宁波全自动膜片钳实验原理及步骤

膜片钳实验技术入门------基本原理与操作关兵才 李国华 刘理望按：本文乃于2003年根据较旧型号的仪器写成，后被《机能实验科学》 （郑先科主编，北大医学版，2006）收入。

因新旧仪器基本原理和操作步骤大同小异，现对原文略作修改和标注，供同学们参考。

【实验目的】1. 了解膜片钳技术的基本原理和操作。

2. 初步学习电压依赖性离子通道电流的基本记录方法。

【实验原理】一、膜片钳技术原理简介膜片钳(patch clamp)是一种主要用于检测细胞膜离子通道活动的电生理技术，按工作方式可区分为电压钳(voltage clamp)和电流钳是最基本的工作方式，即对细胞膜电位进行人为控制，如将膜电位钳制于某一固定水平，或在此基础上再施以阶跃(step)式或斜坡式(ramp)电压刺激，同时记录跨膜电流，从而分析细胞膜通道的活动。

电流钳即人为控制经微电极对细胞进行注射的电流（等于离子通道电流与细胞膜电容电流之和），同时记录膜电位及其变化。

若注射电流为零即常用的零位钳流，用于测量细胞膜静息电位，若注射方波脉冲刺激电流，用于诱发、观测动作电位。

另外，膜片钳技术还常用于观测细胞膜电容, 从而推测分泌细胞的活动情况。

下面主要介绍其电压钳工作方式的基本原理。

（注：在电生理资料中，因通常将细胞外液和记录系统的“地”点相连作为参考点即零电位点，所以电位和电压两个概念经常混用。

）根据膜片钳实验中受检细胞膜的型式（configuration）不同，又可将膜片钳分为全细胞式(whole-cell)、细胞贴附式(cell-attached 或on-cell)、内面朝外式(inside-out)、外面朝外式(outside-out)等四种模式。

(一)全细胞式1．电压钳制和电流记录的实现图9-9为全细胞式膜片钳工作原理示意图。

图9-9 全细胞膜片钳实验原理示意图A1：运算放大器；A2：单倍增益差动放大器；R f：反馈电阻；V p：电极电位（A1反向输入端电位）；V c：A1同向输入端电位；C in：输入端杂散电容；C p：电极电容；Rs：串联电阻；C m：细胞膜电容；R m：细胞膜电阻；E m：细胞膜内在电位(指钳压时的细胞膜诸通道状态决定的内在Goldman-Hodgkin-Katz平衡电位)；V o：A2输出端电位；V-offset：偏移电位补偿电位；C c：用于电容补偿的电容；V c(app)：表观钳制电压即欲施加于受试膜片的电压；图中⊕和表示求和电路将充有电解质溶液的玻璃微电极（glass microelectrode或 recording pipette）利用负压紧密吸附于细胞表面，形成吉欧即千兆欧（109Ω）级高阻封接，进一步对微电极内施加负压、将放大器（以下简称运放）A1在深度负反馈工作状态下的“虚短路（virtual short circuit）”原理实现，即只要A1工作于线性范围内，其反向输入端的电位V p总是等于同向输入端的电位V c，这两个输入端之间虽非短路却类似于短路。

膜片钳使用规则一、工作原理：1.膜片钳是一种可以直接观察单一的离子通道蛋白质分子对相应离子通透难易程度等特性的一种实验技术。

其基本原理是用一个尖端光洁，直径约为0.5~3um 的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极另一端开口处施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在这一小片膜周边与微电极开口处的玻璃边沿之间，会形成紧密的封接，其电阻可达数个或数十个千兆欧，这实际上把吸附在微电极尖端开口处的那一片膜同其余部分的膜在化学上完全隔离出来，由微电极记录到的电流变化只同该膜片中通道分子的功能状态有关。

