植物组织中还原糖含量的测定

D．由亮变暗，观察到的细胞多
8、将某种玉米子粒浸种发芽后研磨匀浆、过滤，得到提取液。取6支试管分别加入等量的淀 粉溶液后，分为3组并分别调整到不同温度，如图所示，然后在每支试管中加入等量的玉米 子粒提取液，保持各组温度30分钟后，继续进行实验（提取液中还原性物质忽略不）： （1）若向A、C、E三支试管中分别加入适量的班氏试剂或斐林试剂，沸水浴一段时间，观 察该三支试管，其中液体颜色呈砖红色的试管是___A__和_C_；砖红色较深的试管是____C__，颜 色较深的原因是___淀粉酶在40℃时活性相对较高，淀粉酶催化淀粉水解产生的还原_糖__多；不 变色的试管是___E_，不变色的原因是___酶__失__活__。 （2）若向B、D、F三支试管中分别加入等量的碘液，观察三支试管，发现液体的颜色是蓝 色，产生该颜色的原因是__剩__余__的__淀__粉_遇__碘_。变蓝 （3）以上实验的三种处理温度不一定是玉米子粒提取液促使淀粉分解的最适温度。你怎样 设计实验才能确定最适温度？（只要求写出设计思路）
A、产生气泡 B、溶液呈蓝色 C、溶液呈紫色 D、产生砖红色沉淀 2、用斐林试剂可以鉴定还原糖的存在，用双缩脲试剂可以鉴定蛋白质的 存在，在医学上，还常用上述两种试剂进行疾病的诊断。能够诊断的 疾病是（D ） A、糖尿病、肠炎 B、糖尿病、胃炎 C、肾炎、胃炎 D、糖尿病、肾炎 3、鉴定脱脂奶粉是否为伪劣产品,不需要用的化学试剂是( D )
A 斐林试剂 B苏丹IV染液 C 双缩脲试剂 D红墨水
4、在还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定实验中，最佳的一组实验材料是（ D）
①甘蔗的茎 ②油菜籽 ③花生种子 ④梨 ⑤甜菜的块根 ⑥豆浆 ⑦鸡蛋清
A、 ④ ② ⑥ B 、⑤ ③ ⑦
C、 ① ② ⑥ D、 ④ ③ ⑥

检测生物组织中还原糖、脂肪和蛋白质一、实验原理（1）鉴定实验设计的理念：某些化学试剂+ 生物组织中有关有机化合物→产生特定的颜色反应。

（2）具体原理：①可溶性还原糖+ 斐林试剂→砖红色沉淀。

②脂肪小颗粒+ 苏丹Ⅲ染液→橘黄色小颗粒。

③蛋白质+ 双缩脲试剂→紫色反应。

二、目标要求初步掌握鉴定生物组织中可溶性还原糖、脂肪、蛋白质的基本方法。

三、实验材料1.可溶性还原糖的鉴定实验:选择含糖量较高、颜色为白色或近白色的植物组织，以苹果、梨为最好。

2.脂肪的鉴定实验:选择富含脂肪的种子，以花生种子为最好。

3.蛋白质的鉴定实验:可用浸泡1d～2d的黄豆种子(或用豆浆、或用鸡蛋蛋白)。

四、仪器、试剂1.仪器:双面刀片,试管,试管架,试管夹,大小烧杯,小量筒,滴管,酒精灯,三脚架,石棉网,火柴,载玻片,盖玻片,毛笔,吸水纸,显微镜。

2.试剂:①斐林试剂(0.1g/L的NaOH溶液+ 0.05g/mL的CuSO4溶液)；②苏丹Ⅲ染液；③双缩脲试剂；④体积分数为50%的酒精溶液；⑤蒸馏水。

五、方法步骤（一）、还原糖的鉴定1、实验流程：取材→加试剂→加热→观察2、鉴定步骤:①选材：梨：洗净、去皮、切小块，取5g放入试管中（图1）②加斐林试剂：2ml（由斐林试剂甲液和乙液充分混合而成，不能分别加入）③水浴加热：煮沸2min④观察溶液颜色变化：浅蓝色→棕色→砖红色。

结论：还原糖与斐林试剂在加热煮沸的过程中生成砖红色沉淀（图2）图1 图23、改进后优点简化了用榨汁机榨汁这一步，节省了操作时间，以及对榨汁机的清洗等步骤；另外小梨块可以在实验过程中切取，不需提前切好，不易因时间太长而褐化，从而避免对反应现象的干扰，使实验现象更明显。

