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番茄斑萎病毒属病毒检测技术研究进展
郑元仙;刘雅婷
【期刊名称】《云南农业大学学报》
【年(卷),期】2009(024)004
【摘要】番茄斑萎病毒属病毒属于布尼亚病毒科,是一类世界性分布、寄主范围很广的植物病毒,可引起许多重要的园艺植物和农作物的严重病害,造成严重的经济损失.而高效的病毒鉴定或检测技术是防治病毒病害的关键基础之一.因此,本文就近年来番茄斑萎病毒属病毒鉴定与检测技术的研究进展作一综述,介绍生物学技术、电
镜技术、血清学技术以及分子生物学技术在番茄斑萎病毒属病毒检测方法上的特点、发展应用方向等.
【总页数】7页(P607-613)
【作者】郑元仙;刘雅婷
【作者单位】云南农业大学,农学与生物技术学院,云南,昆明,650201;云南农业大学,农学与生物技术学院,云南,昆明,650201
【正文语种】中文
【中图分类】S432.41
【相关文献】
1.2014年云南番茄、辣椒上番茄斑萎病毒属病毒与传毒蓟马的发生特点 [J], 郑雪;陈永对;吴阔;张丽珍;苏晓霞;郑宽瑜;张洁;董家红;
2.2014年云南番茄、辣椒上番茄斑萎病毒属病毒与传毒蓟马的发生特点 [J], 郑雪;
陈永对;吴阔;张丽珍;苏晓霞;郑宽瑜;张洁;董家红
3.棕榈蓟马传播番茄斑萎病毒属病毒研究进展 [J], 侯海霞;刘永杰;于毅;张安盛
4.番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒研究进展 [J], 陈坤荣;许泽永;晏立英;王国平
5.番茄斑萎病毒检测技术研究进展 [J], 覃茜;张艳明;韦勇杰;罗清;谢振兴;於艳萍;;;;;;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
番茄斑萎病毒系统侵染我国大蒜宋晓宇;刘勇;陈建斌;史晓斌;张德咏【摘要】番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus (TSWV)是严重危害世界经济作物的一种病毒,寄主范围广泛.我们在研究中发现番茄斑萎病毒能侵染我国大蒜Allium sativum L..利用摩擦接种法将TSWV接种到健康大蒜上,结果显示:接种14 d后大蒜新生叶片出现褪绿和白色斑点症状.ELISA检测显示大蒜叶片汁液与TSWV的单克隆抗体产生血清学反应,采用TSWV N基因的引物对大蒜叶片总RNA进行RT-PCR,结果扩增出约800 bp的条带,在NCBI上BLAST显示与TSWV YN5576的同源性最高,为98.52％.这些数据表明番茄斑萎病毒系统侵染我国大蒜.【期刊名称】《植物保护》【年(卷),期】2019(045)003【总页数】4页(P149-151,173)【关键词】番茄斑萎病毒;大蒜;鉴定;RT-PCR【作者】宋晓宇;刘勇;陈建斌;史晓斌;张德咏【作者单位】湖南大学研究生院隆平分院,长沙410125;湖南大学研究生院隆平分院,长沙410125;湖南省农业科学院植物保护研究所,长沙410125;湖南大学研究生院隆平分院,长沙410125;湖南大学研究生院隆平分院,长沙410125;湖南省农业科学院植物保护研究所,长沙410125;湖南大学研究生院隆平分院,长沙410125;湖南省农业科学院植物保护研究所,长沙410125【正文语种】中文【中图分类】S436.33番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus(TSWV)属于番茄斑萎病毒科Tospoviridae, 番茄斑萎病毒属Orthotospovirus,是世界上最具经济危害性的十种病毒之一[1]。
TSWV病毒粒子为直径80～100 nm的球形[2],基因组由3个单链RNA组成,根据分子量的大小从大到小分别为 L RNA(8.9 kb)、 M RNA(4.8 kb)和S RNA(2.9 kb)[3-4]。
番茄斑萎病毒———一种值得重视的植物检疫病毒于 翠 杨翠云 印丽萍(上海出入境检验检疫局 200135)中图分类号 S41 番茄斑萎病毒(T o m a t o s p o t t e d w i l tv i r u s, T S W V)是布尼亚病毒科(B u n y a v i r i d a e)番茄斑萎病毒属(T o s p o v i r u s)的典型成员。
T S W V寄主范围广,可侵染35科900多种植物,在世界上多个国家和地区广泛分布,侵染烟草、大豆、番茄、花生、辣椒、莴苣和菊花、凤仙花等多种花卉后可产生严重危害甚至绝产,目前已成为全世界10种危害性最大的植物病毒之一。
