诱变方法

理化诱变方式
1.物理法：射线（紫外线、X光线、Y射线，中子线），激光微束，离子束，微波，超声波，热力等。

2.化学诱变法：浸渍法、涂抹法、滴液法、注射法、施入法和熏蒸法。

化学诱变剂：碱基类似物、烷化剂，移码诱变剂，硫酸二乙酯（DFS）、5-溴尿嘧啶（5－BU）、氮芥（Nm）、N'广甲基N'亚硝基胍（NTG）。

3.生物法：空间条件处理诱变，病原微生物诱变，转基因诱变。

人工诱变在人为的条件下,利用物理、化学等因素，诱发生物产生突变，从中选择、培育动植物和微生物的新品种。

诱变育种是指用物理、化学因素诱导植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株，进而培育成新的品种或种质的育种方法。

化学诱变方法
化学诱变是一种基因工程技术，它可以利用特定化学药物对目标基因进行精确修饰，从而
改变基因的表达结果。

该方法可应用于多种互补DNA片段，突变位点和编码基因的改造，以及其他细胞科学应用。

化学诱变可提供一种精确方法，以调控基因表达，而不会对基因
其他部分产生不良影响。

化学诱变首先将抗生素敏感诱导体转导至目标细胞，然后添加特异性的化学敏化剂，从而
特定部位的基因被切除，同时还可以概念性上发现新的目标位点。

这项技术最初主要应用
于真菌基因组中。

随着技术的发展，它也被投入了植物，昆虫，病毒和高等动物基因组的
基因结构改造的相关工作中。

在抗生素敏感的性状转导中，用于诱变的化学物质有多种类型，其中包括氯仿和壬基苯酚。

氯仿是一种有毒物质，用来切除DNA片段，并能够调节不同种类的基因表达。

而壬基苯
酚是一种脱氢酶诱导剂，能够调节特定细胞内酶的活性，并利用这一活性靶向改变基因的
表达，对一些具有特异性的基因特异性调控特别有用。

如今，在基因组学技术中使用化学诱变技术已经取得了巨大的进步，这种技术的价值越来
越受到关注。

它以精确的方式进行操作，使我们能够轻松地识别和调节基因表达，从而可
以改变一个特定模式/行为/特性。

它促进了许多科学应用，比如生理，生化和临床研究，
以及基因疗法的研究，使得基因工程技术使人们了解和控制其整个基因图谱。

总之，化学诱变是一种非常有用的基因操作方法，其精确性和有效性在诸多领域有着广泛的应用。

它可用于识别和调控基因表达，改变特定的结构/行为特性，以及基因疗法的研究，深受科学家的欢迎。

一、诱变育种：诱变育种是指利用人工诱变的方法获得生物新品种的育种方法原理：基因突变方法：辐射诱变，激光、化学物质诱变，太空（辐射、失重）诱发变异→选择育成新品种优点：能提高变异频率，加速育种过程，可大幅度改良某些性状；变异范围广。