（二）、脂肪的鉴定1、实验流程：取材→挤压→加液→观察2、鉴定步骤:①取材：花生种子②挤压：在纸上用力按压，显出油斑（图3）③加液：在油斑上滴2-3滴苏丹Ⅲ染液④观察：油斑出被染成橘黄色（图4）结论：细胞中的圆形脂肪小颗粒已经被染成橘黄色。

6
四、实验步骤
2、样品中还原糖的提取
（1）称取5g烟草叶片放入研钵中，加入5mL蒸馏水研 磨成匀浆液。将匀浆液全部转移至锥形瓶里。
（2）再用10mL蒸馏水冲洗研钵，并将冲洗液全部转 移至锥形瓶里。
（3）往锥形瓶里加入20mL蒸馏水，摇匀，于50℃保 温20min，不时搅拌。
（4）用漏斗过滤，将滤液全部收集到烧杯中，最终用 50mL容量瓶加蒸馏水定容至50mL，即为还原糖提取液。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖 和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用 酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定。
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法，其基本原理 是用比色法对还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中 还原糖和总糖的含量。
二、实验原理
在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸（DNS） 共 热 ， 3,5- 二 硝 基 水 杨 酸 被 还 原 为 3- 氨 基 -5- 硝 基 水 杨 酸 （棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。在 一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成 一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光 值，查对标准曲线并计算，就可以分别求出样品中还原糖 和总糖的含量。
NaOH
加热
黄色
棕红色
三、仪器和试剂
1、仪器： 电子天平、恒温水浴锅、分光光度计（722型）。
2、试剂： 2mg/mL葡萄糖标准液、蒸馏水、3,5-二硝基水杨
酸、6mol/L盐酸、碘-碘化钾、6mol/L氢氧化钠
5
四、实验步骤
1、葡萄糖标准曲线的绘制
取6支试管，按表加入试剂。
以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，光吸收值（OD540） 为纵坐标，绘制标准曲线。

实验一生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定一、实验原理：该实验中，对三类化合物的鉴定都是根据它们的特定颜色反应进行的。

当质量浓度为0.1 g／ml的氢氧化钠溶液(氢氧化钾溶液亦可)与质量浓度为0.05g／m1的硫酸铜溶液混合后，立即生成淡蓝色的Cu(OH)2沉淀。

Cu(OH)2与葡萄糖等可溶性还原糖共热，能够生成砖红色的Cu2O沉淀。

因此，利用该反应，可证明样液中含可溶性还原糖。

苏丹Ⅲ是可以对脂肪染色的试剂，因此，当含有大量油滴的植物细胞用苏丹Ⅲ染色后，在显微镜下可看到细胞内橘黄色的颗粒。

蛋白质分子中含有很多肽键，因而能与双缩脲试剂发生反应生成紫色的络合物。

若在组织样液中加入双缩脲试剂后，有紫色反应，则证明其中含有蛋白质。

二、实验目的：初步掌握鉴定生物组织中可溶性还原糖、脂肪、蛋白质的基本方法。

三、实验材料：1、做可溶性还原糖的鉴定实验，还原糖的含量、生物组织中有色素会影响实验结果及其观察的最重要因素。

因此要选用可溶性还原糖含量高、白色或近于白色的植物组织，其中以苹果、梨最好。

也可用白色的甘蓝叶、白萝卜替代(不能选西瓜)。

2、做脂肪的鉴定实验时，所用材料一要脂肪含量高，二要有一定大小才能做徒手切片，花生种子符合该实验的要求。

将花生种子经过3～4小时的浸泡使其变软，有利于切成薄片；但浸泡时间也不宜过长，否则切片时易碎裂，切不成薄片。

3、做蛋白质的鉴定实验，一般选用蛋白质含量较高的大豆（豆浆）或鸡蛋清。

四、试剂配制：1、斐林试剂：甲液——质量浓度为0.1 g／ml的氢氧化钠溶液(10克的氢氧化钠加水至100ml即成)；乙液——质量浓度为0.05g／ml的CuSO4溶液(5g硫酸铜加水至100m1充分溶解即成)。