除介体蓟马传播外,带毒种苗的国际贸易是T S W V远距离传播的主要方式,是我国进境植物检疫的危险性有害生物。
鉴于T S W V在全球范围内的危害日趋严重,有必要对该病毒的发生分布、危害症状、传播、检测和防治等方面做全面的了解,制定严格的检验检疫措施,有效地防止该病毒在我国的发生流行。
1 分布T S W V最早发现于澳大利亚[1],目前在欧洲、北美、南美、亚洲和大洋州等多个国家和地区广泛分布,温带、亚热带和热带地区均有发生。
2 危害与症状早在20世纪30年代,T S W V就被认为是农作物的重要病毒病原,在20世纪60～80年代,该病毒曾在欧美及非洲的烟草和番茄上大流行,每年的发病率为20%～50%,每年造成高达数10亿美元的损失。
在美国夏威夷、巴西、意大利和南非,T S W V 在20世纪80～90年代某些年份的流行曾导致番茄、莴苣等作物近乎绝产。
近几年,番茄斑萎病毒属病毒特别是T S W V已经成为世界范围内多种食物和观赏作物的经济损失上升的重要因子。
巴西、美国夏威夷和南非的发生率高到使农民放弃生产。
在某些年间,T S W V破坏夏威夷莴苣作物的50%～90%[2]。
T S W V曾在法国和西班牙的保护地和大田番茄、辣椒和银莲花中出现破坏性暴发,推测与介体西花蓟马的发生和急速扩展相关。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011038262.9(22)申请日 2020.09.28(71)申请人 中国农业科学院蔬菜花卉研究所地址 100081 北京市海淀区中关村南大街12号(72)发明人 于海龙 王立浩 张宝玺 张正海 曹亚从 冯锡刚 (74)专利代理机构 青岛鼎丞智佳知识产权代理事务所(普通合伙) 37277代理人 曲志乾(51)Int.Cl.C12Q 1/6895(2018.01)C12Q 1/6858(2018.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称一种辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记及其特异性引物和应用(57)摘要本发明提供了一种辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记及其特异性引物和应用，所述辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SNP标记为SEQ ID NO.1所示序列的第21位碱基。
本发明还提供了鉴定该SNP标记的特异性引物以及相应试剂盒，并提供了采用所述特异性引物或试剂盒对抗番茄斑点萎蔫病毒病的辣椒的鉴定方法。
采用本发明的SNP分子标记可不通过辣椒TSWV病抗性人工接种鉴定，只需在苗期对辣椒植株进行的DNA检测，就可以对辣椒TSWV病抗性基因进行快速而准确地判断，并且可对样品进行大批量检测，提高育种效率，缩短鉴定时间。
权利要求书1页 说明书6页序列表2页 附图3页CN 111961753 A 2020.11.20C N 111961753A1.一种辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，SEQ ID NO.1所示序列的第21位碱基为A或G。
2.一组如权利要求1所述的辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的SNP标记的特异性引物，其特征在于，包括分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述前引物A1、前引物A2和一条如SEQ ID NO.4所述的后引物。
![一种番茄斑萎属病毒核酸标准物质的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/9dae2b085ef7ba0d4b733b20.png)
专利名称：一种番茄斑萎属病毒核酸标准物质的制备方法专利类型：发明专利
发明人：李旻
申请号：CN202011579953.X
申请日：20201228
公开号：CN112553220A
公开日：
20210326
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种番茄斑萎属病毒核酸标准物质的制备方法。
本发明所涉及的病毒核酸标准物质由如下步骤制得：选择基因保守区为扩增靶标区；设计引物并合成；序列扩增；构建表达载体；体外转录；浓度测定并稀释；分装；检测定量。