缺点：有利变异少，须大量处理材料；诱变的方向和性质不能控制。

改良数量性状效果较差。

二、杂交育种：杂交育种是指利用具有不同基因组成的同种（或不同种）生物个体进行杂交，获得所需要的表现型类型的育种方法。

其原理是基因重组。

方法：杂交→自交→选优优点：能根据人的预见把位于两个生物体上的优良性状集于一身。

缺点：时间长，需及时发现优良性状。

三、单倍体育种：单倍体育种是利用花药离体培养技术获得单倍体植株，再诱导其染色体加倍，从而获得所需要的纯系植株的育种方法。

（主要是考虑到结合中学课本，经查阅相关资料无误。

）其原理是染色体变异。

优点是可大大缩短育种时间。

原理：染色体变异，组织培养方法：选择亲本→有性杂交→F1产生的花粉离体培养获得单倍体植株→诱导染色体加倍获得可育纯合子→选择所需要的类型。

优点：明显缩短育种年限，加速育种进程。

缺点：技术较复杂，需与杂交育种结合，多限于植物。

四、多倍体育种：原理：染色体变异（染色体加倍）方法：秋水仙素处理萌发的种子或幼苗。

优点：可培育出自然界中没有的新品种，且培育出的植物器官大，产量高，营养丰富。

缺点：只适于植物，结实率低。

五、细胞工程育种：细胞工程育种是指用细胞融合的方法获得杂种细胞，利用细胞的全能性，用组织培养的方法培育杂种植株的方法。

原理：细胞的全能性方法：（1）植物：去细胞壁→细胞融合→组织培养（2）动物克隆：核移植→胚胎移植优点：能克服远缘杂交的不亲和性，有目的地培育优良品种。

动物体细胞克隆，可用于保存濒危物种、保持优良品种、挽救濒危动物、利用克隆动物相同的基因背景进行生物医学研究等。

缺点：技术复杂，难度大；它将对生物多样性提出挑战，有性繁殖是形成生物多样性的重要基础，而“克隆动物”则会导致生物品系减少，个体生存能力下降。

诱变育种的方法引言：诱变育种是指通过诱变剂引起植物或动物基因发生变异，从而产生新的有用性状的育种方法。

诱变育种可以提高作物的抗病性、适应性和产量等特性，对农业生产和人类生活具有重要意义。

本文将介绍几种常用的诱变育种方法。

一、物理诱变方法：物理诱变方法是利用物理因素对生物体的基因产生变异的方法。

常用的物理诱变方法有辐射诱变和化学诱变。

1. 辐射诱变：辐射诱变是指利用电离辐射对生物体进行诱变。

常用的辐射诱变方法包括γ-射线辐射和X射线辐射。

辐射诱变可以产生大量的突变体，通过对突变体的筛选和评价，可以选育出具有优良特性的新品种。

2. 化学诱变：化学诱变是指利用化学诱变剂对生物体进行诱变。

常用的化学诱变剂有EMS（乙基甲磺酸甲酯）和NaN3（氮化钠）。

化学诱变剂可以引发DNA的突变，从而产生新的基因型和表型。

二、生物诱变方法：生物诱变方法是利用生物因素对生物体的基因产生变异的方法。

常用的生物诱变方法有基因工程技术和细胞诱变技术。

1. 基因工程技术：基因工程技术是指通过改变生物体的基因组成，从而产生新的有用性状的育种方法。

常用的基因工程技术包括基因克隆、基因转移和基因编辑等。

通过基因工程技术，可以将具有有益特性的基因导入到目标生物体中，从而实现育种目标。

2. 细胞诱变技术：细胞诱变技术是指通过处理植物细胞或动物细胞，使其发生基因突变，从而产生新的有用性状的育种方法。

常用的细胞诱变技术包括化学诱变、辐射诱变和基因转化等。

细胞诱变技术可以提高诱变效率，加快育种进程。

三、化学诱变方法：化学诱变方法是利用化学品对生物体的基因产生变异的方法。

常用的化学诱变方法有化学诱变剂和化学物质处理。

1. 化学诱变剂：化学诱变剂是指通过处理生物体，使其基因发生突变的化学物质。

常用的化学诱变剂有EMS（乙基甲磺酸甲酯）、NTG（亚硝酸乙酯）和NaN3（氮化钠）等。

化学诱变剂可以改变DNA的结构，引发基因突变。

2. 化学物质处理：化学物质处理是指利用化学物质对生物体进行处理，使其基因发生变异。

紫外诱变方法宋炜等：高产脂肪酶酵母菌株的分离筛选及紫外诱变中南林业科技大学学报，2009，29(3)：55-641．2．4 紫外诱变1．2．4．1 紫外诱变处理取2 mL处于对数生长期的菌液于直径75 mm 的无菌培养皿中，置于30 w 紫外灯下30 cm处，分别照射处理：30 S、45 S、90 S、120 S、180 S、240 S、300 S，每个处理重复3次，用罗丹明B平板计算存活率，得出诱变致死曲线。

每次紫外照射后在黑暗培养箱中静置30 min，然后在黑暗中稀释至1O-4、10-5倍，分别取0.1 mL涂于罗丹明B平板上，每级稀释液涂抹3个平板，以不进行照射作对照，紫外线照射以后的操作都在黑暗中进行，防止光修复。

