慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

慢病毒介导TGF-β2基因促进大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化【摘要】目的探讨慢病毒介导转化生长因子β1（tansforming growth factor bata 1，TGF －β1）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）诱导成软骨细胞分化的作用。

［方法］密度梯度离心法分离培养 BMSCs，探索病毒感染最佳条件，取第3 代细胞，分为实验组和对照组，通过慢病毒载体将外源性TGF －β1基因转染入细胞，观察绿色荧光表达情况，Ｒeal － time PCＲ法和 western blot 法检测 TGF －β1 基因的 mＲNA 和蛋白表达情况，7、14 d 时行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和Ｒeal － timePCＲ检测Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖的表达。

［结果］ TGF －β1 基因转染 BMSCs 后能够稳定表达。

转染 7、14 d 时，实验组免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色均为阳性。

转染 7、14 d 时，实验组 II 型胶原 mＲNA 均显著高于对照组（P ＜ 0. 01）。

转染 7 d 时，实验组聚集蛋白聚糖mＲNA 变化不明显，而 14 d 时显著高于对照组（P ＜ 0. 01）。

［结论］慢病毒介导的 TGF－β1 基因可成功转染大鼠 BMSCs，并诱导其向软骨细胞分化。

在此过程中软骨特异性标志Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的 mＲNA 表达具有时间差异性。

【关键词】骨髓间充质干细胞；成软骨分化；转化生长因子β1；慢病毒载体；大鼠软骨组织缺乏血管和神经，软骨细胞的营养供给主要是通过关节滑液和细胞周围的基质，其自身修复能力相当有限。

目前关节软骨退化性疾病在临床上有各种不同的治疗方法，但均不能达到十分理想的效果，近年来各个国家学者的研究证明，软骨组织工程与基因工程相结合的方式可能是软骨退行性改变相关疾病的有效治疗方法。

BMSCs结构相对简单，为具有特定生物学功能的多能干细胞，其具有来源广泛、取材简便、相对安全、体外增殖能力强、提取及体外培养方法已相对比较成熟等特点，并且其在一定的条件下可以分化为软骨、骨、脂肪、肌腱等组织的细胞。

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research文章编号:2095-4344(2019)01-00001-06 1www.CRTER .org·研究原著·常晓朋，男，1981年生，河南省洛阳市人，汉族，2010年河南中医药大学毕业，硕士，主治医师，主要从事脊柱关节创伤基础与临床研究。

通讯作者：常晓朋，硕士，主治医师，郑州大学附属郑州中心医院，河南省郑州市 450000文献标识码:A稿件接受：2018-10-22Chang Xiaopeng, Master, Attending physician, Zhengzhou Central Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, ChinaCorresponding author: Chang Xiaopeng, Zhengzhou Central Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China骨形态发生蛋白2和转化生长因子β2协同促进 骨髓间充质干细胞成骨分化常晓朋，陈 涛，赵 寅，梁 明(郑州大学附属郑州中心医院，河南省郑州市 450000) DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1519 ORCID: 0000-0002-2845-4085(常晓朋)文章快速阅读：文题释义：三维立体培养：利用各种方法及材料，使细胞呈空间立体方式生长，更接近于体内生长模式，形成类似体内组织的结构，发挥其功能。

细胞三维培养一方面能够为体外培养细胞提供与其组织来源相似甚至相同的细胞生长微环境和细胞联系，从而既有利于各类细胞的定向分化诱导，又有利于细胞分化表型的维持和增殖；另一方面可望在体外构建与各类组织、器官相应的细胞三维生长类似物或等同物。

慢病毒介导hHCN4基因体外转染骨髓间充质干细胞构建生物起搏器的实验研究的开题报告一、研究背景和意义心脏起搏器是治疗慢性心脏病的重要手段，但现有的电子起搏器存在着电池寿命短、感染率高等问题，其临床应用也受到限制。

近年来，基因治疗成为心脏起搏器研究的新方向。

心脏中的HCN4通道是在自律性心脏节律中起重要作用的离子通道。

骨髓间充质干细胞（BMSCs）源广、易获得，可通过体外培养稳定增殖，且对抗排异反应能力强，是构建基因治疗性生物起搏器的良好载体。

因此，本实验旨在探讨慢病毒介导hHCN4基因转染BMSCs，并将其应用于构建生物起搏器的可行性和技术路线。

二、研究内容和方法1. 实验内容：（1）制备慢病毒hHCN4基因载体，体外包装成慢病毒颗粒。

（2）提取并纯化骨髓间充质干细胞（BMSCs）。

（3）慢病毒介导hHCN4基因转染BMSCs。

（4）利用电生理学技术检测转染后BMSCs的膜电位变化。

（5）将转染后的BMSCs进行分化培养，并观察自律性节律的表现。

（6）实验组比较：未转染的BMSCs组、空载体病毒转染组和hHCN4基因慢病毒转染组。

（7）结果比较：采用Taqman荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光技术检测转染效率和蛋白表达水平的差异。