利用本发明制备的标准物质具有稳定性，无生物传染性，适应范围广等特性，可利用反转录PCR以及荧光定量PCR在番茄斑萎属病毒的检测标准物质。
申请人：昆明海关技术中心
地址：650034 云南省昆明市西山区广福路359号
国籍：CN
代理机构：北京知汇林知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：董涛
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![检测番茄斑萎病毒感染的试剂盒及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/9903f2ff10a6f524cdbf85d4.png)
专利名称：检测番茄斑萎病毒感染的试剂盒及其应用
专利类型：发明专利
发明人：吴青君,赵巍巍,杨家强,张敏敏,徐宝云,谢文,王少丽,张友军
申请号：CN201310727288.8
申请日：20131225
公开号：CN103757132A
公开日：
20140430
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明“检测番茄斑萎病毒感染的试剂盒及其应用”，涉及植物病原检测技术。
其特征在于该技术中采用的引物如下：上游引物TSWV-F 5’-CAGGATTGGAGCCACCGACAT-3’；下游引物TSWV-R 5’-AGCATACTCTTTCCCTTTCT-3’。
本发明基于该核心提供了检测番茄斑萎病毒感染的试剂盒，以及该试剂盒在检测番茄斑萎病毒感染的应用。
采用本发明提供的方法和试剂盒，可以检测特定材料是否感染或携带番茄斑萎病毒，也可以针对特定作物或蔬菜种植区进行番茄斑萎病毒感染危害的预警，防治番茄斑萎病毒大面积传播造成的农业经济损失。
本发明的方法及试剂盒具有快速，易于实现，敏感可靠等优点，可在一天内完成多个待考察地区的检测或预警。
申请人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所
地址：100081 北京市海淀区中关村南大街12号
国籍：CN
代理机构：北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司
代理人：吴泳历
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doi ：10.19928/ki.1000-6346.2021.2025辣椒抗番茄环纹斑点病毒的种质资源筛选赵立华1 朱阳阳1，2 邱润霜1，2 李博文1，2 李 靖2* 董家红1，3*（1云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南省农业生物技术重点实验室，农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室，云南昆明 650233；2西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224；3云南中医药大学中药学院，云南昆明 650500）摘 要：番茄环纹斑点病毒（tomato zonate spot virus ，TZSV ）是严重危害辣椒、番茄和烟草等经济作物的番茄斑萎病毒科病毒，选育抗病品种是防治TZSV 的重要途径之一。
本试验采用室内摩擦接种、病情指数调查、间接酶联免疫吸附法（ID -ELISA ）对40个辣椒栽培品种进行TZSV 抗性评价。
结果表明，丰达108、海南黄灯笼椒对TZSV 表现为抗病（R ）；大果灯笼椒表现为感病（S ）；其余37个品种表现为高感（HS ）。
关键词：辣椒；番茄环纹斑点病毒；抗性鉴定；种质筛选；血清学检测等，2008；Dong et al.，2013）。
目前，TZSV 在云南红河、文山、石林等地对辣椒、番茄、烟草、花卉等作物造成严重经济损失。
病毒病是辣椒栽培生产上的主要病害，危害严重的主要病毒有番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus ，TSWV ）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus ，TMV ）、马铃薯Y 病毒（potato virus Y ，PVY ）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus ，CMV ）、番茄褪绿病毒（tomato chlorosis virus ，ToCV ）、番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus ，TYLCV ）等近50种病毒（郭思瑶 等，2015）。