将涂匀的平板，用黑布裹好，置于28℃恒温培养箱中避光培养4 d。

1．2．4．2 突变菌株的初筛将培养好的平板取出进行菌落计数，计算致死率。

致死率(%)=100一(处理后每0.2 mL菌落数／对照每0.2 mL菌落数)×100。

同时测量透明圈直径(D)和菌落直径(d)，用接种针挑取经不同剂量诱变的直径较大菌落，将相同处理剂量D／d比值大于对照D／d的菌落穿刺于同一个罗丹明B培养皿上，每皿点6个，黑暗条件下培养4 d。

1．2．4．3 突变菌株的摇瓶复筛从相同处理时间的初筛平皿中选取D／d最大突变菌株，28℃摇瓶培养72 h，离心取上清液测酶活力．孙同毅等：高产碱性蛋白酶菌株HAP26选育氨基酸和生物资源2007，29(2)：20～22 1．2．1诱变(1)NTG诱变处理将在10 g·L～N一甲基一硝基一N一亚硝基呱(NTG)溶液中浸泡过的滤纸片(‘p1．5 cm)放在涂满嗜碱芽孢杆菌HAP26的培养皿中央。

(2)N+离子注入条件本试验采用由郑州大学提供的离子注入机。

注入离子能量为30 Kev，单次脉冲时间为6 s，间隔时间为60 s，单次注入离子能量为×1014N+个数／cm2，真空度为5～6×10-3Kpa。

化学诱变育种利用化学诱变剂处理，诱发植物发生遗传变异，从而选育新品种称为化学诱变育种。

早在1948年，Gustafsson等曾用芥子气处理大麦获得突变体。

1967年Nilan 用硫酸二乙酯处理大麦种子育成了矮秆、高产品种Luther。

此后化学诱变剂的研究和应用就逐步发展起来。

目前发现的一些化学诱变剂的主要特性见表7-4，但较公认的最有效和应用较多的是烷化剂和叠氮化物两大类。

烷化剂中仍以甲基磺酸乙脂(EMS)、硫酸二乙酯(DES)和乙烯亚胺(EI)等类型的化合物应用较多，叠氮化物则以叠氮化钠研究和应用较多。

表7-4 常用化学诱变的主要特性与物理诱变剂相比，化学诱变剂的特点有：①诱发突变率较高，而染色体畸变较少。

主要是诱变剂的某些碱基类似物与DNA的结合而产生较多的点突变，对染色体损伤轻而不致引起染色体断裂产生畸变。

②对处理材料损伤轻，有的化学诱变剂只限于DNA的某些特定部位发生变异。

③大部分有效的化学诱变剂较物理诱变剂的生物损伤大，容易引起生活力和可育性下降。

此外，使用化学诱变剂所需的设备比较简单，成本较低，诱变效果较好，应用前景较广阔。

但化学诱变剂对人体更具有危险性，必须选择不影响操作人员健康的有效药品。

但高效低毒的化学诱变剂数量不多，所以一般育种工作者仍以物理诱变为主。

一、化学诱变剂的类别与性质(一)烷化剂是指具有烷化功能的化合物。

它带有一个或多个活性烷基，如CH3、C2H5，该烷基转移到一个电子密度较高的分子上，可置换碱基中的氧原子，这种作用称为烷化作用。

烷化剂可以将DNA的磷酸烷化。

常用的烷化剂为甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、乙烯亚铵、亚硝基乙基尿烷(NEU)和亚硝基乙基脲(NEH)等。