甲、乙试剂千万要分开放，不可混合。

在实验过程中，将4～5滴乙液滴入2ml甲液中现混现用。

2、苏丹Ⅲ溶液：将0.1g苏丹Ⅲ干粉溶于100ml体积分数为95％的酒精溶液中，待全部溶解后即成。

3、双缩脲试剂：A液——质量浓度为0.1 g／ml的氢氧化钠溶液(可使用斐林试剂甲液)。

二、高考命题角度预测 (1)若以血液为材料检测血浆中是否含有还原糖和蛋 白质，对实验材料应如何处理？请分析原因。 提示：对血液进行离心后取上清液(血清)进行检测。 因血液为红色，会干扰实验结果。离心后去除血细胞，可 排除干扰。
(2)种子萌发过程中，蛋白质含量会发生变化。现有萌 发两天和四天的大豆种子，请设计实验，探究大豆种子萌 发时蛋白质含量是增加还是减少。(简要说明原理即可)
为什么？_________________________________________。 (3)已知生长素含量增加能提高细胞内乙烯的含量。如果对青柿 子喷洒一定浓度的生长素，则青柿子继续成熟时曲线②将呈现出 ________趋势，曲线①将呈现出________趋势。
[解析] (1)柿子在成熟过程中由苦涩变甘甜与淀粉的转化 有关，淀粉逐渐转化为具有甜味的还原糖，因此，青柿子中淀 粉含量高、还原糖含量少，黄柿子中淀粉含量少、还原糖含量 高；曲线②所示物质随时间变化含量逐渐减少，因此表示淀粉 含量的变化，曲线①表示还原糖含量的变化。(2)检测还原糖时， 斐林试剂的甲液、乙液要等量混合均匀后，再加入待测溶液中， 并要水浴加热。(3)根据题意可知，对青柿子喷洒一定浓度的生 长素后，青柿子细胞内乙烯的含量将增加。乙烯促进果实成熟， 因此淀粉的分解速度将加快，即曲线②加速下降，相应地，还 原糖的生成也将加快，即曲线①加速上升。
比较 项目
斐林试剂
双缩脲试剂
甲液 成分 0.1 g/mL
NaOH溶液
乙液
0. 05 g/mL CuSO4溶液
A液
B液
0.1 g/mL 0.01 g/mL NaOH溶液 CuSO4溶液
比较项目
斐林试剂
双缩脲试剂
反应原理 添加顺序

植物组织中还原糖含量的测定应用化学1101 A20110001程志永植物组织中还原糖含量的测定程志永（东北农业大学理学院应用化学系，哈尔滨，150000）摘要：本实验以葡萄糖为标准，以3,5- 二硝基水杨酸(DNS)作显色剂，用分光光度法测定黄瓜中还原糖的含量。

在碱性条件下，3，5–二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的3–氨基–5–硝基水杨酸，该物质在540nm波长处有最大吸收。

在一定浓度范围内，还原糖的量与棕红色物质的光吸收值成正比例关系，利用比色法可定量测定样品中的含糖量。

关键词：还原糖；分光光度法；3,5-二硝基水杨酸中图分类号：Q5-33文献标志码：A引言DNS 比色法的原理是：3,5-二硝基水杨酸在碱性溶液中被还原糖还原成氨基化合物，在沸水浴中显色时间5min，波长在540nm下有最大吸收峰。

试验过程中的诸多因素如吸收光谱、显色剂用量、显色时间等均对测定结果的准确性有直接影响。

因此，我们对用3,5-二硝基水杨酸比色法测定马铃薯块茎还原糖含量的反应条件进行了一系列的试验，试图摸索最佳的试验条件以保证试验的精确度，以期获得可靠的数据为黄瓜品质育种的实践提供参考。

1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 供试药剂3,5-二硝基水杨酸；蒸馏水；葡萄糖溶液。

1.1.2 供试植物材料黄瓜0.96g1.2 实验方法1.2.1 葡萄糖标准曲线的制作称取0.0502g葡萄糖，定容至500ml；吸取葡萄糖标准液0、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL，分别置于10mL试管中，编号1、2、3、4、5、6，各加蒸馏水使体积为1.0mL，再加苯酚试液0.51mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸2.5 mL，摇匀后放置5min，置沸水浴中加热约15min，取出后冷却至室温。

以一号试管为对照组。

用721分光光度计，1cm比色皿，在490nm 处测定吸光度，绘制葡萄糖浓度-吸光度工作曲线。

1.2.2 样品中还原糖含量的测定1.2.2.1还原糖的提取准确称取样品0.5g，用少量蒸馏水研磨成匀浆，然后加入蒸馏水定容至50mL，摇匀，置于50℃恒温水浴中保温10min，使还原糖浸出，移入离心管，4000r/min下离心10min，取上清液。

