EMS诱变

EMS诱变的原理及应用引言EMS（Electromagnetic Shaping）是一种通过电磁场对材料进行塑性变形的技术，可以应用于材料的微结构研究、制造和材料性能的调控。

本文将介绍EMS诱变的原理以及其在材料科学领域的应用。

EMS诱变的原理EMS诱变是利用瞬时高强度脉冲电磁场对材料进行塑性变形的一种方法，其原理基于材料的塑性变形特性以及电磁场的作用。

1.材料塑性变形特性材料的塑性变形是指在超过其屈服强度后，材料开始发生可逆的形变。

在材料进行塑性变形时，晶体的结构会发生变化，从而改变材料的微观结构。

2.电磁场的作用 EMS诱变利用瞬时高强度脉冲电磁场对材料进行塑性变形。

当电磁场施加到材料上时，其会引起电流的流动，产生感应力。

这种感应力可以使材料发生塑性变形，从而实现对材料的控制。

EMS诱变的应用EMS诱变技术在材料科学领域有着广泛的应用。

以下列举了一些常见的应用场景：1.材料微结构研究： EMS诱变技术可以用于研究材料的微观结构。

通过控制电磁场的强度和参数，可以实现对材料晶体结构的定向控制，从而得到更加理想的微观结构。

2.材料制造： EMS诱变技术在材料制造中也有着重要的应用。

通过定向控制材料的塑性变形，可以实现对材料形状的调控和微细结构的优化，从而提高材料的性能。

3.材料性能调控：EMS诱变技术可以通过塑性变形来调控材料的性能。

通过对材料施加适当的电磁场，可以改变材料的晶体结构和性质，从而实现对材料性能的调控，如增强材料的硬度、强度等。

4.新材料开发： EMS诱变技术可以应用于新材料的研发和开发。

通过控制电磁场的强度和参数，可以实现对新材料的形状和微细结构的调控，以满足特定的应用需求。

结论EMS诱变技术是一种通过电磁场对材料进行塑性变形的技术，在材料科学领域具有广泛的应用前景。

通过对材料的定向控制，可以实现对材料性能和微观结构的调节，从而满足不同领域的需求。

随着该技术的不断发展和完善，相信EMS诱变技术将在材料科学研究和工业制造中发挥重要的作用。

文章编号：1673-887X(2023)02-0081-03EMS化学诱变技术在新疆耐盐碱甜高粱培育中的应用艾斯坎尔·买提尼牙孜，刘翔宇，艾尼瓦尔·阿不都拉，徐彦军，阿力木·阿不迪力木（新疆农业科学院吐鲁番农业科学研究所，新疆维吾尔自治区吐鲁番838000）摘要文章总结了EMS化学诱变用于耐盐碱甜高粱的培育可行性，剖析了EMS化学诱变机制，研究EMS化学诱变技术在耐盐碱甜高粱培育中的应用，首先利用EMS化学诱变剂对甜高粱种子进行化学诱变，并创建突变体库。

然后将这些突变体在新疆重度盐碱地种植，并通过耐盐碱指标鉴定和筛选耐盐碱甜高粱突变体，从而可以实现耐盐碱甜高粱的培育。

关键词耐盐碱；EMS化学诱变技术；甜高粱；培育方法中图分类号Q93文献标志码A doi:10.3969/j.issn.1673-887X.2023.02.024Application of EMS Chemical Mutagenesis Technology in Cultivation of Saline-alkali TolerantSweet Sorghum in Xinjiang Uygur Autonomous RegionIskaner•Maitinyazi,Liu Xiangyu,Enivar•Abdurah,Xu Yanjun,Almur•Albudrilmur(Turpan Institute of Agricultural Sciences,Xinjiang Academy of Agricultural Sciences,Turpan838000,Xinjiang Uygur Autonomous Region,China)Abstract：This paper summarized the feasibility of EMS chemical mutagenesis for saline-alkali resistant sweet sorghum cultivation, analyzed the mechanism of EMS chemical mutagenesis,and studied the application of EMS chemical mutagenesis technology in sa‐line-alkali resistant sweet sorghum cultivation.First,sweet sorghum seeds were chemically mutagenic by EMS chemical mutagens and a mutant library was established.Then,these mutants were planted in severe saline-alkali soil in Xinjiang,and the saline-alkali resistant sweet sorghum mutants were identified and screened by saline-alkali tolerance indexes,so as to realize the cultivation of sa‐line-alkali resistant sweet sorghum.Key words：salt and alkali resistance,EMS chemical mutagenesis technology,sweet sorghum,cultivation method盐分是影响植物生长和产量的重要环境因子，现阶段我国对土壤盐渍化的改良方式是以水作为条件，在配备完整的灌、排系统内使用大量的水资源灌溉空地，达到排碱去盐的效果，这种模式虽然能够在短期内保证作物的产量，但该方法的用水量过大，且大量用水会造成经济浪费，影响生态的良性循环。

EMS玉米花粉诱变及根系突变体筛选的开题报告题目：EMS玉米花粉诱变及根系突变体筛选一、研究背景EMS是一种强效的诱变剂，可在一定程度上增加植物的遗传变异性，创造许多对植物育种有用的突变体。

玉米是世界上最重要的粮食作物之一，通过EMS诱变可以改变玉米植株的形态、生长和抗逆性等性状，进而提高玉米产量和品质。

二、研究内容和目的本研究旨在应用EMS诱变玉米花粉和根系，筛选出具有重要农艺性状变异的突变体，以期为玉米育种提供新的遗传资源。

具体研究内容包括：1.采集玉米花粉，利用EMS进行诱变处理，筛选出具有明显花部形态和花期改变的突变体；2.利用EMS处理玉米种子，种植后进行根系形态和生长性状等方面的观察和分析，筛选出具有明显根系形态和生长性状改变的突变体；3.对筛选出的突变体进行生理生化和分子生物学等方面的研究，探讨其遗传变异的机制。

三、研究方法1.玉米花粉诱变：选取健康的玉米穗，待玉米丝变黄后切割下方的花穗，将花穗置于含有不同浓度EMS 的溶液中进行诱变处理，分别选取无明显病害和形态异常的玉米胚珠进行培育，筛选出具有明显花部形态和花期改变的突变体。

2.玉米根系诱变：将玉米种子浸泡在含有不同浓度EMS的溶液中，待种子吸收充分后种植于培养皿中，在不同生长阶段对根系形态和生长性状等方面进行观察和分析，筛选出具有明显根系形态和生长性状改变的突变体。