由辣椒番茄斑萎病毒引发的思考作者：李明远来源：《农业工程技术·温室园艺》2020年第03期2019年9月25日笔者到北京某蔬菜基地考察，据管理人员介绍，在一栋面积约952 m2温室的尖椒上见到一种“新病”，希望我给诊断一下。
进到温室我看到一些定植不久的辣椒（育苗期8月中旬）。
有些植株的上部叶发浅、皱缩，有些叶片还生密集枯斑或局部枯死（图1），其中，有的植株茎的一侧下陷。
我将它带到实验室，用解剖镜进行了观察，没有发现虫子或病原菌。
但是发现扁的茎的皮层断面呈现水浸状，好像有些坏死（图2）。
初步认为这些枯叶与皮层坏死相关。
但是，仅茎皮层坏死，在没有发现病原时，仍不能区分是生理病害还是侵染性病害。
于是将采回来的病株存入冰箱，想再请栽培方面的专家给看看，但是几位专家看后也都说不出所以然。
只好请该基地的技术人员配合，继续观察这种情况是否传播和发展。
如果不传播、发展，有可能是在定植时茎部受到不良环境伤害所致。
10月16日，为了解病害发生的情况我又去了该基地，仔细地观察了这棚辣椒的发病情况。
发现这10多天来病株明显增多，几乎每垄都有几棵病株。
为掌握病情我在该温室共调查了3个点，第一个点104株，其中有病株31株，即病株率为29%;第二个点78株，有病株36株，发病率为46%;第三个点78株，有病株21个，发病率为26%;平均发病株率33.67%。
此外，病株在病情上也比上次严重多了。
其特点一是植株一旦发病都是整株性的，一棵病株一般仅下部有几片正常叶，越往上部叶片越发黄，枯斑越多（图3）;二是植株明显矮化，严重的病株仅有健株的一半高（图4）;三是黄叶上还有环斑及褪绿斑驳的枯死斑（图5、图6）;四是花蕾枯死，即在病株上没有果实，仅看到很多枯死的花蕾及落蕾（图7）。
综合这几个特点，都说明在辣椒病株上看到的是典型的病毒病。
这么严重的病毒病在辣椒上真的很少见到。
这时我想到首先应排除一下辣椒番茄斑萎病毒（TSWV），这种病毒是由蓟马传播的，调查一下育苗棚和发病棚是否有蓟马就可以知道是不是这种病毒了。
青蒿中番茄斑萎病毒和烟草花叶病毒的分子鉴定及相关序列分析钟静;李婷婷;韩天华;李学卫;尹跃艳;陈越;马文广;丁铭【期刊名称】《植物保护》【年(卷),期】2024(50)1【摘要】番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus, TSWV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)是2种重要的植物病原病毒,对多种经济作物的产量和品质均造成严重影响。
2021年-2022年,在云南省丽江市烟草种植区不同烟区采集叶片黄化、皱缩以及无症状的青蒿Artemisia caruifolia样品共计14份,利用免疫金标速测卡和RT-PCR对其病原病毒进行检测。
利用免疫金标速测卡检测结果显示,在所检样品中有9份样品检测出TSWV,检出率为64.28%,有3份样品检测出TMV,检出率为21.43%,2种病毒复合侵染的检出率同样为21.43%;利用RT-PCR 对复合侵染的3份样品进行分子检测,结果显示,在3份复合侵染青蒿样品中获得3条TSWV N基因序列、3条TMV cp基因序列和2条TMV RdRp部分序列。
TSWV青蒿分离物与分离自云南的TSWV-2分离物相似性最高,为99.6%;TMV青蒿分离物与分离自辽宁的TMV-Shenyang分离物和分离自云南的TMV-Yongren-1相似性最高,均大于99.4%。
这是首次发现TSWV和TMV 2种不同属病毒复合侵染青蒿。
【总页数】12页(P244-255)【作者】钟静;李婷婷;韩天华;李学卫;尹跃艳;陈越;马文广;丁铭【作者单位】云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所;云南省烟草公司丽江市公司;云南省农业科学院高山经济植物研究所【正文语种】中文【中图分类】S435.72【相关文献】1.黑龙江地区番茄斑萎病毒的鉴定及其部分生物学特征分析2.北京地区侵染菊花的番茄斑萎病毒分子检测与基因组部分序列分析3.宁夏银川地区番茄斑萎病毒和南方番茄病毒复合侵染分子鉴定4.云南辣椒正番茄斑萎病毒属病毒的分子鉴定5.菊花上番茄斑萎病毒的血清学检测及分子鉴定因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
番茄斑萎病毒病综述摘要：番茄斑萎病毒病的病原是番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus),简称TSWV，属病毒。
