番茄斑萎病毒4种检测方法比较_赵巍巍
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２０１５，４１（２）：１０８－１１３
Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
番茄＊ ， 吴青君２＊
（１． 湖 南 农 业 大 学 农 药 研 究 所 ， 长 沙 ４１０１２８；２． 中 国 农 业 科 学 院 蔬 菜 花 卉 研 究 所 ， 北 京 １０００８１）
摘要 本研究根据番茄斑萎病毒（ＴＳＷＶ）Ｓ ＲＮＡ 上的核衣 壳 蛋 白（Ｎ）基 因 保 守 序 列 设 计 特 异 性 引 物 ，比 较 了 ４ 种 检测方法的灵敏度。结果表明，特异性引物可扩增出３９７ｂｐ的片段，序列和已发 表 的 ＴＳＷＶ 核 苷 酸 序 列 同 源 性 高 达９９％，可用于常规 ＰＣＲ 和荧光定量 ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）检测。ｑＲＴ－ＰＣＲ 的灵敏度比快速检测试纸条、双抗体夹 心酶联免疫吸附法（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）和常 规 ＰＣＲ 分 别 高 出 １５ ６２５ 倍、３ １２５ 倍 和 １２５ 倍，且 能 够 准 确 定 量；常 规 ＰＣＲ 灵敏度较高，但不能准确定量；ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ 方法适用于批量定性测定，但检测时间较长；试纸条法检测速度 最 快，但 灵 敏 度 最 低 ，使 用 时 可 根 据 症 状 程 度 和 试 验 条 件 选 择 适 宜 的 检 测 方 法 。 关键词 番茄斑萎病毒； ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ； 常规 ＰＣＲ； 快速检测试纸条； ｑＲＴ－ＰＣＲ； 灵敏度 中 图 分 类 号 ： Ｓ ４３２．４１ 文 献 标 识 码 ： Ａ ＤＯＩ： １０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９－１５４２．２０１５．０２．０１９
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｎ） ｇｅｎｅ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ （ＴＳＷＶ）Ｓ ＲＮＡ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＴＳＷＶ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａ ３９７ ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅ－ ｑｕｅｎｃｅ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ９９％ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ＴＳＷＶ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ （ｑＲＴ－ＰＣＲ）ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｑＲＴ－ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＴＳＷＶ ｗａｓ １５ ６２５ ｆｏｌｄ，３ １２５ ｆｏｌｄ ａｎｄ１２５ ｆｏｌｄ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐ （ＲＤＴＴ），ｄｏｕｂｌｅ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ （ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ，ｒｅ－ ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｑＲＴ－ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｂｅ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ．Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｓｅｎｓｉ－ ｔｉｖｉｔｙ，ｂｕｔ ｉｔ ｃａｎｎｏｔ ｂｅ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ．ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ ｉｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｂａｔｃｈ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｕｔ ｉｔ ｎｅｅｄｓ ａ ｌｏｎｇｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ．ＲＤＴＴ ｉｓ ｔｈｅ ｆａｓｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ，ｂｕｔ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ．Ｓｕｉｔａｂｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｃａｎ ｂｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｙｍｐｔｏｍ ｄｅｇｒｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｔｏｍａｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ； ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ； ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ； ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐ； ｑＲＴ－ ＰＣＲ； ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
ＰＣＲ ４ 种 方 法 检 测 番 茄 斑 萎 病 毒 的 灵 敏 度 ，旨 在 为 国 内 ＴＳＷＶ 的检验检疫提供快速、准确和灵敏的检测 技术，同时也为防控 ＴＳＷＶ 提供更好的技术支撑。
１ 材 料 与 方 法
１．１ 供 试 材 料 １．１．１ 病 毒
ＴＳＷＶ（ＴＳＷＶ－ＹＮ）病毒 毒 源 由 浙 江 省 农 科 院 植物保护与微 生 物 研 究 所 张 治 军 博 士 提 供，通 过 人 工摩擦的 方 法 接 种 于 曼 陀 罗 （Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ ） 上 活 体 保 存 ［２７］，然 后 再 转 接 到 试 验 寄 主 植 株 上 。 １．１．２ 植 物 材 料
近 年 来，随 着 我 国 进 出 口 贸 易 频 繁，存 在 ＴＳＷＶ 暴发的潜在威胁，常 规 ＰＣＲ 和 ｑＲＴ－ＰＣＲ 在 植物病毒检测 中 具 有 灵 敏 度 高、准 确 快 速 等 优 点 备 受青睐。本 研 究 针 对 ＴＳＷＶ 核 衣 壳 蛋 白 （Ｎ）基 因 保守序列 设 计 常 规 ＰＣＲ 和 ｑＲＴ－ＰＣＲ 新 的 特 异 引 物，并建立了适宜的反应体系和扩增程 序，同时比较 了快速 检 测 试 纸 条、ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ、常 规 ＰＣＲ 和 ｑＲＴ－
番 茄 斑 萎 病 毒 （Ｔｏｍａｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ， ＴＳＷＶ）是布 尼 亚 病 毒 科 （Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ），番 茄 斑 萎 病毒属（Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ）代 表 性 成 员［１］，病 毒 粒 子 近 似 球形［２］，寄 主 植 物 广 泛，主 要 侵 染 番 茄、烟 草、花 生、 辣椒、莴苣、大 豆 等 蔬 菜 作 物 和 数 以 千 计 的 观 赏 植 物 。 ［３－５］ 目前在世界多个国家 和 地 区 广 泛 分 布，在 夏 威夷，生 菜、番 茄 和 胡 椒 上 由 其 造 成 的 损 失 达 ６０％
辣 椒 （Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ．）品 种 为 ‘中 椒 ６ 号’，在 温 室 （２７±１）℃、相 对 湿 度 ７０％ ±５％、光 照 周期 Ｌ∥Ｄ＝１６ｈ∥８ｈ 条 件 下 培 养 至 ２～３ 片 真 叶 期 时 用 于 测 试 ，保 持 无 虫 为 害 状 态 。 １．２ 材 料 处 理
４１ 卷 第 ２ 期
赵 巍 巍 等 ：番 茄 斑 萎 病 毒 ４ 种 检 测 方 法 比 较
· １０９ ·
殖的方式传播［９］，其 中 西 花 蓟 马 是 其 最 有 效 的 传 播 载体。国外的许多 研 究 表 明，ＴＳＷＶ 总 是 伴 随 西 花 蓟马的暴发而 发 生。 自 ２００３ 年 西 花 蓟 马 在 北 京 首 次发现，目前已 分 布 于 山 东、广 东、云 南、广 西、西 藏 等 地 区 。 ［１０－１２］ 我 国 首 次 于 １９８４ 年 在 广 州 发 现 ＴＳＷＶ，并得到 其 分 离 物［１３］。２００６ 年，我 国 首 次 将 ＴＳＷＶ 列为全国农业植物检疫 性 有 害 病 毒［１４］，２００８ 年，在云南蝴 蝶 兰 上 检 测 到 ＴＳＷＶ［１５］，２００９—２０１０ 年，董 家 红 等 在 云 南 昆 明 的 多 个 地 区 检 测 到 ＴＳＷＶ［１６］，２０１２年广州检验检疫中心 首 次 在 美 国 进 境生菜种子 中 截 获 ＴＳＷＶ［１７］，李 飞 等 ２０１２ 年 在 北 京检测到 ＴＳＷＶ［１８］。自１９１５年首次 在 澳 大 利 亚 发 现 ＴＳＷＶ 到现 在 已 有 近 百 年 的 历 史［１９］，除 使 用 抗 病毒品种和对 传 播 介 体 进 行 防 治 外，预 防 该 病 毒 病 的发生也很重要。快速、准确地检测 ＴＳＷＶ 是预防 工作的重要前提。
收 稿 日 期 ： ２０１４－０７－０４ 修 订 日 期 ： ２０１４－１０－０９ 基金项目： 国家科技支撑计划（２０１２ＢＡＤ１９Ｂ０６）；北京市自然科学基金（６１２２０２８）；现代农业产业技术体系北京 市 叶 类 蔬 菜 创 新 团 队 建 设
专 项 资 金 （ｂｌｖｔ－１５）；北 京 市 科 委 课 题 （Ｚ１２１１００００１２１２００６）；蔬 菜 有 害 生 物 控 制 与 优 质 栽 培 北 京 市 重 点 实 验 室 ＊ 通信作者 Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｘｍ１９７２＠１２６．ｃｏｍ；ｗｕｑｉｎｇｊｕｎ＠ｃａａｓ．ｃｎ
番茄斑萎 病 毒 的 检 测 方 法 主 要 包 括 生 物 学 检 测 、电 子 显 微 镜 检 测 、血 清 学 检 测 以 及 分 子 生 物 学 检 测等技术。生物学检测依靠寄主植物上的典型症状 来 判 断 ，该 方 法 直 观 便 捷 ，但 对 于 其 他 具 有 类 似 症 状 的病毒 较 难 分 辨 。 ［２０］ 电 镜 检 测 可 以 直 接 观 察 病 毒 的形态结构以及病毒侵染寄主植物后所引起的植物 超微 结 构 变 化，是 一 种 最 直 接 的 观 察 工 具［２１］，但 该 方法对于病毒的分类和归属较难判定。血清学检测 是将免疫 反 应 和 酶 的 高 效 催 化 反 应 有 机 结 合 的 方 法，目前该方法 被 广 泛 用 于 植 物 病 毒 检 测［２２］。１９７７ 年，Ｃｌａｒｋ 和 Ａｄａｍｓ采 用 ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ 的 方 法 检 测 出 ＴＳＷＶ，ＩＮＳＶ 和 ＷＳＭＯＶ［２２］。 分 子 生 物 学 检 测 主要 包 括 常 规 ＰＣＲ、免 疫 捕 捉 ＲＴ－ＰＣＲ 和 ｑＲＴ－ ＰＣＲ［２３］。 分 子 生 物 学 检 测 灵 敏 度 高，Ｒｏｂｅｒｔｓ等 应 用 ｑＲＴ－ＰＣＲ 技 术 从 植 物 叶 片 总 ＲＮＡ 中 检 测 到 ＴＳＷＶ，灵敏度可达５００ｆｇ［２４］，２００２年，Ｂｏｏｎｈａｍ 等 利用 Ｔａｑ－Ｍａｎ的ｑＲＴ－ＰＣＲ 技术成功检测单头西花 蓟马成虫体内的 ＴＳＷＶ 病 毒 。 ［２５］ 不 同 方 法 在 使 用 成本、操作难易和灵敏度方面均存在差异 。 ［２６］
Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
番茄＊ ， 吴青君２＊
（１． 湖 南 农 业 大 学 农 药 研 究 所 ， 长 沙 ４１０１２８；２． 中 国 农 业 科 学 院 蔬 菜 花 卉 研 究 所 ， 北 京 １０００８１）
摘要 本研究根据番茄斑萎病毒（ＴＳＷＶ）Ｓ ＲＮＡ 上的核衣 壳 蛋 白（Ｎ）基 因 保 守 序 列 设 计 特 异 性 引 物 ，比 较 了 ４ 种 检测方法的灵敏度。结果表明，特异性引物可扩增出３９７ｂｐ的片段，序列和已发 表 的 ＴＳＷＶ 核 苷 酸 序 列 同 源 性 高 达９９％，可用于常规 ＰＣＲ 和荧光定量 ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）检测。ｑＲＴ－ＰＣＲ 的灵敏度比快速检测试纸条、双抗体夹 心酶联免疫吸附法（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）和常 规 ＰＣＲ 分 别 高 出 １５ ６２５ 倍、３ １２５ 倍 和 １２５ 倍，且 能 够 准 确 定 量；常 规 ＰＣＲ 灵敏度较高，但不能准确定量；ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ 方法适用于批量定性测定，但检测时间较长；试纸条法检测速度 最 快，但 灵 敏 度 最 低 ，使 用 时 可 根 据 症 状 程 度 和 试 验 条 件 选 择 适 宜 的 检 测 方 法 。 关键词 番茄斑萎病毒； ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ； 常规 ＰＣＲ； 快速检测试纸条； ｑＲＴ－ＰＣＲ； 灵敏度 中 图 分 类 号 ： Ｓ ４３２．４１ 文 献 标 识 码 ： Ａ ＤＯＩ： １０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９－１５４２．２０１５．０２．０１９