3.生理生化和分子生物学研究：对筛选出的突变体进行生理生化和分子生物学方面的研究，探讨其遗传变异的机制。

四、预期结果和意义本研究通过EMS诱变玉米花粉和根系，筛选出具有重要农艺性状变异的突变体，为玉米育种提供新的遗传资源，并为揭示植物诱变机制提供参考。

此外，还可以通过对突变体的分子标记和遗传定位等研究，挖掘出与对玉米生长和产量影响较大的基因，并为后续玉米基因功能研究提供重要的启示和资料。

EMS诱变步骤：
原生质体诱变时，buffer里要加15%的蔗糖、平板为R6；
孢子诱变时，需要在TSB预萌发
原生质体原液：109个/ml OK
稀释缓冲液：pH7.2 0.1M 磷酸缓冲液+15%蔗糖（过滤灭菌） OK
终止液:5%硫代硫酸钠+15%蔗糖溶液（过滤灭菌） OK
平板：R6 OK
消毒液：20%硫代硫酸钠溶液 OK
EMS 原液： OK
致死率：不同诱变条件下的致死率，从平板计数可直接得出
突变率：（1）表型多样性：再生后直接观察计数
（2）产量分布：需将各致死率下的克隆发酵，统计产量分布
甲基磺酸乙酯 Ethyl methylsulfonate
分子式: C3H8O3S; 分子量: 124.16, 沸点: 85-86℃
性质描述: 无色透明油状液体
相对密度1.1452 (10M/L)
溶于乙醚、乙醇、氯仿，微溶于水
终止液: 1M NaOH, 20% w/v Na2S2O3。

EMS诱变加工番茄早熟突变体的筛选及鉴定引言：加工番茄是一种重要的农产品，其果实在食用和加工过程中具有丰富的营养价值和经济价值。

然而，传统品种的生长周期长，果实成熟时间较晚，影响了其种植和产量。

因此，通过诱变技术培育早熟性番茄突变体，对提高加工番茄的生产效益具有重要意义。

本文通过EMS诱变方法进行了加工番茄早熟突变体的筛选与鉴定探究。

材料与方法：1.材料本探究选用晚熟的加工番茄品种A作为亲本，使用EMS诱变剂进行诱变处理。

其他培育基和试剂均为常用试剂。

2.EMS诱变将成熟的番茄果实收集后，用10g/L浓度的EMS诱变剂进行浸泡处理，处理时间为8小时，并用纯净水清洗3次，以去除残留的EMS。

将处理后的果实播种在培育基中，培育条件设置为25℃、湿度60-70%，光照周期12小时白天和12小时夜晚。

3.筛选与鉴定对以EMS诱变后的种子进行筛选和鉴定，主要通过以下几个步骤：- 筛选：将诱变后的种子进行萌发筛选，选择具有早熟表型特征的幼苗，以作为筛选突变体的目标。

- 鉴定：将筛选出的突变体种植至足够大小，并观察其生长发育、果实成熟时间等指标与亲本进行对比。

结果与谈论：通过EMS诱变后，我们获得了一些具有早熟性状的加工番茄突变体。

这些突变体的生长发育与亲本相比有所差异，主要表此刻叶片形态、植株高度和果实大小等方面。

同时，与亲本相比，突变体果实成熟时间提前了约7-10天。

通过对突变体进行进一步的观察和鉴定，发现突变株的早熟性状相对稳定，并且其果实的品质和风味与亲本没有明显差异。

结论：本探究通过EMS诱变方法成功筛选出了一些具有早熟性状的加工番茄突变体。

这些突变体具有较早的果实成熟时间，有望提高加工番茄的生产效益。

此外，对突变体进行的鉴定也证明了其早熟性状的相对稳定性和果实品质的优良性。

这些结果为加工番茄的品种改良和育种提供了理论依据和试验基础。

进一步探究可以包括对突变体的遗传、分子机理和营养成分等方面进行深度探究，以更好地理解和利用这些早熟性状突变体。

EMS突变体致变基因鉴定在植物遗传学研究中，研究者除了采用传统的正向遗传学手段外，反向遗传学也得到广泛应用。

采用各种物理或化学突变，导致遗传物质发生突变，进而根据突变性状来研究变异基因的生物学功能。

在众多的致突变手段中，EMS突变技术由于导致的突变多为单碱基突变，且遵循C>T突变规律，在近代遗传学研究中得到广泛的应用。

常规的对突变基因的鉴定多采用建立F2连锁群体，通过分子标记进行图位克隆，研究的周期长、工作量大且过程繁琐。

随着高通量测序技术的快速发展，实现了在短期时间内获得植物的基因组信息，为研究突变体的突变基因的鉴定提供了一条新的研究途径。

根据对研究材料中突变基因的信息不同可以分为两种策略：方案一：对于已经比较纯合的突变体植株，可以直接对野生型植物和突变体植株进行深度测序，通过对野生型和突变体中的变异信息的分析，直接对导致表型的致变位点进行鉴定。

方案二：对于没有初步定位突变位点信息的材料，可以对突变植株的自交F2后代中，选择具有突变表型的植株进行混合测序，突变位点在混合群体中应该处于高度纯合而极低的杂合度，因此通过对全基因组中位点进行扫描，从而定位到突变位点。

该方法特别适合于大量突变体的鉴定，可以同时鉴定大量的株系，且群体建立方法简便，工作量低。

变位点，并定位突变基因，然后对可能的突变基因的表达进行检测。

方案二：如果没有定位信息，可以将多株具有突变表型的F2个体的DNA按等量混合，并进行低深度（30X）测序，即可减少工作量又可降低测序成本。

由于EMS诱变F2代中具有表型的多为隐性纯合突变，突变基因所在区间为纯合子，为了减少假阳性出现，结合分析该区间的杂合度综合分析，获得突变位点后在扩大样品群体中进一步验证，即可定位导致突变表型的位点和基因。

水稻、拟南芥、玉米等重要模式和粮食作物已经完成了基因组的完整测序，为基于高通量测序技术的突变基因的鉴定奠定了丰富的资源基础。

该方案的实施将为加快作物突变体的鉴定具有重要的推动作用，并为作物功能基因组研究提供了一种高效、便捷的技术手段。

安徽农学通报2023年19期经济作物作者简介高翠兰（1987—），女，安徽太和人，硕士，讲师，从事中职农艺专业教学工作。

收稿日期2023-07-07EMS 诱变处理对阜阳恋思萝卜种子萌发的影响高翠兰（阜阳农业学校，安徽阜阳236064）摘要阜阳恋思萝卜是安徽阜阳地方特色品种，近年来该品种退化严重，品质参差不齐，亟须改善。

甲基磺酸乙酯（EMS ）被广泛用于常见作物的诱发突变育种，本试验用不同浓度的EMS （0、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％）对阜阳恋思萝卜进行浸种处理，处理时间分别为4、6和8h ，研究EMS 对阜阳恋思萝卜种子发芽势、发芽率诱变效应。