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③ 在各种食品中存在形式和含量不一。
糖分为单糖、双糖、多糖。
有效碳水化合物——人体能消化利用的单糖、双 糖、多糖中的淀粉。 无效碳水化合物——多糖中的纤维素、半纤维素、 果胶等不能被人体消化利用的。
这些无效碳水化合物能促进肠道蠕动。
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葡萄糖 单糖 果糖 半乳糖 碳水化合物 双糖 蔗糖 有效碳水化合物
⑤滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从 热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。 ⑥样品溶液预测的目的；一是本法对样品溶液中还原 糖浓度有一定要求(0.1%左右)，测定时样品溶液的消 耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近， 通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，浓度过大或 过小应加以调整，使预测时消耗样液量在 10 ml 左右；
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样品溶液预测 吸取碱性洒石酸铜甲液及乙液各5.00ml，置 于250m1锥形瓶中，加水10 ml．加玻璃珠3粒， 加热使其在2分钟内至沸，准确沸腾30秒钟，趁 热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液， 滴定时要始终保持溶液呈沸腾状态。待溶液蓝色 变浅时．以每2秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色 刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。
乳糖 麦芽糖
淀粉
多糖
纤维素 果胶 无效碳水化合物
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1.2 测定方法
相对密度法
物理法
折光法
旋光法
单糖和低聚糖
化学法
还原糖法（斐林氏法、高锰酸钾法、 铁氰化钾法） 碘量法 缩合反应法
色谱法：纸色谱法、薄层色谱法、
酶法
淀粉：水解为单糖，再用单糖测定方法测定 多
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糖
果胶和纤维素：多采用重量法
食品中糖类物质的测定方法

总糖和还原糖的测定──3,5－二硝基水杨酸法目的要求：掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。

实验原理:在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。

在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

黄色桔红色试剂和器材一、试剂3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml。

葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为2.0mg/ml。

6mol/L HCl：取250ml浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500ml。

碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。

0.1% 酚酞指示剂。

二、材料藕粉，小麦淀粉或玉米淀粉。

三、器材723PC、S22型分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。

一、葡萄糖标准曲线制作取5支15mm×180mm试管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。

管号葡萄糖标准液蒸馏水葡萄糖含量OD540 /ml /ml /mg0 1 00.210.80.42 0.4 0.6 0.83 0.6 0.4 1.24 0.8 0.2 1.65 1 0 2操作方法在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。

以1.0ml蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。

以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

还原糖含量的测定（ Somogyi-Nelson 比色法）一.目的在植物营养及代谢研究中，常需测定还原糖的含量，本实验要求掌握Somogyi-Nelson 比色法的测定原理。

二、原理还原糖是具有羰基（＞ C ＝ O ）的糖，能将其他物质还原而其本身被氧化。

(1) 还原糖在碱性条件下加热，在酒石酸钾钠存在的情况下，可以定量地将二价铜离子还原为一价铜离子，即产生砖红色的氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。

具体反应如下：生成的 Cu 复合物与糖反应， Cu 生成氧化亚铜（ Cu 2 O ）。

(2) 氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝色复合物即砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与还原糖含量（即被还原的 Cu 2 O 量）成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后用做标准，就可测得样品中还原糖含量。

三、仪器、试剂和材料1 .仪器（ 1) 分光光度计（ 2 ）水浴锅（ 3 ）具塞刻度试管： 15ml X 10（ 4 ）吸管： 1ml X 1 ， 2m1X4 ， 5ml X 3（ 5 ）容量瓶： 100m1 X 2（ 6 ）漏斗（ 7 ）研钵（ 8 ）电子顶载天平2 .试剂（ 1) 铜试剂A. 4 ％ CuS04 · 5H20B. 称取 24g 无水碳酸钠，用 850m1 水溶于大烧杯中，加120g含 4 分子结晶水的酒石酸钾钠，待全溶（可适当加热）后加入碳酸氢钠16g, 再加入120g 无水硫酸钠，全溶及冷却后加水至 900m1 ，沉淀 1~2 天，取上清液（要求严格时过滤）即可备用。

使用前将 A 与 B 按 1 ： 9 混匀即可。

(2 ）砷钼酸试剂:25g钼酸铵溶于 450ml 蒸馏水中（加热溶解，但温度接近 150 ℃时易分解），待冷却后再加入21 ml 浓 H2SO4 混匀。

另将3g砷酸氢二钠（ Na2HAs04 . 7H20) 溶解于 25ml 蒸馏水中，然后加到钼酸铵溶液中，室温下放置于棕色瓶中可长期备用。

探究生物组织中还原糖的鉴定探究生物组织中还原糖的鉴定3篇生物中的还原糖篇一：检测生物组织中还原糖实验一检测生物组织中还原糖、脂肪和蛋白质物质鉴定原理：某些化学试剂能够使生物组织中的有关有机化合物产生特定的。