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｎ） ｇｅｎｅ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ （ＴＳＷＶ）Ｓ ＲＮＡ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＴＳＷＶ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａ ３９７ ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅ－ ｑｕｅｎｃｅ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ９９％ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ＴＳＷＶ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ （ｑＲＴ－ＰＣＲ）ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｑＲＴ－ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＴＳＷＶ ｗａｓ １５ ６２５ ｆｏｌｄ，３ １２５ ｆｏｌｄ ａｎｄ１２５ ｆｏｌｄ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐ （ＲＤＴＴ），ｄｏｕｂｌｅ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ （ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ，ｒｅ－ ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｑＲＴ－ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｂｅ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ．Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｓｅｎｓｉ－ ｔｉｖｉｔｙ，ｂｕｔ ｉｔ ｃａｎｎｏｔ ｂｅ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ．ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ ｉｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｂａｔｃｈ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｕｔ ｉｔ ｎｅｅｄｓ ａ ｌｏｎｇｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ．ＲＤＴＴ ｉｓ ｔｈｅ ｆａｓｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ，ｂｕｔ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ．Ｓｕｉｔａｂｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｃａｎ ｂｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｙｍｐｔｏｍ ｄｅｇｒｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｔｏｍａｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ； ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ； ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ； ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐ； ｑＲＴ－ ＰＣＲ； ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
ＰＣＲ ４ 种 方 法 检 测 番 茄 斑 萎 病 毒 的 灵 敏 度 ，旨 在 为 国 内 ＴＳＷＶ 的检验检疫提供快速、准确和灵敏的检测 技术，同时也为防控 ＴＳＷＶ 提供更好的技术支撑。
１ 材 料 与 方 法
１．１ 供 试 材 料 １．１．１ 病 毒
ＴＳＷＶ（ＴＳＷＶ－ＹＮ）病毒 毒 源 由 浙 江 省 农 科 院 植物保护与微 生 物 研 究 所 张 治 军 博 士 提 供，通 过 人 工摩擦的 方 法 接 种 于 曼 陀 罗 （Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ ） 上 活 体 保 存 ［２７］，然 后 再 转 接 到 试 验 寄 主 植 株 上 。 １．１．２ 植 物 材 料
近 年 来，随 着 我 国 进 出 口 贸 易 频 繁，存 在 ＴＳＷＶ 暴发的潜在威胁，常 规 ＰＣＲ 和 ｑＲＴ－ＰＣＲ 在 植物病毒检测 中 具 有 灵 敏 度 高、准 确 快 速 等 优 点 备 受青睐。本 研 究 针 对 ＴＳＷＶ 核 衣 壳 蛋 白 （Ｎ）基 因 保守序列 设 计 常 规 ＰＣＲ 和 ｑＲＴ－ＰＣＲ 新 的 特 异 引 物，并建立了适宜的反应体系和扩增程 序，同时比较 了快速 检 测 试 纸 条、ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ、常 规 ＰＣＲ 和 ｑＲＴ－