试验结果表明，随着EMS 浓度（0.2%~0.8%）的增加，阜阳恋思萝卜种子发芽率呈下降趋势，抑制作用明显，在同一EMS 浓度下，随着处理时间的增加，阜阳恋思萝卜种子的发芽率呈降低趋势，且萌发时间延迟。

本试验确定EMS 处理阜阳恋思萝卜种子的适宜浓度为0.6%，处理时间为6h 。

关键词EMS 诱变；阜阳恋思萝卜；种子萌发中图分类号S631.1文献标识码A文章编号1007-7731（2023）19-0025-04安徽阜阳颍州大田恋思萝卜，又名鸭蛋酥，是阜阳当地特色品种（本文简称阜阳恋思萝卜）。

阜阳恋思萝卜质地脆、味道微甜，既无丝也无渣。

由于种种原因，阜阳恋思萝卜生产成本在增高，产品品质却参差不齐，品种退化严重，优良性状在逐渐消失。

改善阜阳恋思萝卜发展现状最简易、有效的方法之一是人工创造新的种质资源，通过人工诱导使作物基因发生突变，再从诱变群体中选出有利的突变体，经过连续多代筛选培育获得综合性状优良的恋思萝卜新种质。

人工诱变能在短期内获得大量突变体，甲基磺酸乙酯（EMS ）是当前应用效果较好的化学诱变剂之一[1]。

EMS 诱变育种对丰富植物基因类型和选育新品种具有重大意义。

本研究利用不同处理时间、浓度梯度的EMS 对阜阳恋思萝卜种子进行浸种诱变，研究EMS 对阜阳恋思萝卜种子萌发和幼苗生长的影响，根据半致死剂量确定EMS 诱变阜阳恋思萝卜种子最适宜的浓度[2]，对于丰富阜阳恋思萝卜诱变育种材料和加快恋思萝卜育种进程具有重要意义。