一、还原糖的检测和观察1、实验原理（1）生物组织中普遍存在的还原糖种类较多，常见的还原糖有、、等；（分子结构中含有还原性基团――醛基或游离酮基的糖，叫还原糖）（2）还原糖与（试剂）在（条件），生成沉淀。

2、成功关键――取材的重要性（1）含较高的生物组织或器官；（2）生物组织颜色宜浅――白色或近于白色，如：苹果、梨的匀浆、白萝卜的根等。

思考：用甘蔗汁行吗？为什么？3、注意事项――斐林试剂的使用（实际上用的是）（1）斐林试剂甲液――斐林试剂乙液――（2）使用原则――①；②；条件――；（实际上用的是）（3）现象――颜色变化过程：→→4、方法步骤二、脂肪的检测和观察1、实验原理脂肪可被（试剂）染成（或被染成）2、方法步骤方法一、向待测组织样液中滴加3滴苏丹Ⅲ染液，观察样液被染色的情况。

方法二、制作子叶临时切片，用显微镜观察子叶细胞的着色情况。

（一定要用显微镜吗？）（1）取材切片（2）染色：用的酒精，目的是：，原理是。

思考：还有哪些实验中用到酒精？作用分别是什么？（3）低倍镜观察――寻找花生子叶薄片的，移至；（4）高倍镜观察3、成功关键――取材的重要性（1）选择富含的生物组织或器官，如：花生种子，干种子需要浸泡；（2）种子要足够大，便于做徒手切片。

三、蛋白质的检测和观察1、实验原理（1）蛋白质与(试剂)发生作用，可以产生反应；思考：尿素与该试剂，会发生紫色反应吗？2、成功关键――取材的重要性（1）富含蛋白质的生物组织或器官，如：大豆种子、鸡蛋蛋清；（2）颜色宜浅3、注意事项――双缩脲试剂的使用（实际上用的是）（1）双缩脲试剂A――双缩脲试剂B――（2）使用原则：先加入，再加入；（条件：不需加热）4、方法步骤四、淀粉的检测和观察1、实验原理：淀粉遇变；2、材料：马铃薯匀浆习题1．在还原性糖的鉴定实验中，对斐林试剂的叙述，错误的是（）A．可直接滴加在苹果的切面上B．最好是刚配制的C．由甲液和乙液两种组成D．使用时，必须混合均匀2．对生物组织蛋白质鉴定实验的叙述，错误的是（）A．用现成的食用豆浆代替研磨制备的生物组织样液B．用鸡蛋蛋白作材料必须用水加以稀释C．将双缩脲试剂A和B同时加入盛有黄豆组织样液或蛋白质稀释液的试管中，摇匀观察D．制备黄豆组织样液时，要加少许SiO2A．麦芽糖在动植物细胞中都能检测到B．单糖、二糖和多糖在细胞内可以相互转化C．糖类物质都是细胞内的能源物质D．糖类物质在细胞内不能贮存5．在观察藓类叶片细胞的叶绿体形态与分布、黑藻叶片细胞的细胞质流动、植物根尖细胞的有丝分裂和花生子叶中脂肪鉴定的四个实验中，它们的共同点是（）A．实验全过程都要使实验对象保持活性B．适当提高温度将使实验结果更加明显C．都需要使用高倍显微镜观察D．都需要对实验材料进行染色6．在下列实验中，不需要用光学显微镜的是（）A．观察细胞质的流动B．脂肪的鉴定C．叶绿体中色素的提取和分离D．观察植物细胞的质壁分离和复原7．（多选题）下列实验中，需要对实验材料染色才能用显微镜观察清楚的是（）A．观察蚕豆叶肉细胞中的叶绿体B．观察人口腔上皮细胞中的线粒体C．观察花生子叶细胞中的脂肪颗粒D．观察紫色洋葱表皮细胞发生质壁分离时液泡的变化8．（1）脂肪的鉴定中，常用体积分数为50%的酒精溶液洗去浮色，这是因为。