番茄斑萎病毒病以前主要发生在热带，近些年温带也有发生，在我国成都、渡口已有发病记载。
这种病近两三年来发展很快，逐渐蔓延。
此文对TSWV 的特点、诊断方法及其防治措施进行了整理。
Pick to：Tomatoes spot of virus disease pathogens is atelectatic tomato spot accumulation of virus,Hereinafter referred to as TSWV.Tomatoes spot before collapsing virus disease occurs mainly in the tropical and temperate also have occurred in recent years, our country has been in chengdu, ferry the records.This kind of illness for two or three years developing very quickly, and gradually spread. This article TSWV to the characteristics, diagnosis methods and their prevention measures were summarized.关键词：番茄斑萎病毒；流行；防治；生物特性；症状Keywords: tomatoes spot withering virus; Popular; Control; Biological characteristics; symptoms一、病原特征番茄斑萎病毒病的病原是番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus),简称TSWV，属病毒。
番茄斑萎病毒系统侵染我国大蒜
近日，据中国农业科学院植物保护研究所的研究团队发现，番茄斑萎病毒已经侵染我
国的大蒜，引起了业内的普遍关注。
番茄斑萎病毒是一种单股RNA病毒，主要寄生在茄科、豆科等植物的细胞内。
其主要
症状表现为叶片上出现黄色斑块，后期叶片开始变薄，凋萎、死亡。
对于感染植株的影响
极大，不仅影响了植株长势和产量，还严重影响了果蔬品质和安全。
据研究人员介绍，他们在我国长江流域等地发现了众多大蒜植株出现了类似症状，对
其进行了进一步病原学、分子生物学、病害学研究，并通过高通量测序技术确定了病毒性
病原体名称。
此外，研究团队还对近年来我国大蒜病害的调查情况进行了系统总结，发现大蒜现已
受到多种重要病害的侵扰，其中涉及病毒性、真菌性、细菌性等多种病原微生物，这给我
国大蒜的生产和质量安全带来了严峻挑战。
对此，业内专家认为，解决大蒜离不开科技创新。
当前国内多家企业正在探索利用先
进的光合作用技术、遗传编辑等方法对大蒜的种植和养护进行优化，助力生产与质量的提升。
而在病害防控方面，则需要采用多种策略，例如加强物种鉴定和病虫害防治技术研发，加强生物安全防范等，建立更加完善的病害监测预警和防控体系。
总之，番茄斑萎病毒的侵染表明了我国大蒜病害防治工作任重道远，需要行业内外的
持久努力和全面合作才能实现更稳健、健康的大蒜生产。
辣椒、番茄细菌性疮痂病及生理小种鉴定
孙福在;杜志强;焦志亮;赵廷昌;程伯瑛
【期刊名称】《植物病理学报》
【年(卷),期】1999(29)3
【摘要】近３年，从北京、山西、内蒙、新疆和云南等地的辣椒和番茄病株上分离到１９个菌株，经致病性测定和细菌学鉴定，确定这１９个菌株为甘蓝黑腐黄单胞菌疮痂致病变种（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ（Ｄｏｉｄｇｅ）Ｄｙｅ，１９７８）。
供试１９个菌株在国内首次采用国际标准鉴别寄主进行了生理小种鉴定。
其中，３个菌株为番茄小种１（ＸｃｖＴｒａｃｅ１），仅存在于北京地区，其它１６个菌株均属于辣椒－番茄小种３（ＸｃｖＰＴｒａｃｅ３），分布广，为我国优势小种。
【总页数】5页(P265-269)
【关键词】细菌性疮痂病;辣椒;生理小种;番茄;鉴定
【作者】孙福在;杜志强;焦志亮;赵廷昌;程伯瑛
【作者单位】植物病虫害生物学国家重点实验室中国农业科学院植物保护研究所【正文语种】中文
【中图分类】S436.412.1;S436.413.1
【相关文献】
1.云南番茄细菌性疮痂病病原菌鉴定及其生防研究 [J], 张海燕;张小芳;刘雅婷;周丽洪;杨云丽;姬广海
2.辣椒和甜椒品种抗细菌性疮痂病鉴定 [J], 孙福在;赵廷昌;张宝玺