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(２):３０５￣３１２ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ江㊀群ꎬ凌溪铁ꎬ唐兆成ꎬ等.ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(２):３０５￣３１２.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０２.００１ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质江㊀群１ꎬ㊀凌溪铁２ꎬ㊀唐兆成２ꎬ㊀周珍珍２ꎬ㊀张保龙１ꎬ２(１.海南大学热带作物学院/三亚南繁研究院ꎬ海南海口５７０２２８ꎻ２.江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所/江苏省农业生物学重点实验室ꎬ江苏南京２１００１４)收稿日期:２０２２￣１１￣２５基金项目:江苏省农业科技自主创新基金项目[ＣＸ(２１)２０４１]作者简介:江㊀群(１９９８－)ꎬ女ꎬ四川宜宾人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事水稻抗除草剂育种研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)１６９２５７９２６４＠ｑｑ.ｃｏｍ通讯作者:张保龙ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈｂｌ２２４８＠ｈｏｔｍａｉｌ.ｃｏｍꎻ周珍珍ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈｅｎｚｈｅｎｚｈｏｕｎｊ＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀创制非转基因抗除草剂水稻种质资源对于稻田杂草防控具有重要价值ꎮ本研究以甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)水溶液诱变镇糯１９水稻种子ꎬ获得１株能稳定遗传的可耐受乙酰辅酶Ａ羧化酶(ＡＣＣａｓｅ)抑制剂类除草剂高效盖草能的Ｍ３代水稻幼苗(突变体)ꎮ分别扩增镇糯１９野生型和突变体的基因组ＤＮＡ并进行测序和序列比对ꎬ发现突变体ＡＣＣａｓｅ基因的开放阅读框(ＯＲＦ)的第５３７４位碱基发生了点突变ꎬ导致编码的第１７９２位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸ꎮ镇糯１９野生型和突变体分蘖盛期大田喷施３种田间推荐剂量的ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂后农艺性状调查结果表明突变体对高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯抗性明显高于野生型ꎮ本研究获得了能稳定遗传的非转基因抗ＡＣ￣Ｃａｓｅ抑制剂类水稻新种质ꎬ具有一定的应用价值ꎬ为抗除草剂水稻育种提供了种质资源ꎮ关键词:㊀水稻ꎻ抗除草剂种质ꎻ甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)ꎻ乙酰辅酶Ａ羧化酶中图分类号:㊀Ｓ３３５.３㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０２￣０３０５￣０８ＥＭＳｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｔｏｃｒｅａｔｅｒｉｃｅａｎｔｉ￣ａｃｅｔｙｌ￣ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ￣ｈｅｒ￣ｂｉｃｉｄｅｇｅｒｍｐｌａｓｍＪＩＡＮＧＱｕｎ１ꎬ㊀ＬＩＮＧＸｉ￣ｔｉｅ２ꎬ㊀ＴＡＮＧＺｈａｏ￣ｃｈｅｎｇ２ꎬ㊀ＺＨＯＵＺｈｅｎ￣ｚｈｅｎ２ꎬ㊀ＺＨＡＮＧＢａｏ￣ｌｏｎｇ１ꎬ２(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓ/ＳａｎｙａＮａｎｆａｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＨａｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨａｉｋｏｕ５７０２２８ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｒｍｐｌａｓｍＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＢｉｏ￣ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ/ＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇｎｏｎ￣ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓｉｓｏｆｇｒｅａｔｖａｌｕｅｆｏｒｗｅｅｄｃｏｎｔｒｏｌｉｎｒｉｃｅｆｉｅｌｄｓ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬＺｈｅｎｎｕｏ１９ｒｉｃｅｓｅｅｄｓｗｅｒｅｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄｂｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎａｔｅ(ＥＭＳ)ｓｏｌｕｔｉｏｎꎬａｎｄａＭ３ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｒｉｃｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｗｉｔｈｓｔａｂｌｅｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅａｎｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ￣ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ(ＡＣＣａｓｅ)ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ.ＴｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｓｏｆｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅａｎｄｔｈｅｍｕｔａｎｔｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓａｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎａｔｔｈｅ５３７４ｔｈｂａｓｅｏｆｔｈｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅＡＣＣａｓｅｇｅｎｅꎬｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎａｍｕｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｃｏｄｅｄ１７９２ｔｈａｍｉｎｏａｃｉｄｆｒｏｍｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｔｏｌｅｕｃｉｎｅ.ＴｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆＡＣＣａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｗｅｒｅｓｐｒａｙｅｄｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄａｎｄｔｈｅａｇｒｏｎｏｍｉｃｔｒａｉｔｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｍｕｔａｎｔｔｏｈａｌｏｘｙ￣ｆｏｐ￣Ｒ￣ｍｅｔｈｙｌꎬｑｕｉｚａｌｏｆｏｐ￣Ｐ￣ｅｔｈｙｌａｎｄｐｉｎｏｘａｄｅｎｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬａｎｅｗｎｏｎ￣ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｗｉｔｈＡＣＣａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄꎬｗｈｉｃｈｈａｄｃｅｒｔａｉｎａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｖａｌｕｅａｎｄｃｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓｆｏｒｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅｂｒｅｅｄｉｎｇ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｒｉｃｅꎻｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｒｍｐｌａｓｍꎻｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎａｔｅ(ＥＭＳ)ꎻａｃｅｔｙｌＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ５０３㊀㊀水稻是中国三大粮食作物之一ꎬ培育高产稳产的优质水稻是解决粮食问题的关键ꎮ稻田杂草严重影响水稻的产量和品质ꎬ杂草导致中国稻谷每年亏损率超过１５％ꎬ部分地区甚至超过５０％[１]ꎮ化学除草是当今世界使用最多的稻田除草方法ꎮ然而ꎬ过度使用除草剂不仅会导致杂草对除草剂产生抗性ꎬ还会对作物产生药害㊁降低水稻产量和品质ꎬ严重时甚至造成水稻颗粒无收[２]ꎮ因此ꎬ培育抗除草剂的水稻品种可以经济有效地解决稻田的杂草防除问题ꎮ乙酰辅酶Ａ羧化酶(ＡＣＣａｓｅ)是植物初级代谢中脂肪酸合成的关键酶之一ꎬ其主要功能是将乙酰辅酶Ａ羧化为丙二酰辅酶Ａꎮ该反应是脂肪酸合成的第一步ꎬ也是限速的关键步骤[３]ꎮ脂肪酸不仅是功能物质甘油三脂的组成成分ꎬ还能转化为作为细胞膜组成成分的磷脂[４]ꎮ自１９５８年发现乙酰辅酶Ａ羧化酶可作为除草剂的作用靶标后ꎬ针对该靶标已开发了三大类除草剂并商品化应用ꎬ分别是芳氧苯氧基丙酸酯类(ＡＰＰ)[５]㊁环己烯酮类(ＣＨＤ)[６]和新苯基吡唑啉类(ＤＥＮ)[７￣８]ꎮ其中ꎬＡＰＰ类除草剂包括高效氟吡甲禾灵(Ｈａｌｏｘｙｆｏｐ￣Ｒ￣ｍｅｔｈｙｌꎬ又称高效盖草能)㊁精喹禾灵(Ｑｕｉｚａｌｏｆｏｐ￣Ｐ￣ｅｔｈｙｌ)㊁精恶唑禾草灵(Ｆｅｎｏｘａｐｒｏｐ￣Ｐ￣ｅｔｈｙｌꎬ又称骠马)㊁恶唑酰草胺(Ｍｅｔａｍｉｆｏｐ)和氰氟草酯(Ｃｙｈａｌｏｆｏｐ￣ｂｕｔｙｌ)等ꎮＣＨＤ类除草剂包括烯禾啶(Ｓｅｔｈｏｘｙｄｉｍ)㊁噻草酮(Ｃｙ￣ｃｌｏｘｙｄｉｍ)和环苯草酮(Ｐｒｏｆｏｘｙｄｉｍ)等ꎻＤＥＮ类除草剂有唑啉草酯(Ｐｉｎｏｘａｄｅｎ)ꎮ乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂主要被用于控制禾本科杂草ꎬ具有高效㊁低毒㊁对后茬作物安全等特点[９]ꎮ目前ꎬ水稻生产中登记并许可使用的乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂仅有氰氟草酯㊁恶唑酰草胺和环苯草酮ꎬ这极大限制了水稻生产中杂草的防治ꎮ因此培育抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂水稻ꎬ不仅可以拓宽稻田除草剂的选择和使用范围ꎬ还可有效控制稻田杂草的发生与危害ꎮ化学诱变是培育和筛选抗性除草剂作物种质资源的重要方法ꎮＥＭＳ是非常有效且负面影响小的化学诱变剂ꎬ被广泛应用于构建优良性状的水稻突变体[１０￣１２]ꎮ顾佳清等利用ＥＭＳ处理粳稻品种中花１１ꎬ从诱变的水稻群体中筛选出高产的突变体ꎬ经过后代的纯化ꎬ得到了一个可以直接推广应用的水稻突变新品系申化一号[１３]ꎮ陈忠明等通过ＥＭＳ处理籼稻９３１１ꎬ筛选出了大粒的突变体Ｍ３１６和长穗突变体９３１１ｅＲ[１４￣１５]ꎮ本课题组用ＥＭＳ诱变处理包括９３１１在内的多个水稻品种ꎬ成功筛选到多个抗咪唑啉酮类除草剂的突变体ꎬ进一步鉴定结果表明突变均发生在编码乙酰乳酸合成酶(ＡＬＳ)靶标基因上[１６]ꎮ本研究通过ＥＭＳ诱变糯稻品种镇糯１９构建突变群体ꎬ用ＡＰＰ类除草剂高效盖草能去筛选诱变处理后的Ｍ２代幼苗ꎬ获得能稳定遗传的抗性植株ꎬ并对抗性植株的ＡＣＣａｓｅ基因位点突变㊁氨基酸序列变异进行鉴定ꎬ最后就３种不同ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂对获得的抗除草剂材料农艺性状影响进行分析ꎬ旨在为水稻抗除草剂育种提供依据和材料ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料与试剂供试水稻材料镇糯１９由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所提供ꎮ试验所用除草剂的种类及相关信息见表１ꎮ表１㊀本试验所用除草剂Ｔａｂｌｅ１㊀Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ名称㊀类别来源推荐田间施用剂量(ｇ/ｈｍ２ꎬａ.ｉ.)高效盖草能ＡＰＰ江苏中旗科技股份有限公司６４.８精喹禾灵ＡＰＰ天津中农立华农用化学品有限公司６０.０唑啉草酯ＤＥＮ瑞士先正达作物保护有限公司４５.０㊀㊀生物试剂甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)购自美国Ｓｉｇｍａ￣Ａｌｄｒｉｃｈ公司ꎬ２ˑＲａｐｉｄＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ㊁ＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ￣ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司ꎬＣＴＡＢ购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司ꎮ１.２㊀镇糯１９水稻种子的ＥＭＳ诱变及抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂突变体的筛选㊀㊀镇糯１９种子(Ｍ１代)清水浸泡２ｈ后ꎬ用质量浓度５ ０ｍｇ/ｍｌ的ＥＭＳ水溶液浸种处理１４ｈꎬ硫代硫酸钠中和３０ｍｉｎ后ꎬ将种子捞出并用清水冲洗５~６遍ꎮ将诱变处理后的种子播种于大田ꎬＭ１代植株成熟后ꎬ种子混收(Ｍ２代)作为突变群体库ꎮ从突变群体库中取Ｍ２代种子播种于大棚苗床ꎬ待水稻幼苗长至３~４叶期时喷施６４ ８ｇ/ｈｍ２ꎬａ.ｉ.高效盖草６０３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期能ꎬ施药后２１ｄ观察记录水稻表型并将正常生长的水稻苗移栽至盆钵内ꎬ单株收获种子得到突变体种子(Ｍ３代)ꎬＭ３代种子播种后得到Ｍ３代幼苗ꎮ１.３㊀抗除草剂突变体ＡＣＣａｓｅ基因的ＰＣＲ鉴定和碱基序列分析㊀㊀从国家水稻数据中心数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｒｉｃｅ￣ｄａｔａ.ｃｎ/)获得水稻ＡＣＣａｓｅ基因(ＯｓＡＣＣꎬ序列号为ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ２２９４０)的碱基序列ꎮ根据ＯｓＡＣＣ基因的保守序列使用ＳｎａｐＧｅｎｅ６.０.２软件进行特异性引物设计ꎬ共设计了８对引物ꎬ分别是ＯｓＡＣＣ￣Ｆ１~Ｏｓ￣ＡＣＣ￣Ｆ８和ＯｓＡＣＣ￣Ｒ１~ＯｓＡＣＣ￣Ｒ８(表２)ꎮ表２㊀本试验所用引物Ｔａｂｌｅ２㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ引物名称㊀序列(５ᶄң３ᶄ)ＰＣＲ产物长度(ｂｐ)ＯｓＡＣＣ￣Ｆ１ＧＴＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＴＣＴＧＧＧ１４２２ＯｓＡＣＣ￣Ｒ１ＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＡＡＴＧＴＡＣＴＯｓＡＣＣ￣Ｆ２ＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＴＡＴＧＣ１６１４ＯｓＡＣＣ￣Ｒ２ＴＣＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＯｓＡＣＣ￣Ｆ３ＣＣＣＴＡＴＴＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＧ１５９７ＯｓＡＣＣ￣Ｒ３ＡＡＣＡＧＡＡＡＴＧＧＣＡＴＧＡＴＧＧＡＯｓＡＣＣ￣Ｆ４ＣＡＡＡＣＧＴＡＧＡＣＴＡＣＡＣＡＧＴＴＧＡＣ１６４１ＯｓＡＣＣ￣Ｒ４ＴＧＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＴＴＡＴＧＡＧＡＡＯｓＡＣＣ￣Ｆ５ＴＴＧＡＣＡＡＧＧＴＡＡＡＣＡＴＣＡＴＧＴＣＣ１６３５ＯｓＡＣＣ￣Ｒ５ＡＡＡＡＧＧＴＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡＴＴＣＡＣＧＯｓＡＣＣ￣Ｆ６ＴＣＴＡＴＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣ１６３１ＯｓＡＣＣ￣Ｒ６ＡＡＴＧＧＣＣＡＧＴＴＣＴＡＡＴＴＧＣＧＯｓＡＣＣ￣Ｆ７ＡＧＴＴＴＴＣＴＴＣＧＧＧＣＣＡＧＡＴＴ１６３４ＯｓＡＣＣ￣Ｒ７ＧＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＣＧＣＴＧＴＡＴＯｓＡＣＣ￣Ｆ８ＣＡＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧ１８６６ＯｓＡＣＣ￣Ｒ８ＣＡＧＡＣＴＴＧＣＡＣＴＴＴＣＡＴＣＴＧＧＣＡ㊀㊀采用ＣＴＡＢ法[１４]提取水稻的基因组ＤＮＡꎬ取Ｍ３代三叶一心期的叶片０ ５ｇ放在带有１颗小钢珠的２ｍｌ离心管中ꎬ放到液氮中冷冻至叶片组织变脆ꎬ再将离心管放到频率为６０Ｈｚ的组织研磨机研磨２ｍｉｎꎬ然后加入４００μｌＣＴＡＢ提取液ꎬ离心管６５ħ水浴３０ｍｉｎ后ꎬ在通风橱中加入４００μｌ氯仿ꎬ充分混匀至提取液呈乳绿色ꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ在离心期间标记好管号ꎬ将６００μｌ无水乙醇加入到已经标记好的１ ５ｍｌ离心管中ꎬ移液枪吸取上清液３００μｌ加到已经准备好的离心管中ꎬ上下颠倒混匀再沉淀１ｈ以上ꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ倒掉上清液ꎬ开盖ꎬ室温下风干１２ｈ至离心管底部有明显的白色ＤＮＡ沉淀ꎬ风干后加入灭菌蒸馏水２００μｌꎬ于－２０ħ保存ꎮ以Ｍ３代的基因组ＤＮＡ为模板ꎬ采用２ˑＲａｐｉｄＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ或ＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ￣ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ聚合酶扩增ＯｓＡＣＣ基因的８个片段ꎮ用１％琼脂糖凝胶进行电泳检测ꎮ将条带大小正确的ＰＣＲ产物送南京擎科生物科技有限公司进行测序ꎻ使用ＳｎａｐＧｅｎｅ６.