子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：苹果（约0.5 g）
2、仪器：水浴锅；可见分光光度计等。 3、试剂：
（1）0.5 mg/mL葡萄糖标准液
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂(碱性)
四、实验步骤：
1、葡萄糖标准曲线的绘制 2、还原糖的提取
3、样品含糖量的测定:
生物化学实验
实
验
四
植物组织中还原糖的测定
—3,5-二硝基水杨酸比色法
学时：3
一、实验目的：
1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理。
2、掌握比色法测定还原糖的操作方法。
二、实验原理:
1、还原糖：指含有游离的半缩醛(酮)基糖。 单糖都是还原糖；某些二糖是还原糖（如麦芽糖、
乳糖等）；多糖为非还原糖。
2、总糖的提取及双、多糖的酸水解。 利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、
3、样品含糖量的测定: 取提取液0.5ml，按上表操作。
五、计算：
还原糖含量(μg/ g )=
还原g)
六、思考题：
1、何谓还原糖？测定还原糖的方法还 有哪几种? 2、本实验的注意事项?
测定还原糖其它方法
(1)蒽酮比色法：
强酸可使糖类脱水生成糠醛，糠醛与蒽
葡萄糖含 量（μg） 0 50 100 150 200
0.5
4 混匀
250
χ1
2、还原糖的提取
① 取0.5g样品于研钵中，加水2ml，充分研磨。
② 用2ml蒸馏水分三次冲洗研钵(总体积小于10 ml)，转入10ml离心管中。 ③ 在50℃水浴中恒温20分钟，冷却后于 4000r/min, 离心5分钟。 ① 取上清转入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容， 待测。

DNS法测定植物组织中还原糖及总糖含量实验的改进作者：查岭生胡鹏等来源：《安徽农学通报》2013年第11期摘要：针对现有生物化学实验“DNS法测定植物组织中还原糖及总糖含量”中的一些不足进行改进，包括实验材料选择、波长选择、DNS量、显色时间、DNS的配制等方面，最后对实验中一些注意事项进行了详细分析，以提高该实验的教学效果。

关键词：DNS法；实验教学；还原糖；改进中图分类号 Q547 文献标识码 B 文章编号 1007-7731（2013）11-16-023，5-二硝基水杨酸法（DNS法）是在碱性条件下，DNS与还原糖加热后被还原成橘红色氨基化合物，然后比色测定糖含量。

该法可测定还原糖和总糖含量，并可通过多糖=总糖-还原糖，粗略获得多糖含量。

相比之下，该方法具有操作简便、快速、灵敏度高、杂质干扰较小等优点[1-9]。

“DNS法测定植物组织中还原糖及总糖含量”实验涉及了一些基本的生物化学实验技能，如组织捣碎（或研磨）、离心技术、定容操作、比色测定及标准曲线绘制等。

该实验能有效提高学生的基本操作技能和动手能力，同时能将理论知识与实际应用很好地结合在一起。

实验的学时及难度适中，在生物化学实验中是一项很好的综合性实验。

笔者根据多年来实验教学经验总结，现对该实验相关步骤进行改进，并对实验中值得注意的地方进行详细总结，以提高其教学效果。

1 方法改进1.1 实验材料选择多数生物化学实验教材中的该实验对象为淀粉[1-5]。

淀粉作为实验材料的缺点主要有：（1）还原糖含量一般很低（如红薯淀粉）；（2）不同淀粉的还原糖含量也不一样；（3）材料本身缺乏可操作性等。

本着材料来源容易，还原糖含量高，色素影响小，易提取，能有效提高学生的动手能力和激发实验兴趣，理论与实际应用有效结合等各方面的因素，结合多年来的实验经验积累，认为白薯（又名“地瓜”）为最佳实验材料。

1.2 波长选择考虑到DNS显色液的影响、葡萄糖标准曲线的线性和最大吸收值等相关因素[6，10-11]，多年来本科实验教学结果证明520nm为最适测定波长。

3 结果处理
分别在标准曲线上查出相应还原糖mg数，按下式计 数 分别在标准曲线上查出相应还原糖 算还原糖百分含量： 算还原糖百分含量：
v c× a × 100 还原糖（%） = 3 w × 10
式中:C－标准曲线方程求得的还原糖 式中 －标准曲线方程求得的还原糖mg数； 数 V－提取液的体积（mL）； －提取液的体积（ ）； a－显色时吸取样品液体积（mL）； －显色时吸取样品液体积（ ）； W－样品重（g）。 －样品重（ ）。
2.3
主要设备
离心机
分光光度计
水浴锅
电子天平
25ml刻度试管；大离心管；100mL烧杯；100mL 刻度试管；大离心管； 烧杯； 刻度试管 烧杯 三角瓶； 三角瓶；100mL容量瓶 ；刻度吸管 1mL、2mL、 容量瓶 、 、 10mL； ；
3 实验方法
3.1 制作葡萄糖标准曲线 支具有25mL刻度试管，编号，按表准确加入浓度 刻度试管， 取7支具有 支具有 刻度试管 编号， 的葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂。 二硝基水杨酸试剂。 为1mg/mL的葡萄糖标准液和 的葡萄糖标准液和 二硝基水杨酸试剂 管号 葡萄糖标准液(ml) 葡萄糖标准液 蒸馏水（ ） 蒸馏水（ml） 3,5-二硝基水杨酸 二硝基水杨酸 试剂（ml） 试剂（ ） 相当葡萄糖量(mg) 相当葡萄糖量 0 0 2.0 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2
3,5-二硝基水杨酸试剂： 二硝基水杨酸试剂： 二硝基水杨酸试剂 6.3g 3,5-二硝基水杨酸和 二硝基水杨酸和262mL 2mol/L NaOH溶 二硝基水杨酸和 溶 含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中， 酒石酸钾钠的热水溶液中， 液，加到500mL含有 加到 含有 酒石酸钾钠的热水溶液中 再加5g结晶酚和 亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸 再加 结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。 结晶酚和 亚硫酸钠 馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。 馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。 2.2 材料 玉米粉 材料:玉米粉