番 茄 斑 萎 病 毒 （Ｔｏｍａｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ， ＴＳＷＶ）是布 尼 亚 病 毒 科 （Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ），番 茄 斑 萎 病毒属（Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ）代 表 性 成 员［１］，病 毒 粒 子 近 似 球形［２］，寄 主 植 物 广 泛，主 要 侵 染 番 茄、烟 草、花 生、 辣椒、莴苣、大 豆 等 蔬 菜 作 物 和 数 以 千 计 的 观 赏 植 物 。 ［３－５］ 目前在世界多个国家 和 地 区 广 泛 分 布，在 夏 威夷，生 菜、番 茄 和 胡 椒 上 由 其 造 成 的 损 失 达 ６０％
辣 椒 （Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ．）品 种 为 ‘中 椒 ６ 号’，在 温 室 （２７±１）℃、相 对 湿 度 ７０％ ±５％、光 照 周期 Ｌ∥Ｄ＝１６ｈ∥８ｈ 条 件 下 培 养 至 ２～３ 片 真 叶 期 时 用 于 测 试 ，保 持 无 虫 为 害 状 态 。 １．２ 材 料 处 理
４１ 卷 第 ２ 期
赵 巍 巍 等 ：番 茄 斑 萎 病 毒 ４ 种 检 测 方 法 比 较
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殖的方式传播［９］，其 中 西 花 蓟 马 是 其 最 有 效 的 传 播 载体。国外的许多 研 究 表 明，ＴＳＷＶ 总 是 伴 随 西 花 蓟马的暴发而 发 生。 自 ２００３ 年 西 花 蓟 马 在 北 京 首 次发现，目前已 分 布 于 山 东、广 东、云 南、广 西、西 藏 等 地 区 。 ［１０－１２］ 我 国 首 次 于 １９８４ 年 在 广 州 发 现 ＴＳＷＶ，并得到 其 分 离 物［１３］。２００６ 年，我 国 首 次 将 ＴＳＷＶ 列为全国农业植物检疫 性 有 害 病 毒［１４］，２００８ 年，在云南蝴 蝶 兰 上 检 测 到 ＴＳＷＶ［１５］，２００９—２０１０ 年，董 家 红 等 在 云 南 昆 明 的 多 个 地 区 检 测 到 ＴＳＷＶ［１６］，２０１２年广州检验检疫中心 首 次 在 美 国 进 境生菜种子 中 截 获 ＴＳＷＶ［１７］，李 飞 等 ２０１２ 年 在 北 京检测到 ＴＳＷＶ［１８］。自１９１５年首次 在 澳 大 利 亚 发 现 ＴＳＷＶ 到现 在 已 有 近 百 年 的 历 史［１９］，除 使 用 抗 病毒品种和对 传 播 介 体 进 行 防 治 外，预 防 该 病 毒 病 的发生也很重要。快速、准确地检测 ＴＳＷＶ 是预防 工作的重要前提。
收 稿 日 期 ： ２０１４－０７－０４ 修 订 日 期 ： ２０１４－１０－０９ 基金项目： 国家科技支撑计划（２０１２ＢＡＤ１９Ｂ０６）；北京市自然科学基金（６１２２０２８）；现代农业产业技术体系北京 市 叶 类 蔬 菜 创 新 团 队 建 设
专 项 资 金 （ｂｌｖｔ－１５）；北 京 市 科 委 课 题 （Ｚ１２１１００００１２１２００６）；蔬 菜 有 害 生 物 控 制 与 优 质 栽 培 北 京 市 重 点 实 验 室 ＊ 通信作者 Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｘｍ１９７２＠１２６．ｃｏｍ；ｗｕｑｉｎｇｊｕｎ＠ｃａａｓ．ｃｎ
番茄斑萎 病 毒 的 检 测 方 法 主 要 包 括 生 物 学 检 测 、电 子 显 微 镜 检 测 、血 清 学 检 测 以 及 分 子 生 物 学 检 测等技术。生物学检测依靠寄主植物上的典型症状 来 判 断 ，该 方 法 直 观 便 捷 ，但 对 于 其 他 具 有 类 似 症 状 的病毒 较 难 分 辨 。 ［２０］ 电 镜 检 测 可 以 直 接 观 察 病 毒 的形态结构以及病毒侵染寄主植物后所引起的植物 超微 结 构 变 化，是 一 种 最 直 接 的 观 察 工 具［２１］，但 该 方法对于病毒的分类和归属较难判定。血清学检测 是将免疫 反 应 和 酶 的 高 效 催 化 反 应 有 机 结 合 的 方 法，目前该方法 被 广 泛 用 于 植 物 病 毒 检 测［２２］。１９７７ 年，Ｃｌａｒｋ 和 Ａｄａｍｓ采 用 ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ 的 方 法 检 测 出 ＴＳＷＶ，ＩＮＳＶ 和 ＷＳＭＯＶ［２２］。 分 子 生 物 学 检 测 主要 包 括 常 规 ＰＣＲ、免 疫 捕 捉 ＲＴ－ＰＣＲ 和 ｑＲＴ－ ＰＣＲ［２３］。 分 子 生 物 学 检 测 灵 敏 度 高，Ｒｏｂｅｒｔｓ等 应 用 ｑＲＴ－ＰＣＲ 技 术 从 植 物 叶 片 总 ＲＮＡ 中 检 测 到 ＴＳＷＶ，灵敏度可达５００ｆｇ［２４］，２００２年，Ｂｏｏｎｈａｍ 等 利用 Ｔａｑ－Ｍａｎ的ｑＲＴ－ＰＣＲ 技术成功检测单头西花 蓟马成虫体内的 ＴＳＷＶ 病 毒 。 ［２５］ 不 同 方 法 在 使 用 成本、操作难易和灵敏度方面均存在差异 。 ［２６］