如果在这一小片膜中只包含了一个或少数几个通道蛋白分子，那么通过微电极测量出的电流，就是某种带电离子经由开放的单一通道蛋白质分子进行跨膜移动的结果。

二、操作步骤：1.打开总电源。

2.依次打开电脑、显微镜、监视器、微操、放大器。

3.打开PULSE软件，在E盘建立自己的文件夹。

4.灌注玻璃电极并排空气体。

5.装上玻璃电极，浸入液面并调至视野范围。

6.点击set-up，将增益调为0.5，点Auto，记录电极电阻。

7.封接细胞，若上G，提起或吸破细胞。

8.依次点击on-cell，whole-cell补偿。

9.选定In-out或whole-cell模式进行实验。

10.用毕请关闭仪器，并切断总电源。

三、注意事项：1.每天做实验前请用清水拖地，以防尘埃、静电伤害机器。

2.拉制仪使用前需预热15-30min。

3.银丝电极及地线发白时，请先用砂纸轻微打磨，再浸入新鲜的次氯酸钠溶液镀氯化银，如果银丝电极30min未变黑，则考虑更换次氯酸钠。

4.先开放大器，后开软件；先关软件，后关放大器。

5.非必须用到汞灯时请不要打开汞灯电源，打开后至少需1个小时才可关闭。

6.在放大器打开时绝对不能用手、金属物品或其它导电的物品接触电极丝（包括地线），在取放细胞片时请关闭放大器。

7.向玻璃微电极灌注内液时切勿灌太多（1cm左右为适），以防液体进入银丝底部增加噪声。

宁波神经生物学膜片钳技术原理神经科学中，膜片钳技术是一种非常重要的实验方法，可以用于记录细胞内外的电位变化。

宁波神经生物学膜片钳技术是一种经典的膜片钳技术，它是由中国神经科学家于1976年发明并发表的。

宁波神经生物学膜片钳技术是一种完美结合电荷动力学和化学物理学原理的技术，能够非常精确地记录神经元膜内外的电位变化。

宁波神经生物学膜片钳技术使用的是一种特殊的仪器，称为电压钳扳平仪。

它能够通过光学系统将微小的电压变化转换成可视化的信号。

在这个仪器的帮助下，实验者可以观察到细胞内的微小电位变化。

通常，这种变化只有几毫伏甚至只有几微伏。

该技术主要是通过控制电压钳的外径，使之与神经细胞的细胞膜缩在一起。

一旦电压钳缩在神经细胞膜上，就能够记录该细胞内外的电位变化。

使用宁波神经生物学膜片钳技术进行记录时，需要将一小块玻璃切成一小片，并将其与电压钳结合。

之后，将整个电路与一片外部电极连接，从而能够读取到神经细胞内外的电位变化。

一旦成功固定上述组件，实验者就可以观察到神经细胞膜上的电压变化。

通过对电位变化进行分析，实验者可以非常准确地计算神经细胞离子通道的开放概率。

宁波神经生物学膜片钳技术是一种非常重要而且精确的实验方法，能够帮助神经生物学研究者更好地了解神经元的电学性质。

该技术能够以先进、精确的方式记录细胞内外的电压变化，并通过对这些变化进行分析，获得对离子通道开放概率的准确计算。

利用宁波神经生物学膜片钳技术可以更深入地了解神经元病理生理学，为探索神经系统的基本问题提供有力的工具。

除了记录神经元膜内外的电位变化，宁波神经生物学膜片钳技术还可以用于研究离子通道动力学和突触传递。

利用该技术可以研究离子通道的不同类型、大小及其开放概率等，以及神经元膜上不同离子通道的作用关系，这对于理解神经元的电气特性和调节机制非常重要。

宁波神经生物学膜片钳技术还可以研究神经元突触传递信号的方式。

通过记录神经元膜内外电位变化，可以观察到神经元突触释放的神经递质导致的膜电位变化，并对神经元突触传递功能进行研究。

膜片钳技术的基本原理膜片钳技术运用微玻管电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以千兆欧姆[gigaohm seal,1010欧姆（GΩ）]以上的阻抗使之对接，使与电极尖开口处相接的细胞膜小片区域（膜片）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA 级）进行检测记录。

膜片钳技术的原理及应用（综述）Intro：细胞是构成生物体的基本单位。

细胞内和细胞之间的信号传导的重要途径是通过镶嵌在细胞膜上的离子通道蛋白进行的。

1976年，德国的两位细胞生物学家埃尔温. 内尔（Erwin Neher）和贝尔特. 萨克曼（Bert Sakmann）建立了一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一或多数离子通道分子活动的技术，成为膜片钳技术（Patch Clamp）。

这一技术使对细胞电活动的研究精度提高到1pA的电流分辨率，1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率水平，是细胞和分子水平的生理学研究领域的一次革命性突破。