(二)叠氮化钠(NaN3)是一种动植物的呼吸抑制剂，它可使复制中的DNA碱基发生替换，是目前诱变率高而安全的一种诱变剂。

可以诱导大麦基因突变而极少出现染色体断裂。

这对大麦、豆类和二倍体小麦的诱变有一定的效果，但对多倍体的小麦或燕麦则无效。

简述诱变育种的基本流程
诱变育种是指利用诱变剂将植物的DNA或RNA转化为突变体,然后通过基因编辑技术将这些突变体转化为育种目标。

以下是诱变育种的基本流程:
1. 诱变剂选择:选择适当的诱变剂,如放射性同位素、化学物质或病毒,以确保诱变剂能够引起植物的基因突变。

2. 诱变处理:将植物或其他生物暴露在适当的诱变剂中,以诱导基因突变。

通常使用化学诱变剂、辐射诱变剂或病毒来诱导突变。

3. 检测和分析:检测诱变剂引起的突变,并对突变进行分类和评估。

可以使用生物分析技术,如PCR、测序和转录组技术,来分析突变基因和突变类型。

4. 突变基因编辑:利用基因编辑技术,如CRISPR/Cas9,将突变基因转化为
育种目标。

这些技术可以通过精确定位和修改突变基因来创造新的品种。

5. 筛选和育种:通过比较诱变育种目标品种与野生型品种,选择诱变育种目标品种并进行育种。

这可以通过自然选择、遗传变异和人工选择等方法来实现。

诱变育种是一种高效的方式,可以创造新的品种,特别是对于那些无法通过自然选择和遗传变异形成新物种的植物品种。

但是,诱变育种也存在一些潜在的风险,如诱变剂的安全性和环境污染。

因此,在进行诱变育种时,必须小心谨慎,并遵循相关的安全性和环境保护规定。

人工诱变的物理方法
1. 辐射诱变：利用辐射的能量和粒子的作用，引起基因突变，包括电离辐射（X 射线、γ射线、β粒子）和非电离辐射（紫外线、可见光、红外线、微波、电磁波等）。

2. 化学诱变：利用化学物质的毒性、氧化性、碱性等性质，诱导基因的随机突变，如使用EMS（乙基甲磺酸乙酯）和EN（硝基能）等化学物质。

3. 热诱变：利用高温或低温环境创造的物理条件来诱发基因的随机突变，如高温处理、低温处理、冷冻处理等。

4. 高压诱变：利用高压环境创造的物理条件，诱发基因的随机突变，如高压灭菌、超高压处理等。

5. 过氧化物诱变：利用过氧化物的自由基作用，诱发基因的随机突变，如使用过氧化氢、过氧化乙酸等物质。

6. 电诱变：利用电场、电流等电力条件，诱发基因的随机突变，如使用电解水处理、电泳诱变等。

介绍了几种常用的物理诱变和化学诱变育种方法的原理、特点以及成功案例等,为微生物诱变育种提供了一个总体的方法框架。

诱变; 微生物育种微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以选育优质、高产的微生物菌株十分重要。

微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。

作为育种途径之一的诱变育种一直被广泛应用。

目前，国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。

11.1紫外线照射是常用的物理诱变方法之一，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。

DNA和RNA的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰260nm，因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。

紫外辐射的作用已有多种解释，但比较确定的作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体[1]。

二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对，所以可能导致突变甚至死亡[2]。

马晓燕[3]等以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌株马克斯克鲁维酵母菌株ZR-20，比优化前的酒精产率提高10.5%，较出发菌株提高了68%。

顾蕾[4]等通过紫外诱变红酵母ns-1原生质体，获得类胡萝卜素产量明显提高的突变株，其生物量、色素产量分别为6.15g/L、6.41mg/L，分别比原始菌株提高了67.6%、54.1%。

紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到，且出现正突变的几率较高，酵母菌株的诱变大多采用这种方法。

