实验四 斐林试剂法法测定还原糖含量(1)

斐林试剂配制，标定以及还原糖测定糊精溶液中还原糖含量测定(DE值测定)A斐林试剂(碱性酒石酸铜溶液)的制备1)斐林试剂甲液称取69.28g的硫酸铜(CSO.5HO)溶于水中并稀释至1000ml，静置48h，用滤纸过U42滤2)斐林实际乙液分别称取酒石酸钾钠346g和氢氧化钠100g，溶于水中并稀释至1000ml，静置48h，用滤纸过滤B斐林试剂标定精确称取已在105?下干燥至恒重的分析纯葡萄糖0.8g，用蒸馏水稀释，移入250ml容量瓶并稀释至刻度，摇匀。

用移液管分别吸取斐林试剂甲，乙液各5ml和蒸馏水20ml于150ml锥形瓶中(预备数份)，于电炉上煮沸，用上述葡萄糖溶液(置于25ml滴定管中)滴定至蓝色消失时，加入1%的亚甲基蓝指示剂两滴，继续用糖液滴定至蓝色刚好消失。

此操作在1min内完成。

再重复操作第二次标定过程，取两次葡萄糖溶液消耗体积的平均值(允许误差不大于0.1ml)，按下式计算斐林试剂常数(10ml斐林试剂相当于葡萄糖的质量)。

R=WG/V式中R——10ml斐林试剂相当于葡萄糖的质量，g;W——葡萄糖溶液消耗的体积，mlG——葡萄糖的质量，gV——葡萄糖定容体积，250mlC测定步骤称取糊精溶液(液化)15g，移入250ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。

用移液管分别吸取斐林试剂甲，乙液各5ml和蒸馏水20ml于150ml锥形瓶中。

其余步骤同斐林试剂标定法，即以样品稀释液代替葡萄糖溶液滴定斐林试剂。

计算还原糖含量按下式计算还原糖(%)=100RV/WG式中R——10ml斐林试剂相当于葡萄糖的质量，g;W——葡萄糖溶液消耗的体积，ml;G——样品质量，g;V——葡萄糖定容体积，250ml。

综合实验之生物制品分析检测实验一:斐林试剂置换法测定还原糖的含量一、实验原理:糖类包括多糖、双糖和单糖，其中单糖和某些双糖具有游离的羰基，称为还原糖，多糖和蔗糖无还原性。

利用糖的还原性，与斐林试剂（氧化剂）中的二价铜离子还原为一价铜，进行氧化还原反应，而进行测定.非还原糖必须转化为还原糖，再进行测定。

斐林试剂中酒石酸钾钠铜是一种氧化剂，反应的终点可用次甲基蓝作指示剂，在碱性、沸腾环境下还原呈无色。

根据斐林试剂完全还原所需的还原糖量，计算出样品还原糖量。

二、试剂与材料：1、试剂：菲林试剂甲液：称取69.3g硫酸铜晶体，用蒸馏水溶解，定容至1000ml菲林试剂乙液：称取346g酒石酸钾钠，100g氢氧化钠，用蒸馏水溶解定容至1000ml2、1%次甲基蓝溶液：1g次甲基蓝溶于100ml水3、0.2%标准葡萄糖溶液：2g葡萄糖105℃烘干到恒重加水到1000ml4、碱式滴定管5、样品溶液：待测葡萄糖溶液样品1：稀释20倍，样品2：稀释50倍6、电炉三、操作方法：1、斐林试剂标定A 取甲液5ml+乙液5ml，（注意：甲液与乙液混合可生成氧化亚铜沉淀，应将甲液加入乙液，使开始生成的氧化亚铜沉淀重溶）置于250ml三角瓶中，加入10ml水，并从滴定管中加入0.2%的标准葡萄糖溶液若干毫升（约23ml）。

（量控制在后滴定时消耗葡萄糖液在0.5－1.0ml)B 电炉上加热至沸，并保持微沸2分钟，加2滴1%次甲基蓝溶液，趁沸以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液用0.2%标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，有红棕色沉淀，溶液清亮为终点止。