还原糖的测定方法蔗糖, 光度计, 葡萄糖, 测定, 样品大家测定还原糖一般用什么方法啊?谢谢.我用的是以下的方法,怎么标准曲线很差,R2最大值是0.922.还敢用吗?一、原理植物组织中的可溶性糖可分为还原糖（主要是葡萄糖和果糖）和非还原糖（主要是蔗糖）两类。

还原糖具有醛基和酮基，在碱性溶液中煮沸，能把斐林试剂中的Cu2+还原成Cu+，使蓝色的斐林试剂脱色，脱色的程度与溶液中含糖量成正比。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：新鲜植物样品或烘干粉碎过的植物样品。

（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 分析天平（感量1／10000）；3. 水浴锅；4. 具塞刻度试管；5. 刻度吸管；6. 容量瓶；7. 研钵；8. 离心机。

（三）试剂：1. 斐林试剂A液：40gCuSO4.5H2O溶解于蒸馏水定容至1L。

2. 斐林试剂B液：200g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6.5H2O）与150g NaOH溶于蒸馏水中，并定容至1升。

A、B两液分别贮存，使用前等体积混合。

3. 0.1％葡萄糖标准液：取80℃下烘至恒重的葡萄糖0.1000g，加蒸馏水溶解，定容至100ml。

4. 0.1NNaOH。

5. 甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于250ml 60％乙醇中。

6. 10％Pb（Ac）2。

7.饱和Na2SO4。

三、实验步骤1. 标准曲线的制：各管混合后加塞，于沸水浴中加热15min。

取出后自来水冷却，1500rpm离心15min。

取上清液，用分光光度计在590nm波长下比色，以蒸馏水作对照，读取吸光度用空白管的吸光度与不同浓度糖的各管的吸光度之差为横坐标，对应的糖含量为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品中还原糖的提取：取新鲜的植物样品洗净、擦干、剪碎，称取10.00g，放入研钵中研磨至糊状，用水洗入250ml容量瓶中。

当体积近150ml左右时，加2～3滴甲基红指示剂，如呈红色，可用0.1mol/L 的NaOH中和至微黄色。

华南农业大学实验报告
专业班次11农学一班组别201130010110
题目植物组织中总糖和还原糖含量的测定姓名梁志雄日期
【实验目的】
1、掌握总糖和还原糖的提取方法；
2、掌握定量测定总糖和还原糖的原理和操作要点；
3、熟练地掌握分光光度法的操作技术。
【实验原理】
3,5-二硝基水杨酸是一种具有芳香环结构的分子。还原糖与3，5-二硝基水杨酸在碱性条件下加热时，还原糖将3,5-二硝基水杨酸还原成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，而还原糖本身则被还原成糖酸。在一定的浓度范围内，棕红色颜色的深浅与3-氨基-5硝基水杨酸的含量成正比，可用分光光度计在540nm波长下测定，利用系列浓度的葡萄糖测定后做成标准曲线，可以查出样品的还原糖的相应含量。样品中的双糖、寡糖、和多糖需要用酸水解变成还原糖后再用此法测定。
4
4
4
4
A540
0
0.483
0.568
0.086
0.077
将各支试管摇匀后，在分光光度计中用第一支试管调零，在540nm波长分别读取各管的吸光值（A540），分别填在表二中，用各管的读数分别在标准曲线上查出相应的含糖量。
【实验数据处理】
根据表一可以做出下图
根据表二中的数据，查上图中的标准曲线可以得出
2、样品中还原糖的提取在天平上称取去掉外稃后的水稻种子0.3g，放在研钵上，加蒸馏水3ml，加入少量的石英砂研磨成匀浆。匀浆液转移到50ml的三角瓶中，用少许的蒸馏水清洗研钵，一并转入三角瓶中。将三角瓶放在沸水浴中保温20min，取出冷却后，将匀浆液转移到501ml的容量瓶中，用少量的水荡洗三角瓶，一起转入容量瓶，用水定容到50ml，过滤，取滤液待测。
所以总糖含量为（19.4%+17.3%）/2=18.35%

