂地对仪器参数重新设置：避免频繁重新设置扫描参数，减少样品不必要的激光照射时间，减少荧光的无谓淬灭(16) 系统要求采用模块化设计：①便于整个系统的扩展和升级换代②正置、倒置显微镜可安装同一套共聚焦系统③用户可自行升级激光器、滤色镜、检测器系统④用户可自行升级计算机系统⑤无需任何改装即可装TIRF系统3. 全内反射系统(1) 与共焦系统共用同一台电动倒置显微镜。

设备名称双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜2.数量3.设备用途说明4.工作条件电源220V+10%, 50HZ室温：20'25 “C貝他：防尘，除湿，抗鳶动工作台：牢固•稳定，防夜5.规格、技术要求及参数5.1双光子飞秒激光器局部5JJ Ax 激光：458nui > 488nm. 514nm» 25mW5j ・ 2 HeNe 激光：543nm, ImW5j - 3 HeNe 激光：633nm, 5mW5j 4 405 激光：405nm, 30mW5. L5 •红外飞秒脉冲激光器，波长范围：680・1080nm,包含负色散补偿功能5J・6根据标木的情况利用飞秒激光器的双光子可观看800微米深度样品数据。

5丄7 去稳定的可见光A0TF,同时控制激光各波长的激光强度，8通道，切换时间V5微秒。

A0TF对激光强度的控制连续可调(0-100%)，步进0・1%) °5J・8毎支激光器通过独立的光纤连接到扫描器局部，光纤即插即用，无需校准。

5J -9光纤末端具有可对激光进行聚焦的集光镜，电动调节。

5J J 0具有8个激光光路接口和红外飞秒激光器直接耦合端口。

5 • 2扫描器521 扫描器(含检测器〉与显微镜直接连接于显微镜端口(非光纤连接人一体化设ih 一体化像差及色差校正。

5・2・2壳整个光路的光学设计适用波长范围为360nm-1000nm全光谱范围。

523 每个荧光检测器具有独立的10级可调数码增益。

525去光栅分光方式，并且具有减少信号损失的循环光路设计。

526各荧光检测通道均不采用发射光滤光片，荧光信号经光栅分光后可直接到达检527•共聚焦成像通道：具备34个荧光检测通道，可以同时采集10个荧光通道和1 个透射光通道图像，10种荧光染料可同时别离成像，1个透射光通道〔明场DIC效果〉5・2・8协扫描器〔含检测器〕必须内置高灵敏度GaAsPspectial检测器，而且该仪器能够整合FCS技术，使影像品B 〔S/N ratio〕信噪比有2X提升，具有检测微弱的单分子荧光的功能・529 一个可用于明场和DIC观察的透射光检测通道。

共聚焦显微镜操作入门指南(仅供内部使用)文档作者：李宇(liyu@) 日期：2012-12-04文档校对：李宇日期：2012-12-04卡尔蔡司中国版权所有不得复制目录1开机 (1)1 .1接通总电源 (1)1 .2打开激光器 (1)1 .3打开控制器、主控电脑 (1)2使用激光共聚焦扫描软件Zen 2010 (2)2 .1打开软件 (2)2 .2切换到明场观察模式（目镜筒） (2)2 .3放入样品并在明场模式下找到焦平面 (3)2 .4切换到共聚焦扫描模式 (6)2 .5设置激光扫描参数，找到样品最亮的焦平面位置 (6)2 .6设置Z-stack扫描上下限 (8)2 .7开始扫描 (10)2 .8分析扫描结果，进行三维观测 (11)3关机 (15)4附：目镜中，使用明场、暗场和偏光模式观察样品 (16)4 .1明场模式 (16)4 .2暗场模式 (17)4 .3偏光模式 (17)5附：使用相机（CCD）拍摄明场、暗场和偏光图 (18)5 .1拍摄明场图 (18)5 .2拍摄暗场图 (19)5 .3拍摄偏光图 (19)1 开机1 .1接通总电源图 1 从左至右依次为：墙体总电源、稳压器电源、激光器和电脑电源1 .2打开激光器图 2 转动激光器钥匙，打开激光器，LED指示灯亮1 .3打开控制器、主控电脑图 3 依次打开左图显微镜主机控制器电源、右图电脑主机电源提示：当仅使用CCD拍图，或者长时间不用机器时，建议关闭激光器，以延长其寿命。

2 使用激光共聚焦扫描软件Zen 20102 .1打开软件双击图标，然后点击“Start System ”进入软件。

2 .2切换到明场观察模式（目镜筒）2 .2.1 在共聚焦软件中切换为明场观察模式：点击“Locate ”标签，选择“Online ”，点击“BF ”（Bright Field 的缩写）。