1.2γ-射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用，可直接或间接地改变DNA结构。

其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键。

其间接效应是能使水或有机分子产生自由基，这些自由基可以与细胞中的溶质分子发生化学变化，导致DNA分缺失和损伤[2]。

微生物诱变育种的方法微生物，这小小的生物世界里的居民，有着大大的能量。

而诱变育种呢，就像是给微生物来一场奇妙的变身之旅。

物理诱变是一种常见的法子。

紫外线就像是微生物世界的严厉教官。

微生物们在紫外线的照射下，就如同小士兵接受艰苦的训练。

紫外线那强烈的能量，会打乱微生物内部的基因结构。

比如说一些细菌，原本规规矩矩地按照自己的基因蓝图进行生长繁殖，紫外线一照，就像打乱了建筑图纸一样，基因里的一些部分发生了错乱。

有的微生物在这错乱中就产生了新的特性，也许原本不会产生某种特殊酶的，经过紫外线照射后就有了这种能力。

还有X射线，这可是更厉害的家伙。

如果把微生物比作是一个精密的小机器，X射线就像一把强力的干扰器。

它能深深钻进微生物的内部，对基因进行破坏和重组。

就像把小机器里的一些零件拆下来又重新组装，只不过这里是在基因层面。

有的微生物经X射线诱变后，抗逆性变强了。

原本在稍微恶劣一点的环境里就奄奄一息的，现在能坚强地活下去，而且还活得挺好。

化学诱变也不甘示弱。

化学诱变剂就像是给微生物的基因施魔法的小巫师。

像亚硝酸，它悄悄地接近微生物的基因，把基因里的一些碱基偷偷换掉。

这就好比在密码锁上换了几个密码数字，整个密码锁的开锁方式就可能完全变了。

微生物的基因表达也就随之改变。

一些霉菌经过亚硝酸诱变后，产孢子的能力可能大大增强，原本产一点点孢子的，现在像开了挂一样大量产孢子。

再说说碱基类似物，它们是伪装高手。

它们混入微生物的基因大厦里，伪装成正常的碱基。

可是一旦到了基因复制的时候，就开始捣乱了。

就像一个假零件混进了真零件堆里，在机器组装的时候就会出问题。

这种捣乱会导致基因复制出错，从而产生突变。

有的酵母菌经过碱基类似物的诱变后，发酵能力变得超强，能产生更多的酒精或者其他有用的代谢产物。

复合诱变就像是给微生物来一套组合拳。

先给微生物来点物理诱变，就像先给它一个下马威，打乱它的基因阵脚。

然后再用化学诱变，进一步在混乱的基因里搞点新花样。

2.4 试验方法2.4.1 酶液配制称取适量固体酶（w/v)，溶于0.6mol/L渗透压稳定剂中，0.22μm微孔过滤膜过滤除菌后备用。

2.4.2菌丝培养取直径1cm的菌丝块接种于盛有100mL液体培养基的250mL三角瓶中，每瓶接种一块，25℃静置培养3-7d。

2.4.3原生质体制备与计数将培养好的菌丝置于离心管中，10000r/min离心15min，弃去上清液，用相应稳渗剂洗涤3次，无菌滤纸吸去多余水分。

每250mg湿菌丝加1mL酶液，在适当温度水浴中酶解一段时间，酶解过程中每隔一段时间震荡混匀一次，吸取少许酶解液，血球计数板计数。

原生质体制备是菌种选育及其遗传研究的一个重要组成部分，确定了滑菇原生质体形成的最适条件：以0.6mol/L的MgSO4为稳渗剂，在2%的蜗牛酶和纤维素酶的混合酶、pH6.5、酶解温度30℃的条件下对培养7d的菌丝进行酶解，在此条件下所得原生质体的产量为3.92×106个/mL。

1.5.3 原生质体再生1.5.3.1 原生质体纯化（崔宗强，2003）酶解后的原生质体悬浮液经脱脂棉柱（5mL 注射器中塞入0.5-1.0cm 高的脱脂棉，稍压实）过滤除去残余菌丝，滤液4200r/min 离心10min，去上清液，用渗透压稳定剂洗2 次，得到纯化原生质体。