０.２软件分析测序结果ꎬ明确野生型和突变体的ＯｓＡＣＣ基因碱基序列差异性ꎮ１.４㊀喷施除草剂后水稻农艺性状调查２０２２年在江苏省农业科学院试验基地进行镇糯１９野生型和突变株系对３种乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂耐受性试验ꎮ５月中旬播种ꎬ６月中旬插秧ꎮ试验设分别喷施高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯及清水对照４个处理ꎬ每处理２.５ｍˑ４ ０ｍꎮ移栽行距为０ ２５ｍꎬ株距为０ １５ｍꎮ按照常规大田生产进行浇水和施肥等田间管理ꎮ镇糯１９野生型和突变体幼苗移栽大田２７ｄ后ꎬ进行高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯及清水(ＣＫ)的喷施处理ꎮ除草剂的用量见表１ꎮ各处理选择连续的２０株ꎬ在水稻喷施除草剂前以及喷施除草剂后３０ｄ㊁９０ｄ进行茎蘖数㊁株高㊁主茎旗叶长度等农艺性状调查ꎮ其中ꎬ喷药后９０ｄꎬ水稻已进入成熟期ꎬ统计的茎蘖数为成穗数ꎮ１.５㊀数据处理与统计分析采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１９进行数据处理ꎬ用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８.０.１软件进行统计分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀抗除草剂突变体筛选高效盖草能是一种内吸传导型除草剂ꎬＥＭＳ诱变的镇糯１９Ｍ２代水稻幼苗在３~４叶期喷施高效盖草能７ｄ后ꎬ绝大部分水稻幼苗叶片颜色变成浅绿ꎻ喷施高效盖草能２１ｄ后ꎬ敏感植株叶片几乎完全失去绿色㊁部分已经枯死ꎻ具有抗性的植株能继续正常生长ꎮ经大量筛选后ꎬ最终获得１株具有高效盖草能抗性的Ｍ２单株(图１)ꎬ成熟后收获单株种子ꎬ得到Ｍ３代抗性突变体ꎮ２.２㊀ＯｓＡＣＣ突变位点已知高效盖草能的作用靶标是ＡＣＣａｓｅꎬ植物对７０３江㊀群等:ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质图１㊀喷施高效盖草能后筛选到的Ｍ２代抗性水稻植株Ｆｉｇ.１㊀Ｍ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅｐｌａｎｔｓｃｒｅｅｎｅｄａｆｔｅｒｓｐｒａ￣ｙｉｎｇｗｉｔｈ６４.８ｇａ.ｉ./ｈｍ２ｈａｌｏｘｙｆｏｐ￣Ｒ￣ｍｅｔｈｙｌ高效盖草能的抗性主要源于ＡＣＣａｓｅ基因的突变[１７￣１９]ꎮ为了确定突变体中靶标基因是否发生突变ꎬ我们用了８对引物对野生型(镇糯１９￣ＷＴ)和抗性Ｍ３单株(镇糯１９￣１７９２)的基因进行扩增ꎬ全部都获得了与预期大小相符合的条带(图２)ꎮ㊀㊀上述ＰＣＲ扩增的产物经测序和碱基序列比对ꎬ发现相对于野生型ＯｓＡＣＣ的ＯＲＦꎬ突变体ＯｓＡＣＣ基因中存在一个点突变ꎬ其开放阅读框(ＯＲＦ)的第５３７４位碱基由Ａ突变成Ｔꎬ从而引起编码的第１７９２位氨基酸由异亮氨酸(Ｉｌｅ)突变为亮氨酸(Ｌｅｕ)(图３Ａ)ꎮＯｓＡＣＣ蛋白的全长有２３２７个氨基酸ꎬ将Ｏｓ￣ＡＣＣ蛋白全长氨基酸序列在ＮＣＢＩ的ＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏ￣ｍａｉｎ数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｓｔｒｕｃ￣ｔｕｒｅ/ｃｄｄ/ｗｒｐｓｂ.ｃｇｉ)进行保守结构域分析ꎬ发现其包含了４个结构域(Ｄｏｍａｉｎ):生物素羧化酶(ＢＣ)㊁生物素羧基载体蛋白(ＢＣＣＰ)㊁乙酰辅酶Ａ羧化酶中心(ＡＣＣｃｅｎｔｒａｌ)和羧基转移酶(ＣＴ)(图３Ｂ)ꎮ进一步的氨基酸序列分析结果表明ꎬ突变体中第１７９２位氨基酸的突变位于ＣＴ结构域ꎬ该突变类型与已报道的大穗看麦娘(Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ)的抗性位点突变类型是一致的ꎬ对应于其ＡＣＣａｓｅ氨基酸序列第１７８１位点ꎻ突变类型也相同ꎬ均由Ｉｌｅ突变为Ｌｅｕ(图３Ｂ和３Ｃ)[１７]ꎮ因此ꎬ突变体抗除草剂功能的获得是由ＯｓＡＣＣ氨基酸序列第１７９２位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸引起的ꎮ２.３㊀突变体的农艺性状在分别喷施高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯１４ｄ后ꎬ野生型植株生长均受到了显著影响ꎬ大部分植株叶片出现枯黄症状ꎮ突变体植株在分别喷施以上３种除草剂后ꎬ叶片仍然是绿色且可以正常生长ꎬ表明突变体对这３种除草剂均具有抗性(图４)ꎮ㊀㊀分蘖期分别喷施３种不同除草剂后ꎬ野生型和突变体株高㊁分蘖数及旗叶长度的变化如图５所示ꎮ结果显示ꎬ在喷施清水处理的情况下ꎬ野生型和突变体植株的株高在处理前(０ｄꎬ即幼苗移栽到大田２７ｄ)基本没有差异ꎬ但在处理后３０ｄ和９０ｄꎬ突变体的株高显著低于野生型的株高(图５Ａ)ꎻ两者在处理前㊁后的单株茎蘖数均无明显差异(图５Ｅ)ꎮ在分别喷施３种不同除草剂前(０ｄ)ꎬ野生型和突变体植株的株高和单株分蘖数都没有明显差异ꎬ但是在喷施处理后ꎬ两者受除草剂的影响表现出明显差异(图５Ｂ~图５Ｄ㊁图５Ｆ~图５Ｈ)ꎮ其中ꎬ在喷施高效盖草能３０ｄ和９０ｄ后ꎬ突变体的株高均显著高于野生型(图５Ｂ)ꎬ单株茎蘖数也显著多于野生型(图５Ｆ)ꎮ野生型对精喹禾灵和唑啉草酯都非常敏感ꎬ喷施田间推荐剂量后水稻植株均死亡ꎬ因此未统计喷药后的株高和分蘖数ꎬ而突变体对这两种除草剂表现出较强的抗性ꎬ所有植株存活且能正常生长ꎬ株高随时间逐渐增加(图５Ｃ和５Ｄ)ꎮ突变体的单株茎蘖数在精喹禾灵处理后随时间呈先增后减趋势ꎬ但经唑啉草酯处理后变化不明显ꎬ未出现明显增加现象(图５Ｇ和５Ｈ)ꎮ喷施清水处理的突变体旗叶长度显著短于野生型ꎻ高效盖草能处理后ꎬ突变体的旗叶长度显著长于野生型(图５Ｉ)ꎮ由于野生型在喷施田间推荐剂量的精喹禾灵和唑啉草酯后植株已经枯死ꎬ因此未能进行旗叶长度统计ꎮ综合以上结果ꎬ在田间推荐剂量下ꎬ突变体对高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯的抗性水平均高于野生型ꎮ３㊀讨论植物对除草剂的抗性机制包括非靶标和靶标抗性两大类ꎮ其中ꎬ非靶标抗性是由靶标基因以外的突变引起的ꎬ使植物对除草剂的吸收或转运率降低㊁螯合或代谢作用增强ꎻ靶标抗性是由除草剂的靶标基因发生突变引起的[２０]ꎮ现在已发现的大部分植物抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的抗性机制是由于ＡＣＣａｓｅ基因碱基突变引起氨基酸位点发生变异ꎬ这也是导致杂草抗药性产生的主要原因[２１￣２２]ꎮ截止８０３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期Ｍ表示ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ泳道１表示野生型ꎻ泳道２表示突变体ꎮＦ１~Ｆ８㊁Ｒ１~Ｒ８为引物ꎬ见表２ꎮ图２㊀镇糯１９野生型和突变体中ＯｓＡＣＣ基因的ＰＣＲ扩增结果Ｆｉｇ.２㊀ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＯｓＡＣＣｉｎＺｈｅｎｎｕｏ１９ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔＡ:突变体(镇糯１９￣１７９２)中ＯｓＡＣＣ基因的Ｓａｎｇｅｒ测序色谱图ꎻＢ:ＯｓＡＣＣ蛋白结构域示意图ꎻＣ:野生型(镇糯１９￣ＷＴ)和突变体(镇糯１９￣１７９２)的羧基转移酶(ＣＴ)结构域氨基酸序列比对ꎮ图３㊀镇糯１９突变体中突变基因ＯｓＡＣＣ及其编码氨基酸序列分析Ｆｉｇ.３㊀ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｕｔａｎｔｇｅｎｅＯｓＡＣＣａｎｄｉｔｓｅｎｃｏｄｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎＺｈｅｎｎｕｏ１９ｍｕｔａｎｔ９０３江㊀群等:ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质镇糯１９￣ＷＴ㊁镇糯１９￣１７９２分别表示镇糯１９野生型和突变体ꎻＧＣＮ㊁ＪＫ㊁ＺＬ和Ｈ２Ｏ分别表示喷施高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯及清水处理ꎮ图４㊀镇糯１９野生型和突变体田间喷施不同除草剂后的表型Ｆｉｇ.