此时系统打开卤素灯，并将明场光学模块转入光路。

图 4 切换为明场观察模式提示：如果出现硬件通讯问题，软件左下角会弹出信息对话框，此时一般的解决方法是：1）重启Zen 软件；2）如果仍无效，关闭整个系统，过5分钟后再重启系统。

Zeiss LSM 780 激光扫描共聚焦显微镜光路设置和不同扫描模式的使用对于使用激光扫描共聚焦显微镜的研究者来说，实验设计、样品准备、仪器操作和后期图片处理是一个实验至关重要的四步，前两步是任何一个研究者都必须具备的能力，否则无从谈起上机实验，后期图片处理无非就是修饰润色使图片从视觉上更美观，而对大多数从事生物学医学领域的研究者来说，仪器的操作可能是最关键的一步，而仪器操作中光路的设置和不同扫描模式的选择可能是最难掌握和最难学习的模块，因为这部分可能涉及一些物理光谱学的知识。

文章就以自己实验室Zeiss LSM 780激光扫描共聚焦显微镜为例，简要介绍其三种光路设置和五种不同扫描模式如何选择使用，希望对使用者有所帮助。

标签：激光扫描共聚焦显微镜；光路设置；扫描模式引言随着现代科学技术的飞速发展，各种荧光蛋白、荧光染料和精密光学元件不断出现[1-5]，激光扫描共聚焦显微镜技术得到了极大的发展，各种公司，各种型号的共聚焦系统不间断问世或完善，广泛应用在细胞生物学医学领域[6-8]。

广泛的应用使得这一设计精密又操作复杂的仪器必须让有需要的研究者方便学习和掌握。

就以蔡司公司为例，科学技术的发展和适应市场的需要，不同型号的共聚焦系统逐步上市和使用，LSM 510、510 Meta、700、710、780等在硬件技术提高的同时，操作软件也在一步步简化。

文章以华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室的一台超高灵敏度检测Zeiss LSM 780系统为例，介绍其光路设置和不同扫描模式的选择，因为它是目前蔡司公司推出的上述普通激光扫描共聚焦显微镜中型号最高的一款，它的光路设置和扫描模式的配置将集上述所有型号系统的内置设置于一身，希望能给实验者提供较全面的指导。

1 Zeiss LSM 780 激光扫描共聚焦显微镜三种光路设置（1）最“傻瓜式”一键操作：Zeiss LSM 780使用Zen 2011软件，软件操作界面有一个Resue按钮。

激光共聚焦扫描显微镜技术参数工作环境：仪器正常运转对工作环境适应的电压波动范围应符合中国实际情况（一般为不低于220V、50Hz、10A范围），适合使用的温度范围15-25℃；使用湿度较宽，在此范围内，温度、湿度正常变化对仪器稳定性影响小。

提供适合的设备以达到抗震动性要求。

1.激光器：激光器谱线按如下配置:* 1.1 可见光固体激光器（3个）：488nm、532nm、635nm1.2 紫外激光：405nm，功率：不小于25mw1.3 AOTF：所有激光能量均由AOTF控制，连续可调。

2．扫描头：2.1扫描头与显微镜完全一体化，相差及色差完全一体化校正。

* 2.2顺序扫描时八个荧光共聚焦通道，一个效果良好的透射光通道。

所有荧光通道均为光谱通道。

2.3扫描头应具备多标记荧光顺序扫描操作，每个通道光切平面与光切厚度完全一致。

共聚焦通道配置可调大小的共聚焦针孔, 针孔形状：圆形。

2.4单次扫描采集荧光光谱分布曲线，并对荧光光谱进行分析和分离不同标记的信号，可以解决同时使用多种荧光标记时激发光或发射光波长重叠造成的串色问题*2.5可自由选择所有荧光通道检测的波长范围, 所有通道检测范围为430－750nm。

检测波长范围及中心连续任意可调。

光谱分辨率5nm.2.6扫描分辨率：2048×2048 。

大于或等于8位。

2.7扫描方式：能够进行X, Y, Z, T, λ（光谱）扫描，λ扫描必须为实施的同步扫描。

3.显微镜部分3.1研究型编码倒置显微镜。

*3.2六位物镜转换器，最小步进≤3.8nm，调焦行程≥12mm, 防漂移设计，有调焦限位。

* 3.3科勒照明，3200K恒定色温系统3.4显微镜透射光源：LED光源，寿命2.5万小时* 3.5荧光：外置荧光灯，金属卤素灯寿命大于2000小时，可实现自动荧光光强管理。

3.6显微镜下成像和PMT成像必须同步，成像清晰度完全相同。

*3.7目镜：10X，视场数25mm*3.8物镜：确保紫外与可见光共定位的物镜10X，数值孔径不低于0.3040X，数值孔径不低于0.7563X，数值孔径不低于1.40-1.603.9 6位荧光滤块电动转换。