吸取少许悬液，血球计数板计数。

1.5.3.2 原生质体再生将适量原生质体悬液稀释到一定浓度后，吸取0.1mL 涂布再生固体平板。

同时用无菌水涨破原生质体后，以同样方法涂布再生固体平板，以消除非原生质体所形成的菌落带来的误差。

原生质体再生率的计算：再生率（％）＝（原生质体再生菌落数－对照组再生菌落）/原生质体总数×100％。

1.5.3.3 再生培养基的选择在30℃、pH6.0、1.5%酶液条件下，以0.6mol/L KCl 作为稳渗剂，酶解3h 得到冬虫夏草原生质体。

将所得原生质体过滤、纯化后吸取0.1mL 分别涂布 5 种不同再生培养基，25℃培养5d。

2 易错PCR（error-prone PCR）
DNA聚合酶在进行扩增目的DNA时会以一定的 频率发生碱基错配，这一现象恰好提供了一 种特定基因进行随机诱变的可能方法。
利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因 随机诱变的技术就称为易错PCR。 原理：较低的聚合酶（如Taq酶）在特定措施 下很容易向扩增产物中掺入随机突变
经PCR后，每个管产生了含有改变了特定碱基 的产物，但留有缺口。因此，产物是线状的 DNA链，由于引物互补位置不同，两个管的产 物的缺口位置也不同，当把两个反应管的产 物混合，经变性和退火处理，来自不同反应 管的线状DNA链可杂交形成双链环状的DNA分 子，但仍有缺口。由于环化分子可以转化大 肠埃希菌，在体内可把缺口修复，这样可以 获得定点改变了特低碱基的基因。
扩增战略：
三、 PCR随机诱变
当对目的序列了解很少的情况下，需 要引入大量的随机诱变，构建突变库，再 逐个筛选和鉴定 策略 1、利用简并引物 2、易错 PCR (error-prone PCR )
1、利用简并引物
简并引物的特点 5’端有十几个碱基是随机组合的。这一方 法除引物特殊外，其余均与定点突变技术完 全一样。利用简并引物可以产生大量随机突 变，并且这些突变都集中在很窄的一段区域 内。
2、大引物PCR法（megaprimer PCR )
先设置一个PCR反应产生一个含突变的DNA 片段，然后再以此DNA片段作为引物与原模板 退火进行PCR扩增得到含突变的完整的基因。 因为作为引物使用的DNA片段较通常的引物要 大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物 PCR法。
大引物PCR 定点诱变技术路线
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1、重叠延伸PCR (over-lap extension PCR, OE-PCR ) 2、大引物PCR法（megaprimer PCR ) 3、环状诱变 PCR 法 4、TAMS 定点诱变技术

基因定点诱变的方法及原理基因定点诱变是指在特定位置引发基因突变的一种技术或方法。

通过基因定点诱变技术，可以精确地改变基因组中特定位置的碱基序列，从而研究或改变目标基因的功能。

目前常用的基因定点诱变方法主要有以下几种：1. CRISPR-Cas9系统：CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9）是一种基于RNA-DNA 相互识别的靶向基因编辑技术。

该系统利用Cas9蛋白通过结合到特定的DNA 序列来导向编辑目标位置，而CRISPR RNA（crRNA）和互补序列的转录过程产生了指导RNA（sgRNA）。

CRISPR-Cas9系统可以通过设计合成特定的sgRNA来诱导Cas9蛋白与目标基因的DNA序列结合，并在目标位点引入双链断裂，通过自然修复过程来实现基因突变。

2. TALEN系统：TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）是一种由TAL（Transcription activator-like）蛋白和核酸酶融合而成的基因编辑工具。

TAL蛋白可通过识别和结合特定的DNA序列来实现靶向基因编辑。

TALEN 系统利用设计合成的TAL蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，并通过酶活性诱导DNA的双链断裂，从而引发基因突变。

3. ZFN系统：ZFN（Zinc finger nuclease）是由锌指蛋白（Zinc Finger Protein）与核酸酶（nuclease）融合而成的一种基因编辑工具。

锌指蛋白能够识别和结合到特定的DNA序列上，而核酸酶则通过识别锌指蛋白与DNA结合后的底物序列引发DNA的切割。

ZFN系统利用设计合成的锌指蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，从而在特定的位置诱导DNA的双链断裂，进而引发基因突变。

食用菌杂交育种及诱变育种步骤食用菌杂交育种主要包括以下几个方面和步骤：一是选择亲本。

选择具有目的遗传性状并且孢子成熟的子实体。

二是弹射单孢子，将选择好的两个亲本的单孢子分别弹射到无菌滤纸上。

三是培养单孢子。

首先对两个亲本的单孢子进行连续稀释，然后进行培养，长成菌株后，对被污染的菌株及非单孢萌发的菌株进行淘汰。

四是交配试验。

将两个亲本所得到的单核菌丝进行组合配对试验，所有可能的组合都要进行，而后仔细观察交配后的反应。

五是在进行交配菌株的接触区两侧分别挑取一小块包括菌丝的培养基，然后接种到其他管内，并编号培养，然后鉴定双核菌丝真伪。

六是将所有产生锁状联合的杂交菌株进行扩大培养，制成原种、栽培种，通过段木栽培、瓶栽和袋栽，更进一步观察杂交菌株的各种性状，包括生产性状、抗逆性等。

七是将初步筛选出的杂交菌株进行进一步的生产试验，包括区域性试验，从而更加确定杂交菌株的各种性状，预估出杂交菌株的生产价值和推广价值，对于各项性状都理想的菌株要保留，并及时进行推广。