3.鄂西高山地区辣椒细菌性疮痂病生理小种鉴定 [J], 李宁;姚明华;王飞
4.新疆番茄细菌性疮痂病的病原鉴定 [J], 李春;金潜
5.山东番茄细菌性疮痂病研究：病原鉴定及品种抗病性测定 [J], 丁爱云;于洪水因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重庆市辣椒TMV和CMV的鉴定林清;吕中华;黄任中;黄启中;雷蕾;史思茹【期刊名称】《中国蔬菜》【年(卷),期】2001(000)003【摘要】1997～1999年在重庆市郊辣椒产区采集病毒病标样162个，采用生物学鉴定、血清学鉴定及稳定性试验进行检测，结果表明，重庆市辣椒病毒病主要由CMV和TMV复合侵染所致，其检出率分别为79.0 %和54.2 %。
TMV单独为害检出率较低(7.5 %)，CMV单独侵染的频率较高(32.3 %)。
%In 1997～1999，162 pepper samples with typical virus symptoms collected from fields in Chongqing were identified by the diagnostic hosts，stability tests and indirect ELISA. The result showed that the pepper virus diseases were mainly caused by complex infection of TMV and CMV. The infecting percentage of CMV and TMV were 79.0 % and 54.2 % respectively. CMV and TMV are the predominant causal viruses of pepper crop in Chongqing area. TMV infected pepper indepedently with 7.5 % and CMV with32.3 %.【总页数】3页(P13-15)【作者】林清;吕中华;黄任中;黄启中;雷蕾;史思茹【作者单位】重庆市农业科学研究所;重庆市农业科学研究所;重庆市农业科学研究所;重庆市农业科学研究所;重庆市农业科学研究所;重庆市农业科学研究所【正文语种】中文【中图分类】S6【相关文献】1.广州市郊及其邻近地区辣椒CMV和TMV的鉴定 [J], 饶雪琴;蓝翠钰2.双抗TMV+CMV辣椒转基因工程植株的再生及抗病毒鉴定 [J], 毕玉平3.辣椒苗期接种CMV和TMV相关生理生化指标变化的研究 [J], 邓稳桥;王安乐;林佳福;柳蓉4.辣椒苗期抗CMV和TMV鉴定与田间成株抗病性相关分析 [J], 钱芝龙;袁彩尧;孙洁波;丁犁平;赵华仑5.辣椒对TMV,CMV抗病性的配合力分析 [J], 陈启林;巩振辉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
园艺学报，2017，44 (3)：487–494.Acta Horticulturae Sinicadoi：10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0733；http：//www. ahs. ac. cn 487重庆辣椒上番茄斑萎病毒的血清学检测及分子鉴定孙淼1，荆陈沉1，楚成茹1，吴根土1，孙现超1，谢艳2，刘勇3，青玲1,*（1西南大学植物保护学院，重庆 400716；2浙江大学农业与生物技术学院，杭州 310058；3湖南省植物保护研究所，长沙 410125）摘 要：为明确重庆地区辣椒上番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）的发生情况及其外壳蛋白基因（cp）序列变异特征，采用斑点免疫杂交法（Dot-ELISA）和反转录PCR（RT-PCR）技术对采自重庆的298份辣椒病毒病样品进行了检测和分子鉴定。
Dot-ELISA检测结果表明，有40份辣椒样品检测到TSWV，检出率为13.42%。
通过电子显微镜在TSWV检测呈阳性的样品中观察到具包膜的球状病毒粒体。
设计扩增TSWV cp的引物，选取6个TSWV阳性样品进行RT-PCR扩增，均扩增到大小约750 bp的目的片段。
序列分析表明，重庆辣椒分离物TSWV-CQ（KX611497）与已报道的22个TSWV分离物cp基因的核苷酸相似性为96.1% ~ 99.4%，与已报道的TSWV中国分离物亲缘关系较近，表现出明显的地理相关性。