记录耗用的葡萄糖液量为V0,必须在1min内完成。

注意：还原的次甲基蓝易被空气中的氧氧化，恢复成原来的蓝色，所以滴定过程中必须保持溶液成沸腾状态，并且避免滴定时间过长。

2、定糖预备试验同1法取斐林试剂，加10ml样品液，摇匀于电炉上加热至沸，保持微沸2分钟，加2滴1%次甲基蓝，用0.2%葡萄糖液滴定至蓝色消失。

总糖和还原糖测定方法较多，如3，5—二硝基水杨酸法、碱性铜试剂法、蒽酮比色法、斐林氏法等。

这里只介绍斐林氏法。

一、目的学习掌握生产实践中常用的快速定糖方法。

二、原理还原糖在碱性溶液中能将Ag+，Hg+，Cu2+，Fe（CN）3-等金属离子还原，而糖本身则氧化成各种羟酸，利用这一特性可以对还原糖进行定量测定。

本实验采用斐林试剂热滴定法，氧化剂是斐林试剂，它是由甲乙两种溶液组成，甲液中含有硫酸铜、次甲基蓝；乙液中含有氢氧化钠、酒石酸钾钠和亚铁氰化钾（黄血盐）。

当甲乙两液混合时，硫酸铜和氢氧化钠作用形成氢氧化铜沉淀，由于溶液中存在酒石酸钾钠，它和氢氧化铜形成了可溶性络合物。

酒石酸络铜（Ⅱ）钾钠盐在与还原糖共热时，二价铜离子即被还原成一价的氧化亚铜红色沉淀。

此氧化亚铜与试剂中亚铁氰化钾反应生成可溶性的亚铁氰酸络铜（Ⅰ）钾盐。

Cu2O + K4Fe(CN)6 + 3 H2O →K2Cu2Fe(CN)6 + 2 KOH + 2 H2O亚铁氰化钾亚铁氰酸络铜（Ⅰ）钾盐斐林试剂中二价铜的还原力比次甲基蓝强，因此所滴入的标准葡萄糖溶液首先使二价铜还原，只有当二价铜被还原完毕后，才能使次甲基蓝（甲烯蓝）还原为无色，测定中以此作为滴定终点。

在测定时先做一对照管（不加样品），用标准葡萄糖滴定求知一定体积斐林试剂中二价铜和次甲基蓝的量，即测定对照管消耗的标准葡萄糖量（A）。

再做样品管，样品中还原糖消耗斐林试剂中一部分二价铜，剩余的量再用标准葡萄糖来滴定，即样品消耗的标准葡萄糖量（B）。

将（A）减去（B）就可求得样品中还原糖量。

三、器材及试剂：1．器材：①山芋粉②广范试纸pH1～12。

③吸管5毫升（×4），10毫升（×2）④容量瓶100毫升（×3）⑤烧杯150毫升（×1），100毫升（×1）⑥三角烧瓶250毫升（×6）⑦滴定管25毫升（×1）⑧双孔橡皮塞⑨电炉300W（×1）⑩天平。

1. 了解还原糖的性质和鉴定方法。

2. 掌握使用斐林试剂检测还原糖的原理和操作步骤。

3. 学习通过比色法计算还原糖的含量。

二、实验原理还原糖是指含有游离醛基或酮基的糖类，它们能够还原斐林试剂中的Cu²⁺离子为Cu⁺离子，生成砖红色的Cu₂O沉淀。

斐林试剂由斐林A液（含CuSO₄的碱性溶液）和斐林B液（含NaOH的碱性溶液）组成，两种试剂混合后，Cu²⁺离子与还原糖反应生成Cu₂O沉淀。

三、实验材料与试剂1. 试剂：- 斐林A液：称取硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）0.1g，溶于100mL水中，加入5mL浓NaOH溶液。

- 斐林B液：称取NaOH 2g，溶于100mL水中。

- 标准葡萄糖溶液：准确称取葡萄糖1.0000g，溶于1000mL水中，配制成1mg/mL的标准溶液。

- 样品溶液：取一定量的待测样品，用蒸馏水溶解并定容至一定体积。

2. 仪器：- 烧杯- 试管- 滴定管- 移液管- 移液器- 恒温水浴锅- 移液管1. 准备标准溶液：准确移取1mL标准葡萄糖溶液，加入9mL蒸馏水，配制成0.1mg/mL的标准溶液。

2. 配制斐林试剂：将斐林A液和斐林B液等体积混合，立即使用。

3. 取一支试管，加入2mL样品溶液。

4. 加入2mL斐林试剂，混合均匀。

5. 将试管放入恒温水浴锅中，加热至沸腾，保持沸腾状态5分钟。

6. 取出试管，观察沉淀颜色。

7. 重复步骤3-6，制作标准曲线。

8. 根据标准曲线，计算样品溶液中还原糖的含量。

五、实验结果与分析1. 标准曲线的制作：以标准葡萄糖溶液浓度为横坐标，沉淀颜色深浅为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品溶液中还原糖含量的计算：根据样品溶液的浓度和沉淀颜色深浅，在标准曲线上找到对应的还原糖含量。