４㊀ＰｈｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆＺｈｅｎｎｕｏ１９ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔａｆｔｅｒｓｐｒａｙｉｎｇｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄ目前ꎬ杂草中已报道了十几种ＡＣＣａｓｅ氨基酸置换与其抗药性相关ꎬ分别对应于大穗看麦娘ＡＣＣａｓｅ的７个氨基酸位点(均位于ＣＴ结构域内):第１７８１位㊁第１９９９位㊁第２０２７位㊁第２０４１位㊁第２０７８位㊁第２０８８位和第２０９６位[２２￣２５]ꎮ在以上这些突变中ꎬ以第１７８１位氨基酸由Ｌｅｕ突变成Ｉｌｅ最为普遍ꎬ对三大类不同的ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂都表现出高抗性ꎬ却没有适合度代价(Ｆｉｔｎｅｓｓｃｏｓｔ)[２６￣２８]ꎮ本研究通过筛选ＥＭＳ诱变的镇糯１９水稻突变体ꎬ鉴定到了１个能稳定遗传的抗除草剂突变体ꎮ对突变体进行了基因鉴定ꎬ确定其编码靶标蛋白ＯｓＡＣＣ的第１７９２位氨基酸由Ｌｅｕ突变成Ｉｌｅꎮ该突变类型与已报道的突变类型一致ꎬ对应于大穗看麦娘ＡＣＣａｓｅ第１７８１位氨基酸突变ꎮ这是该突变类型使水稻获得多种ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂抗性的首次报道ꎮＥＭＳ是最常见的化学诱变剂ꎬ在植物的诱变育种中被广泛应用[２９]ꎮ本试验通过ＥＭＳ诱变镇糯１９种子ꎬ筛选到了抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的水稻植株ꎬ突变体能耐受田间推荐剂量的高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯ꎮ其中ꎬ喷施了田间推荐剂量的唑啉草酯后ꎬ镇糯１９野生型植株在处理３０ｄ后几乎全部死亡ꎻ喷施了田间推荐剂量的精喹禾灵后ꎬ野生型的植株在喷施３０ｄ后全部死亡ꎻ而突变体在分别喷施３种除草剂后ꎬ均未出现死亡现象ꎬ基本可以正常生长ꎮ所获得的抗性突变体对高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯的抗性水平均明显强于野生型ꎮ突变体和野生型的最小致死剂量或５０％抑制浓度(ＧＲ５０)㊁ＯｓＡＣＣ酶活性的差异尚有待进一步明确ꎮ大豆㊁棉花和玉米等转基因作物已在全球范围内进行了商品化生产ꎬ产生了巨大的社会效益和经济效益ꎮ目前为止ꎬ中国虽然有多种转基因作物已经被正式批准商品化生产ꎬ但进行大面积种植的仅０１３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期Ｈ２Ｏ㊁ＧＣＮ㊁ＪＫ㊁ＺＬ分别表示喷施清水㊁高效盖草能㊁精喹禾灵㊁ꎬ∗∗表示在０.０１水平上极显著ꎮＮＤ表示没有数据ꎬｎｓ表示没有显著差异ꎮ图５㊀不同除草剂处理下的水稻株高㊁分蘖数和旗叶长度Ｆｉｇ.５㊀Ｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔꎬｔｉｌｌｅｒｎｕｍｂｅｒａｎｄｆｌａｇｌｅａｆｌｅｎｇｔｈｏｆｒｉｃｅｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｅｒｂｉｃｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ有番木瓜和棉花ꎮ２００９年ꎬ农业部颁发了中国拥有自主知识产权的转Ｂｔ基因抗虫水稻生产应用安全证书ꎬ但目前中国尚未批准转基因水稻的商业化生产ꎮ因此ꎬ培育非转基因的抗除草剂水稻品种具有重要价值ꎮ上世纪９０年代晚期ꎬ美国路易斯安那州州立大学稻米研究中心通过ＥＭＳ诱变技术育成了一系列耐咪唑啉酮类除草剂(ＡＬＳ抑制剂类除草剂)的非转基因水稻品种ꎮ２００２年ꎬ巴斯夫公司开发了非转基因抗咪唑啉酮类除草剂的水稻品种Ｃｌｅａｒｆ￣ｉｅｌｄ在美国进行了商业化推广ꎬ解决了水稻种植的杂草稻危害问题[３０]ꎮ２０１８年ꎬ巴斯夫又在美国上市了非转基因水稻品种Ｐｒｏｖｉｓｉａꎬ可以抗精喹禾灵ꎬ拟与抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ进行轮作并交替使用两种不同作用机理的除草剂ꎬ实现对杂草稻和其他一年生杂草的可持续性防控[３１]ꎮ本研究通过ＥＭＳ诱变筛选到的抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂突变体ꎬ具有与抗除草剂精喹禾灵水稻品种Ｐｒｏｖｉｓｉａ类似的抗除草剂性状ꎬ可为中国非转基因抗除草剂水稻育种提供重要材料ꎮ４㊀结论本研究通过ＥＭＳ诱变筛选获得了可稳定遗传的抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的水稻突变体材料ꎬ可耐受３种不同田间推荐剂量的除草剂ꎬ具有一定的生产应用价值ꎮ野生型在喷施田间推荐剂量的高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯后ꎬ株高和分蘖均受到严重抑制甚至死亡ꎬ但突变体基本能正常生长ꎮ突变体中ＯｓＡＣＣ突变基因编码蛋白质的第１７９２位氨基酸由Ｉｌｅ变成Ｌｅｕꎬ使其对ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的耐受性显著提高ꎮ在当前中国转基因水稻尚未放开㊁公众对转基因作物品种存在疑虑的大背景下ꎬ本研究获得的非转基因抗除草剂材料具有良好的应用前景ꎮ１１３江㊀群等:ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质参考文献:[１]㊀董立尧ꎬ高㊀原ꎬ房加鹏ꎬ等.我国水稻田杂草抗药性研究进展[Ｊ].植物保护ꎬ２０１８ꎬ４４(５):６９￣７６.[２]㊀程艳勤.浅析除草剂对水稻的危害及治理[Ｊ].农技服务ꎬ２０１６ꎬ３３(６):１０９￣１１４.[３]㊀ＫＯＮＩＳＨＩＴＫＵＪꎬＳＨＩＮＯＨＡＲＡＫꎬＹＡＭＡＤＡＫꎬｅｔａｌ.Ａｃｅｔｙｌ￣ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｉｎｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ:ｍｏｓｔｐｌａｎｔｓｏｔｈｅｒｔｈａｎｇｒａｍｉｎｅａｅｈａｖｅｂｏｔｈｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃａｎｄｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｆｏｒｍｓｏｆｔｈｉｓｅｎｚｙｍｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔａｎｄＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ１９９６ꎬ３７(２):１１７￣１２２. 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[２７]ＭＥＮＣＨＡＲＩＹꎬＣＨＡＵＶＥＬＢꎬＤＡＲＭＥＮＣＹＨꎬｅｔａｌ.Ｆｉｔｎｅｓｓｃｏｓｔｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｒｅｅｍｕｔａｎｔａｃｅｔｙｌ￣ｃｏｅｎｚｙｍｅＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅａｌｌｅｌｅｓｅｎｄｏｗｉｎｇｈｅｒｂｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｂｌａｃｋ￣ｇｒａｓｓＡｌｏｐｅｃｕｒｕｓｍｙ￣ｏｓｕｒｏｉｄｅｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＥｃｏｌｏｇｙꎬ２００８ꎬ４５(３):９３９￣９４７. [２８]ＷＡＮＧＴꎬＰＩＣＡＲＤＪＣꎬＴＩＡＮＸꎬｅｔａｌ.Ａｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＡＣＣａｓｅ１７８１ｓｅｔａｒｉａｍｕｔａｎｔｓｈｏｗｓｈｉｇｈｅｒｆｉｔｎｅｓｓｔｈａｎｗｉｌｄｔｙｐｅ[Ｊ].Ｈｅｒｅｄｉｔｙ(Ｅｄｉｎｂ)ꎬ２０１０ꎬ１０５(４):３９４￣４００.[２９]ＳＥＲＲＡＴＸꎬＥＳＴＥＢＡＮＲꎬＧＵＩＢＯＵＲＴＮꎬｅｔａｌ.ＥＭＳｍｕｔａｇｅｎｅ￣ｓｉｓｉｎｍａｔｕｒｅｓｅｅｄ￣ｄｅｒｉｖｅｄｒｉｃｅｃａｌｌｉａｓａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｐｉｄｌｙｏｂｔａｉｎｉｎｇＴＩＬＬＩＮＧｍｕｔａｎｔｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＭｅｔｈｏｄｓꎬ２０１４ꎬ１０(１):５.[３０]ＳＨＡＸＹꎬＬＩＮＳＣＯＭＢＥＳＤꎬＧＲＯＴＨＤＥ.Ｆｉｅｌｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ￣ｔｏｌｅｒａｎｔＣｌｅａｒｆｉｅｌｄｒｉｃｅ(ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ.)ａｔｎｉｎｅＬｏｕｉｓｉａｎａｌｏｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅꎬ２００７ꎬ４７(３):１１７７￣１１８５. [３１]ＣＡＭＡＣＨＯＪＲꎬＬＩＮＳＣＯＭＢＥＳＤꎬＳＡＮＡＢＲＩＡＹꎬｅｔａｌ.Ｉｎｈｅｒｉｔ￣ａｎｃｅｏｆＰｒｏｖｉｓｉａｒｉｃｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｑｕｉｚａｌｏｆｏｐ￣ｐ￣ｅｔｈｙｌｕｎｄｅｒｌａｂｏｒａ￣ｔｏｒｙａｎｄｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ[Ｊ].Ｅｕｐｈｙｔｉｃａꎬ２０１９ꎬ２１５(４):８３.(责任编辑:石春林)２１３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期。