通过一系列的区域性试验和综合试验，确定杂交菌株的生产价值，淘汰不良菌株，保存理想菌株，及时推广应用。

杂交育种虽费工、费时，需要较好的实验设备和工作条件，成本比较高，但仍是目前最有效的育种方法。

食用菌诱变育种的优势是可以产生大量的变异，从而使人们可以在较大范围内选择优良的菌株。

诱变方法主要分为物理诱变和化学诱变。

诱变剂也有很多种，例如：X光线、紫外线、氮芥等等。

诱变育种的步骤可以概括为三步：第一步制作食用菌孢子悬浮液。

制作方法：将食用菌无菌孢子放入磷酸缓冲溶液或者生理盐水中，摇匀即可，浓度一般控制在每毫升溶液含有106～109个孢子为宜；第二步诱变处理，根据食用菌品种及条件选择适宜的诱变方法即可；第三步挑选优良菌株，该步骤是最关键的一步，也是工作量比较大的一个步骤，需要高度重视。

因为诱变处理后，只是扩大了变异的范围和变异量，而并不能说明所有的变异都是需要的，因此，要从大量的变异菌株挑选。

物理诱变育种利用辐射等物理诱变剂处理，诱发植物发生遗传变异，从而选育新品种称为物理诱变育种。

一、物理诱变剂的类别与性质很多因素都可以诱发植物发生突变，这些因素统称为诱变剂。

典型的物理诱变剂是不同种类的射线(图7-)。

育种工作者常用的是紫外线、X射线、γ射线和中子等。

各种辐射源的特性见表7-1。

图7-1 诱变育种应用的射线种类表7-1 各种辐射源的特性(一)紫外线是一种波长较长(200～390nm)、能量较低的低能电磁辐射，不能使物质发生电离，故属非电离辐射。

紫外线对组织穿透力弱，只适用于照射花粉、孢子等，多用于微生物研究。

紫外线的照射源是低压水银灯，材料在灯管下接受照射，其诱变作用视发射的光子波长而异，250～290nm区段相当于核酸的吸收光谱区，诱变作用最强。

(二)X射线X射线是一种核外电磁辐射，是原子中的电子从能级较高的激发状态跃迁到能级较低状态时发出的射线。

X射线发射出的光子波长约0.005—1nm，能量为50～300kev。

产生X射线的装置为X光机。

X射线的波长能量，对组织的穿透力和电离能力决定于X光机的工作电压和靶材料的金属性质。

X光机是在真空电场中高速电子打到金属靶区(如钨、钼)突然停下来发生的射线，X光机工作电压低，靶材料为钼靶时产生的是软X射线，其波长较长(0.1-1nm)，能量较小，穿透力较弱(有时几毫米)，在被照射物质中引起的电离较密集。

当X光机工作电压较高，靶材料为钨靶时，产生硬X射线，其波长较短(0.05-0.01nm)，能量较大，穿透力较强(可达许多厘米)，引起的电离密度较小。

一般育种中常用硬X 射线，应用铅板作防护，铅板厚度根据X射线波长变动，近年来，软X射线的育种应用日渐增多。

(三)γ射线γ射线是核内电磁辐射，是原子核从能级较高的激发状态跃迁到能级较低的状态时发出的射线。

与X射线相比，γ射线波长更短、能量更高、穿透力更强。

γ光子波长<0.001nm，能量可达几百万电子伏，可穿入组织很多厘米，防护要求用铅或水泥墙。

紫外诱变方法宋炜等：高产脂肪酶酵母菌株的分离筛选及紫外诱变中南林业科技大学学报，2009，29(3)：55-641．2．4 紫外诱变1．2．4．1 紫外诱变处理取2 mL处于对数生长期的菌液于直径75 mm 的无菌培养皿中，置于30 w 紫外灯下30 cm处，分别照射处理：30 S、45 S、90 S、120 S、180 S、240 S、300 S，每个处理重复3次，用罗丹明B平板计算存活率，得出诱变致死曲线。