2. 方法：（1）制备慢病毒hHCN4基因载体，包装成慢病毒颗粒。

（2）提取并纯化骨髓间充质干细胞（BMSCs）。

（3）接种并培养BMSCs，转染慢病毒hHCN4基因载体。

（4）通过电生理学技术检测转染后BMSCs的膜电位变化。

（5）转染后的BMSCs进行分化培养，并观察自律性节律的表现。

（6）未转染的BMSCs组、空载体病毒转染组和hHCN4基因慢病毒转染组进行组间比较。

（7）采用Taqman荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光技术检测转染效率和蛋白表达水平的差异。

三、研究进展和预期结果目前已制备出hHCN4基因载体，并通过PCR、酶切、测序等方法进行鉴定。

脱蛋白骨联合VEGF基因转染治疗股骨头缺血坏死曹凯;黄伟;安洪;蒋电明;黄路【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2006(28)3【摘要】目的探索一种新的方法治疗股骨头早期缺血性坏死(avascular necrosis of the femoral head,AVNFH)。

方法69只AVNFH造模成功后的新西兰大白兔随机分成3组。

第1组,将脱蛋白骨(deprotein ized bone,DPB)复合pcDNA3.1/VEGF165质粒植入坏死的股骨头内,第2组植入DPB,第3组仅在股骨头内钻一隧道。

术后3 d,1、2、4、8和16周获取标本。

RT-PCR、W estern b lot和免疫组化技术分别检测VEGF165 mRNA、蛋白的表达及安全性。

X线大体观察成骨情况,组织形态学分析血管发生和股骨头修复。

结果第1组VEGF165 mRNA和蛋白表达术后1周达到高峰,时间持续超过3周,第1组动物术后远膈脏器未检测到VEGF165的表达。

血管形成术后2,4周增加,骨形成术后2,4和8周增加,与另两组相比差异有显著性(P<0.01)。

结论VEGF165基因转染可促进局部血管的早期形成,DPB-VEGF复合物可增加骨形成,VEGF基因治疗兔AVNFH有效、安全,脱蛋白骨联合VEGF165基因治疗为骨坏死的修复提供了理论基础。

【总页数】5页(P215-219)【关键词】脱蛋白骨;血管内皮生长因子;基因治疗;股骨头缺血坏死【作者】曹凯;黄伟;安洪;蒋电明;黄路【作者单位】重庆医科大学附属第一医院骨科;重庆医科大学儿童医院肾脏免疫科【正文语种】中文【中图分类】R322.71;R459.9【相关文献】1.VEGF165基因转染兔骨髓间充质干细胞治疗兔激素性股骨头坏死的实验研究 [J], 白志刚;巩凡;马军;孙玺淳;杨绿林;尚小可;李立新;黄朋2.酸性成纤维细胞因子复合部分脱蛋白骨修复早期股骨头缺血坏死的组织学改变[J], 朱肖奇;郭浩;葛宝丰3.慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗兔股骨头坏死 [J], 马跃刚; 李强; 陶旋; 周桢杰; 朱伦井; 段江涛4.慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗兔股骨头坏死 [J], 马跃刚; 李强; 陶旋; 周桢杰; 朱伦井; 段江涛5.VEGF基因转染结合脱蛋白骨修复股骨头坏死的实验研究 [J], 曹凯;黄伟;安洪;蒋电明;黄路因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

骨形态发生蛋白7转染骨髓间充质干细胞再生骨组织王平;顾煜琛;高志惠;孙铁锋;杨武斌【摘要】BACKGROUND:Bone morphogenetic protein-7 can promote proliferation of bone marrow mesenchymal stem cels and has important significance in terms of inducing new bone formation. OBJECTIVE:To observe the protein and mRNA expression of bone morphogeneticprotein-7 in bone marrow mesenchymal stem cels transfected with bone morphogenetic protein-7. METHODS:Rat bone marrow mesenchymal stem cels were isolated and cultured, and then identified by the morphologyand cel surface markers. Lentiviral vectors carrying bone morphogenetic protein-7 were constructed to transfect bone marrow mesenchymal stem cels. After total RNA extraction, the protein and mRNA expression of bone morphogenetic protein-7 was detected by RT-PCR and western blot methods. RESULTS AND CONCLUSION:PLV-sfGFP(2A)-BMP7 recombinant plasmids were successfuly constructed and transferred into rat bone marrow mesenchymal stem cels. The mRNA and protein expression of bone morphogenetic protein-7 in the transfection group was significantly higher than that in the blank vector and blank groups (P < 0.05), indicating exogenous bone morphogenetic protein-7 gene is effectively integrated into the bone marrow mesenchymal stem cels.%背景：骨形态发生蛋白7具有促进骨髓间充质干细胞分裂增殖的作用，在诱导新骨形成方面有重要的研究意义。