摘要本研究利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法对两个突变体库一共1200份诱变小麦群体的Waxy蛋白变异进行了鉴定，并通过双向电泳（2D-PAGE）、基因克隆、原核表达的方法验证SDS-PAGE结果并解析Waxy基因变异机制及其对淀粉含量的影响。

主要结果如下：1. 从小麦EMS诱变群体中一共鉴定出3份Wx蛋白迁移率变化材料，其中2份材料M2-97-8，M2-104-2来自AS201642突变体库为Wx-B1突变体；1份材料M2-101-1来自蜀麦126突变体库为Wx-A1突变体。

2. 对三份突变体进行2D-PAGE检测，发现两份Wx-B1突变体等电点均发生了变化，而M2-101-1结果中存在2个亚基但等电点未发生变化。

进一步，利用UREA-SDS-PAGE对M2-101-1再次进行分析，发现Waxy区域出现了2条带，证实Wx-A1迁移率发生变化，与Wx-D1重合，并且Wx-A1表达量有所降低。

3. 对突变体Wx-1 DNA克隆，M2-97-8和M2-104-2中Wx-B1全长序列为2793bp，M2-101-1中Wx-A1全长为2781bp的序列。

序列分析发现，M2-97-8有两处突变G2002A和G2715A；M2-104-2一处突变G1860A，M2-101-1一处突变C1448T。

cDNA 克隆发现了相同的单碱基突变。

氨基酸分析表明：M2-97-8的两处突变中，第580处甘氨酸被精氨酸取代，另一个为无意义突变；M2-104-2在第422处谷氨酸被赖氨酸取代；M2-101-1在第316处脯氨酸被亮氨酸取代。

4. 对突变的Wx-1基因进行原核表达分析，发现与预测结果相符，与种子中迁移率变化趋势一致，但表达的蛋白比种子中提取的对应蛋白迁移率更小。

5．对突变材料籽粒淀粉组成测定发现M2-97-8和M2-104-2中的总淀粉和直链淀粉含量比对照（AS201642）高，M2-101-1中的总淀粉和直链淀粉含量比对照（蜀麦126）低，且均差异显著。