每次紫外照射后在黑暗培养箱中静置30 min，然后在黑暗中稀释至1O-4、10-5倍，分别取0.1 mL涂于罗丹明B平板上，每级稀释液涂抹3个平板，以不进行照射作对照，紫外线照射以后的操作都在黑暗中进行，防止光修复。

将涂匀的平板，用黑布裹好，置于28℃恒温培养箱中避光培养4 d。

1．2．4．2 突变菌株的初筛将培养好的平板取出进行菌落计数，计算致死率。

致死率(%)=100一(处理后每0.2 mL菌落数／对照每0.2 mL菌落数)×100。

同时测量透明圈直径(D)和菌落直径(d)，用接种针挑取经不同剂量诱变的直径较大菌落，将相同处理剂量D／d比值大于对照D／d的菌落穿刺于同一个罗丹明B培养皿上，每皿点6个，黑暗条件下培养4 d。

1．2．4．3 突变菌株的摇瓶复筛从相同处理时间的初筛平皿中选取D／d最大突变菌株，28℃摇瓶培养72 h，离心取上清液测酶活力．孙同毅等：高产碱性蛋白酶菌株HAP26选育氨基酸和生物资源2007，29(2)：20～22 1．2．1诱变(1)NTG诱变处理将在10 g·L～N一甲基一硝基一N一亚硝基呱(NTG)溶液中浸泡过的滤纸片(‘p1．5 cm)放在涂满嗜碱芽孢杆菌HAP26的培养皿中央。

(2)N+离子注入条件本试验采用由郑州大学提供的离子注入机。

注入离子能量为30 Kev，单次脉冲时间为6 s，间隔时间为60 s，单次注入离子能量为×1014N+个数／cm2，真空度为5～6×10-3Kpa。

EMS的诱变处理方法：①EMS 母液的配制：为了安全和防上失效，配制前将需用的器皿，置冰箱内预冷，然后在冰浴中进行配制。

取0.5ml EMS原液，加人到10 ml pH7.2磷酸缓冲液中，加盖，并轻轻转动试管。

由于在水溶液中易失效，故尽可能低温保藏，并要现用现配。

②取新鲜的菌体，经前培养至对数期．离心洗涤，用缓冲液制成8 ml 菌悬液（107-108ml-1）。

对于丝状菌孢子，则前培养至萌动期，悬液含106 ml-1。

③取EMS母液2ml，加人到以8ml的菌悬液中。

在适宜温度下处理一定时间（根据预实验绪果确定）。

处理的最终浓度为0 .lmol／L。

对于真菌孢子，则为0.2-0.5rnol／L。

④EMS处理一定时间后，用50倍生理盐水稀释或加入一定量的2%NaS2O3溶液或多次离心、洗涤，以终止反应。

EMS是剧毒的诱变剂，在整个诱变过程，包括配制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接触皮肤，所有接触过EMS的器皿，单独用大量水冲洗洗涤，或用10％NaS2O3溶液浸泡过夜，再用清水冲洗干净。

亚硝酸是一稀常用的诱变剂，毒性小．不稳定，易挥发．其钠盐易在酸性缓冲液中产生NO 和NO2（一）亚硝酸的诱变机制脱去碱基中的氨基变成酮基，引起转换而发生变异。

A→H，C→U，G→X。

A：T→G：C和G：C→A：T。

亚硝酸的诱变也可以发坐回复突变。

亚硝酸除了脱氨基作用外，还可引起DNA交联作用，DNA复制，从而导致奕变。

（二）亚硝酸的处理方法1．试剂的配制（1）1mol／L pH4.5醋酸缓冲液（2）0.1mol／L亚硝酸钠溶液（3）0.07mol／L pH8.6磷酸氢二钠溶液以上试剂用前均要灭菌。

2．处理方法取孢子悬液1 ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及硝酸钠溶液lml，最后处理浓度为0.025 mol／L ；25-26℃保温10-20min，加入的磷酸氢二钠溶液20 ml，使出下降至pH 6. 8左右，以终止反应。