关键词：辣椒；番茄斑萎病毒；Dot-ELISA；RT-PCR中图分类号：S 641.3 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2017）03-0487-08Serological Detection and Molecular Identification of Tomato spotted wilt virus in Pepper in ChongqingSUN Miao1，JING Chenchen1，CHU Chengru1，WU Gentu1，SUN Xianchao1，XIE Yan2，LIU Yong3，and QING Ling1,*（1College of Plant Protection，Southwest University，Chongqing 400716，China；2College of Agriculture and Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China；3Institute of Plant Protection，Hunan Province，Changsha 410125，China）Abstract：To identify the occurrence and variation of the coat protein gene（cp）of Tomato spotted wilt virus（TSWV）in pepper in Chongqing，a total of 298 diseased pepper samples were collected and subjected to the detection of Dot-ELISA with specific antiserum of TSWV and RT-PCR with specific primers. Results of Dot-ELISA detection revealed that 40 samples were positive with a detection ratio of 13.42%. Typical enveloped spherical particles were observed in the TSWV-positive samples through electron microscopy.Six positive samples were randomly selected and amplified by RT-PCR with primers specific收稿日期：2016–12–12；修回日期：2017–02–16基金项目：重庆市社会民生科技创新专项（cstc2016shmszx0420）；国家公益性行业（农业）科研专项（201303028）* 通信作者Author for correspondence（E-mail：qling@）致谢：感谢云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所张仲凯研究员和丁铭研究员在病毒粒体电镜观察中给予的指导和帮助。
Sun Miao，Jing Chenchen，Chu Chengru，Wu Gentu，Sun Xianchao，Xie Yan，Liu Yong，Qing Ling.Serological detection and molecular identification of Tomato spotted wilt virus in pepper in Chongqing. 488Acta Horticulturae Sinica，2017，44 (3)：487–494. for the cp gene of TSWV，and results revealed that an approximate750 bp fragment was obtained in each sample. Sequencing showed that cp gene of the isolate TSWV-CQ（KX611497）shared 96.1% to 99.4% identities with those of the other 22 previously reported TSWV isolates. Phylogenetic analysis showed that the isolate TSWV-CQ was most closely related to TSWV isolates of China and suggested that geographical selection force played a role in virus evolution.Keywords：pepper；Tomato spotted wilt virus；Dot-ELISA；RT-PCR番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）典型成员（Adkins，2000；Margaria et al.，2014）。