六、实验讨论1. 实验过程中，斐林试剂需现配现用，以免Cu²⁺离子被还原成Cu⁺离子，影响实验结果。

2. 样品溶液的浓度应控制在一定范围内，以免沉淀颜色过深，影响准确度。

还原糖的测定实验报告[生物化学实验报告]实验一糖类的性质实验〔一〕糖类的颜色反响一、实验目的1、了解糖类某些颜色反响的原理。

2、学习应用糖的颜色反响鉴别糖类的方法。

二、颜色反响〔一〕α-萘酚反响1、原理糖在浓无机酸〔硫酸、盐酸〕作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与α-萘酚生成紫红色物质。

因为糠醛及糠醛衍生物对此反响均呈阳性，故此反响不是糖类的特异反响。

2、器材试管及试管架，滴管3、试剂莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100mL，贮于棕色瓶内。

用前配制。

1％葡萄糖溶液100mL1％果糖溶液100mL1％蔗糖溶液100mL1％淀粉溶液100mL0.1％糠醛溶液100mL浓硫酸500mL4、实验操作取5支试管，分别参加1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、0.1％糠醛溶液各1mL。

再向5支试管中各参加2滴莫氏试剂，充分混合。

倾斜试管，小心地沿试管壁参加浓硫酸1mL，慢慢立起试管，切勿摇动。

观察记录各管颜色。

〔二〕间苯二酚反响1、原理在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。

此反响是酮醣的特异反响。

醛糖在同样条件下呈色反响缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反响。

实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反响。

2、器材试管及试管架，滴管3、试剂塞氏试剂：0.05％间苯二酚－盐酸溶液1000mL，称取间苯二酚0.05g 溶于30mL浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000mL。

1％葡萄糖溶液100mL1％果糖溶液100mL1％蔗糖溶液100mL4、实验操作取3试管，分别参加1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液各0.5mL。

再向3支试管中各参加塞氏试剂5mL，充分混合。

将试管同时放入沸水浴中，观察记录各管颜色。

(二)糖类的复原作用一、实验目的1、理解并掌握糖类的复原性质；2、学习常用的鉴定糖类复原性的方法。

还原糖含量的测定（斐林试剂法）一、实验目的：学习用斐林试剂测还原糖的方法，二、实验原理：斐林试剂由甲、乙液组成，甲液为硫酸铜溶液，乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。

平时甲、乙溶液分开贮存，测定时才等体积混合，混合后，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：2Na0H十CuS04——→Cu（OH）2↓十Na2SO4氢氧化铜因能与酒石酸钾钠反应形成络合物而使沉淀溶解。

酒石酸钾钠铜络合物中的二价铜是一个氧化剂，在氧化醛糖和酮糖（合称总还原糖）的同时，自身被还原成一价的红色氧化亚铜沉淀：反应终点用次甲基蓝来指示。

三、实验器材与试剂：电炉，滴定管等(1)斐林溶液甲液：称取30g结晶硫酸铜(CuS04·5H20)，0.1g次甲基蓝，定容于1000mL水中，如有不溶物须过滤。

乙液：称取100g酒石酸钾钠，108g NaOH，定容1000mL水中，若有沉淀过滤即可。

(2)0.1％标准葡萄糖液：精确称取于105℃烘至恒重的分析纯葡萄糖 1.000g，用水溶解后，定容至1000mL。

四、实验步骤1. 空白滴定准确吸取斐林甲、乙液各5mL，放入250mL锥形瓶中，加水约15mL，并从滴定管加入约20mL 0.1％标准葡萄糖溶液，严格控制不要摇晃三角瓶，将锥形瓶置电炉上加热煮沸，并准确沸腾30s，在沸腾状态下，以每两秒1滴的速度滴入0.1％标准葡萄糖溶液，至溶液刚由蓝色退去，生成砖红色沉淀为止。

后滴定操作应在1分钟内完成，整个煮沸时间应控制在3分钟之内。

记下总耗糖量V0。

2. 预滴定稀释：将样品除气后，进行适当稀释，以期用15~50mL（最好20~30mL）稀释液使滴定完成。

一般将发酵液稀释100倍（吸取1mL发酵液定容到100mL容量瓶）。

准确吸取斐林甲、乙液各5mL，放入250mL锥形瓶中，加水约15mL，吸取稀释样液1mL，放入锥形瓶中，并从滴定管加入约18mL 0.1％标准葡萄糖溶液，其他与空白滴定基本相同，最后在1分钟内滴定完成。