DNS试剂中的硝基在弱碱环境下能够 还原糖类的醛基，生成带有颜色的产 物，颜色的深浅与糖的浓度呈正相关， 可以用于定量测定糖的含量。
DNS法在测定总糖和还原糖中的应用
在植物组织中，总糖包括还原糖和非还原糖，通过DNS法可以测定总糖的 含量，再通过差减法得到还原糖的含量。
DNS法具有较高的灵敏度和准确性，操作简便，适用于多种植物组织中糖 含量的测定。
03
学习并掌握如何根据标准曲线计算糖含量，以及如何处理实验数据和 分析结果。
04
通过本实验的学习，学生将能够掌握植物组织中总糖和还原糖的提取 和测定方法，为后续相关研究打下基础。
02 实验原理
DNS法（二硝基水杨酸法）基本原理
DNS（二硝基水杨酸）法是一种常用 的糖类物质测定方法，通过在强酸环 境下，利用DNS与还原糖发生氧化还 原反应，生成有色产物，再通过比色 法测定糖的含量。
掌握DNS法测定总糖和还原糖的原理有助于理解实验操作步骤和结果分析，为后 续实验打下基础。
学习并掌握植物组织中总糖和还原糖的提取和测定方法
01
学习植物组织中总糖和还原糖的提取方法，包括采集样品、清洗、破 碎、浸提等步骤，以获取可用于测定的糖提取液。
02
掌握DNS法的操作流程，包括配置DNS试剂、糖提取液与DNS试剂 混合、加热煮沸、冷却、比色测定等步骤。
04 实验结果与数据分析
实验结果记录
实验组1
总糖含量为20.5mg/g，还原糖含量为15.3mg/g。
实验组2
总糖含量为22.1mg/g，还原糖含量为16.7mg/g。
实验组3
总糖含量为19.8mg/g，还原糖含量为14.9mg/g。
实验数据分析与处理
• 平均总糖含量：通过对三组实验数据的计算，得出平均总糖含量为 （20.5+22.1+19.8）/3=20.8mg/g。

山药中还原糖和蛋白质的鉴定实验报告山药中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定高一生物实验二生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定。

实验点拨1、生物学中物质的鉴定与化学中物质的鉴定，其原理是一致的。

化学中被鉴定的物质与所用的化学试剂要么发生颜色反应，要么产生沉淀，在生物学中物质鉴定的理念是某些化学试剂能够使生物组织中的有关有机化合物产生特定的颜色反应可溶性还原糖+斐林试剂→砖红色沉淀(水浴加热)，脂肪小颗粒+苏丹II染液→橘黄色小颗粒(要显微镜观察)蛋白质+双缩脲试剂→紫色反应.(要先加A液NaOH溶液再加B液CuSO4溶液)2、可溶性还原糖的鉴定实验中:应选择含糖量较高,颜色为白色或近白色的植物组织。

以苹果, 梨为最好。

且先要制备组织样液。

研磨时，可加石英砂和水一起研磨。

3、斐林试剂要两液混合均匀且现配现用，切勿将甲液和乙液分别加入组织样液中。

斐林试剂的配制过程示意: 斐林试剂甲液(0.1 g/ml的NaOH溶液)斐林试剂乙液( 0.05 g/ml的CuSO4溶液)4.关于鉴定还原糖的实验，在加热试管中的溶液时，应该用试管夹夹住试管.上部，并放入盛开水的大烧杯中加热。

注意试管底部不要.接触烧杯底部，同时试管口不要朝向实验者，以免试管内溶液沸腾时冲出试管，造成烫伤。

如果试管内溶液过于沸腾，可以上提试管夹，使试管底部离开大烧杯中的开水。

.5.做鉴定还原糖的实验时，在鉴定之前，可以留出一部分样液，以便与鉴定后的样液的颜色变化作对比，这样可以增强说服力。

6、脂肪的鉴定实验中:实验材料应选择富含脂肪的种子，以花生种子为最好。

实验前浸泡3h~4h (浸泡时间太短，不容易切片;浸泡时间过长，组织太软，切下来的薄片不易成形)，最适宜切片。