由于其危害严重，位居世界十大重要植物病毒排名第2位（Scholthof et al.，2011）。
TSWV通过蓟马传播，可在蓟马体内复制增殖（Ullman et al.，2005）。
TSWV的寄主范围广泛，可侵染包括烟草、大豆、番茄、花生、辣椒、莴苣、菊花和凤仙花等82科1 000多种植物（Parrella & Marchoux，2003；Timmerman-Vaughan et al.，2014），已在亚洲、美洲、非洲和欧洲等多个国家和地区造成不同程度的危害（Soler et al.，2003；Massumi et al.，2007；Sivparsad & Gubba，2011；Lian et al.，2013；French et al.，2016；Zhang et al.，2016）。
近年来在对重庆辣椒病毒病开展调查时发现部分辣椒产区有疑似受TSWV侵染的症状。
为确定重庆辣椒产区是否受TSWV危害，本研究利用TSWV的特异性血清和引物，采用斑点免疫杂交法（Dot-ELISA）和反转录PCR（RT-PCR）技术，对采自重庆市14个区县的298份辣椒病毒病样品进行了检测。
1 材料与方法1.1材料2013—2015年分别从重庆市北碚、巫山、巫溪、万州、彭水、武隆、永川、合川、涪陵、秀山、铜梁、石柱、九龙坡和丰都等14个区县采集了共298份辣椒病毒病叶片样本，于–80 ℃冰箱保存。
TSWV的单克隆抗体由浙江大学生物技术研究所周雪平教授惠赠。
大肠杆菌Escherichia coli DH5α菌株为西南大学植物病毒实验室保存。
根据GenBank中已登录的TSWV分离物Pujol1TL3的核苷酸序列（KP008131），利用DNAMAN 软件设计扩增cp基因的引物TSWV-CPo-F：5′-ATGTCTAAGGTTAAGCTCACTA-3′和TSWV-CPo-R：5′-AGCAAGTTCTGCGAGTTTTGC-3′。
扩增目的片段大小777 bp。
引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。
1.2 Dot-ELISA检测及病毒粒体电子显微镜观察Dot-ELISA检测参考郭思瑶等（2015）报道的方法。
以健康的辣椒叶片作为阴性对照，以云南省农业科学院生物技术研究所丁铭研究员提供的受TSWV侵染的辣椒叶片作为阳性对照。
参照郑宽瑜等（2015）报道的方法，对Dot-ELISA检测呈阳性的样品叶片组织进行电镜观察。
1.3病毒总RNA的提取与RT-PCR扩增参照郭思瑶等（2015）报道的方法提取总RNA，于–80 ℃冰箱保存备用。
孙淼，荆陈沉，楚成茹，吴根土，孙现超，谢艳，刘勇，青玲.重庆辣椒上番茄斑萎病毒的血清学检测及分子鉴定.园艺学报，2017，44 (3)：487–494. 489参照郭思瑶等（2015）报道的方法对提取的总RNA进行反转录，以合成的cDNA为模板进行PCR扩增。
反应体系为：2× Taq PCR MasterMIX（含Taq DNA Polymerase 0.05 U · L-1，MgCl2 4 mmol · L-1，dNTPs 0.4 mmol · L-1）12.5 μL，上游引物（10 μmol · L-1）1 μL，下游引物（10 μmol · L-1）1 μL，cDNA 1 μL，加ddH2O至25 μL。
PCR反应程序：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次，72℃延伸10 min。
取5 μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4克隆、测序与序列分析上述PCR产物纯化后克隆至pGEM-T载体，经菌液鉴定后委托华大基因科技有限公司进行序列测定。
利用DNAStar软件（Burland，2000）对所获得的基因序列进行处理，利用 BLAST 程序进行序列相似性搜索，并用DNAStar MegAlign程序的Clustal W方法与GenBank已登录的病毒核苷酸序列进行多序列比较分析，采用MEGA 5.0（Tamura et al.，2011）的邻接法（neighbor joining，NJ）构建进化树，重复次数设置为1 000次。