斐林试剂法测定还原糖的含量
一、实验原理
还原糖可以将二价铜离子还原成为一价铜。

反应终点可以由次甲基蓝指示，根据一定量的菲林试剂完全还原所需的还原糖量，可以计算加入样品中还原糖的含量。

二、实验器材
①菲林试剂
甲液：称取15.0g硫酸铜（CuSO4·5H2O）,0.05克四甲基蓝，用水溶解并稀释到1000ml.
乙液：称取50.0g酒石酸钾钠，75g的氢氧化钠，4.0g的亚铁氰化钾，用水溶解并稀释到1000ml。

② 0.10%标准葡萄糖溶液：精密称取1.000g经95~105℃烘干的无水葡萄糖，用少量水溶解，移入1000ml容量瓶中，加入5ml盐酸，用水稀释到刻度，摇匀。

③滴定管、电炉、锥形瓶等。

三、实验步骤
1．样品溶液的配备
称取样品—mg，稀释后在100ml容量瓶定容。

2.菲林试剂的标定
准确吸取菲林甲乙液各5.00ml，置入150ml的锥形瓶，加水10ml，从滴定管中预先加入约10ml 0.1%的标准葡萄糖液，（用量控制在后滴定消耗0.10%标准葡萄糖1ml以内），摇匀，电炉上加热使其在2min内沸腾。

沸腾状态下以每2s/滴的速度滴入标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点，记录前后总共消耗的标准葡萄糖溶液的总体积Vo。

同法平行操作三份，取接近的两次体积的平均值。

3.预备实验
准确吸取菲林甲乙液各5.00ml，置入150ml的锥形瓶，加水10ml，加玻璃珠3粒。

电炉上加热使其在2min内沸腾，准备沸腾30s，趁沸以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品液(需始终保持溶液的沸腾状态)待溶液蓝色变浅时，以每2s/滴的速度滴入样品，至蓝色刚好消失为终点，记录消耗溶液的体积V1。

《还原糖的测定方法_国标》还原糖的测定方法_国标一、范围本标准规定了用斐林试剂比色法测定试样中还原糖的含量。

本标准适用于所有食物样品中还原糖的测定。

二、原理还原糖与斐林试剂在加热条件下生成砖红色沉淀，通过与标准曲线对比，可以得出样品中还原糖的含量。

三、试剂和材料斐林试剂：甲液（称取14.3g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和0.05g次甲基蓝（C13H16N3OClS）溶于水中，定容至100ml）、乙液（称取173g酒石酸钾钠（C4H4O6NaK·4H2O）和50g氢氧化钠溶于水中，定容至500ml）。

使用时将甲液、乙液等体积混合。

四、仪器和设备1.实验室用粉碎机2.水浴锅3.消煮炉或普通炉灶（能调节温度）4.容量瓶（100ml）5.移液管（10ml）6.比色管（10ml）7.试管（25ml）8.三角瓶（250ml）9.定时钟五、样品制备1.固体样品：取样品适量，用粉碎机粉碎，然后称取约0.2g样品置于试管中。

2.液体样品：直接取适量样品置于试管中。

3.在每个试管中加入4ml斐林试剂，充分混匀后静置10min。

4.将试管中的溶液倒入三角瓶中，加入约80ml水稀释，加热至沸后保持1min。

5.用移液管向每个试管中加入1ml样液，摇匀后置于试管架上。

6.在温度达到要求时将试管放入水浴中加热，同时开启计时器。

当时间达到要求时立即取出试管，用自来水冷却至室温。

7.将冷却后的溶液用移液管倒入比色管中，再加入约1ml的样液摇匀。

8.将比色管置于比色槽中，与标准曲线进行比色，得出样品的含量。

9.将整个测定过程中每个环节的时间、温度等条件记录下来，以便后续分析。

六、结果分析通过与标准曲线对比，可以得出样品中还原糖的含量。

计算公式为：含量=测定管吸光度÷校准管吸光度×标准品浓度。

其中吸光度需要在一定波长下测定。

同时需要注意实验过程中操作条件的控制，以保证结果的准确性。

如果操作条件不稳定或样品复杂性较高，需要进行适当调整或采取其他适合的方法进行测定。