基因重组腺病毒载体与慢病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的对比李诗鹏;李强;石正松;蔡伟良;宁寅宽;陶旋【摘要】背景:腺病毒载体和慢病毒载体均是较好的组织工程基因载体,两者在介导骨形态发生蛋白2转染兔骨髓间充质干细胞中的差异尚待探究.目的:比较腺病毒和慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2转染体外培养兔骨髓间充质干细胞的转导效率、持续时间及外源基因表达差异.方法:将第5代兔骨髓间充质干细胞分3组培养,A组以腺病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2(Ad-EGFP/BMP-2)转染细胞,B组以慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2(Lenti-EGFP/BMP-2)转染细胞,C组为未进行转染.转染24 h、48 h、72 h、1周、3周,检测EGFP基因表达;转染72 h后,免疫组织化学观察细胞骨形态发生蛋白2的表达;转染后72 h、1周、3周,Western blot检测骨形态发生蛋白2蛋白表达.结果与结论:①转染24 h后,A、B组可见EGFP表达,A组明显强于B组;转染48 h后,A、B组荧光进一步增强;转染72 h后,A组荧光强度近高峰,B组荧光持续增强.转染1周后,A组荧光强度开始下降,B组荧光强度仍然增强.转染3周后,A组荧光强度明显下降甚至消失,B组荧光强度有所下降,但仍然保持一定的表达.C组在各时间点均无EGFP表达;②A、B组胞浆均呈骨形态发生蛋白2阳性表达,C组呈阴性表达;③转染72 h后,A组骨形态发生蛋白2蛋白表达量强于B组;转染1周后,A组表达下降,B组表达增强并强于A 组;转染3周后,A组表达微弱,B组持续表达且明显强于A组;④结果表明,相对腺病毒载体,慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2基因转染兔骨髓间充质干细胞在表达持续时间上具有一定的优势.%BACKGROUND: Both lentiviral vector and adenoviral vector are considered as good vectors for gene mediation, and their differences in transferring bone morphogenetic protein 2 (BMP-2)into rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are unclear. OBJECTIVE: To compare the duration, efficiency and the deviation of exogenous gene expression after rabbit BMSCs transfection using lentiviral vector and adenoviral vector which are used to mediate enhanced green fluorescent proteins (EGFP) and BMP-2. METHODS: Rabbit BMSCs at passage 5 were exposed to Ad-EGFP-BMP-2 (group A) or Lenti-EGFP-BMP-2 (group B) with multiplicity of infection of 100, as transfection groups. And in control group (group C), the same quality of culture medium was required equivalent to the groups A and B. The expression of EGFP was observed by inverted fluorescence microscope at various time intervals. And the expression of exogenous gene BMP 2 in cells was detected and analyzed by immunohistochemical staining at 72 hours after transfection as well as by western blot at 72 hours, 1, 3 weeks after transfection. RESULTS AND CONCLUSION: The intense green fluorescence emerged under the microscope at 24-48 hours after transfection in group A, which was stronger than group B, reached the peak at 72 hours, and then decreased at 1 week until disappearance at 3 weeks. No EGFP expression was detected in group C. High expression of BMP-2 was found in group A but was dramatically downregulated after 1 week. Group B showed the high expression of EGFP/BMP-2 persisted for a longer period after transfected that even lasted for 3 weeks. Overall, the lentiviral vector and adenoviral vector can efficiently transfect rabbit BMSCs and stably express the target gene of EGFP/BMP-2. Under the same MOI, compared to the adenoviral vector, transfection of lentiviral vector to rabbit BMSCs is moreeffectively and expression of EGFP/BMP-2 can be persistent in a longer term.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2017(021)009【总页数】6页(P1340-1345)【关键词】干细胞;骨髓干细胞;慢病毒载体;腺病毒载体;骨髓间充质干细胞;基因转染;骨形态发生蛋白类;国家自然科学基金【作者】李诗鹏;李强;石正松;蔡伟良;宁寅宽;陶旋【作者单位】桂林医学院附属医院急诊创伤外科,广西壮族自治区桂林市 541001;桂林医学院附属医院急诊创伤外科,广西壮族自治区桂林市 541001;桂林医学院附属医院急诊创伤外科,广西壮族自治区桂林市 541001;桂林医学院附属医院急诊创伤外科,广西壮族自治区桂林市 541001;桂林医学院附属医院急诊创伤外科,广西壮族自治区桂林市 541001;桂林医学院附属医院急诊创伤外科,广西壮族自治区桂林市 541001【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言 Introduction骨组织工程在治疗骨科疾病如骨缺损等方面展现了良好的前景[1]。