它与基因克隆技术（Gene Cloning）并驾齐驱，推动了生命科学研究的迅速发展。

为此，1991年的诺贝尔医学与生理学奖授予了这两位学者，以表彰他们的突出贡献。

这一能精确描述细胞通道特征的实验方法在问世后的短短十几年时间里，已经在生物学研究领域显示出了非常重要的意义和广阔的应用前景。

一. 膜片钳技术的基本原理膜片钳技术运用微玻管电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以千兆欧姆[gigaohm seal,1010欧姆（GΩ）]以上的阻抗使之对接，使与电极尖开口处相接的细胞膜小片区域（膜片）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行检测记录。

（如图1）图1 膜片钳技术原理图Rs是与膜片阻扰相串联的局部串联电阻（或称入路阻扰），Rseal是封接阻抗。

Rs通常为1-5MΩ，若Rseal高达10GΩ以上时成为Ip/I=Rseal/（Rs+Rseal）-1，此Ip可作为在I-V转换器（点线）内的高阻扰反馈电阻（Rf）的电压下降而被检出。

膜片钳记录系统仪器简介：膜片钳技术是细胞电生理方面的高端技术，是研究细胞膜离子通道的重要工具。

目前细胞膜离子通道的研究已经应用到了药物作用、环境对细胞膜离子通道的影响、神经网络研究以及疾病的诊断和治疗等多个领域。

膜片钳技术是神经科学、心血管、药物学和药效学、功能基因组学和许多遗传病深入研究的有力手段。

仪器名称：膜片钳记录分析系统主要设备：PC-2B放大器、AXON200B放大器、正置显微镜、倒置显微镜、NIR-DIC 成像系统、水镜头、微操纵器、微电极拉制仪、抛光仪、振动切片机等。

仪器功能及应用范围：单细胞膜片钳记录（急性分离细胞、培养细胞）、脑片膜片钳记录（盲法、可视法）收费标准：培训费：1个月以内—500元；1~3个月—1000元。

指导操作：院内20元/小时，院外40元/小时。

独立操作：院内60元/天，院外120元/天（由两位指导老师认可培训合格，方可进行独立操作）。

开放时间：周一至周五管理规定：⑴膜片钳记录分析系统属于高端精密仪器，因此任何进入本室进行膜片钳实验的人员，必须经过本室专门人员培训合格认可后，经允许方可进行膜片钳放大器、微操纵器、拉制仪、切片机、显微镜等仪器的操作。

⑵在实验过程中，必须严格按照实验流程进行操作，不得擅自更改操作步骤，不许自行调改仪器设置，以免造成仪器毁损。

⑶仪器损坏赔偿事宜按照我室赔偿制度进行处理。

⑷统一安排实验时间，使用仪器后作登记。

⑸实验人员负责当天的水电安全和室内卫生。

脑片膜片钳实验流程(PC-2B)一、脑片制作1.配制新鲜蔗糖溶液（4°C）和NaCl孵育液（室温，20~25°C）各1L。

2.用丙酮浸泡刀片30 min。

3.麻醉动物：爪蟾—MS-222，大鼠—乌拉坦。

4.解剖动物，取脑组织。

5.切片：根据不同的动物和组织选择不同的方案。

方案一：低熔点琼脂包埋组织后进行切片。

方案二：普通琼脂作托进行切片。

6.处理脑片：蔗糖溶液中40～60min（4°C或32°C）。

宁波全自动膜片钳实验原理及步骤一、前言宁波全自动膜片钳是一种常用的实验仪器，主要用于测量材料的拉伸性能和压缩性能。

该仪器具有精度高、操作简单等特点，被广泛应用于材料科学、机械工程等领域。

二、原理宁波全自动膜片钳主要由电机、减速器、传感器、控制系统等部分组成。

其工作原理如下：1.拉伸测试将待测样品夹在两个夹具之间，然后通过电机带动一个夹具向前移动，另一个夹具向后移动，从而使样品产生拉伸变形。

同时，传感器可以实时监测样品的变形量，并将数据传输给控制系统进行处理和分析。

2.压缩测试将待测样品放在测试台上，在上下两个平板之间施加压力，从而使样品发生压缩变形。

同样地，传感器可以实时监测样品的变形量，并将数据传输给控制系统进行处理和分析。

三、步骤使用宁波全自动膜片钳进行实验需要按照以下步骤进行：1.准备工作首先需要对仪器进行检查和维护，确保其正常运行。

同时，需要准备好待测样品，并根据实验要求选择合适的夹具。

2.设置参数根据实验要求，在控制系统中设置相应的测试参数，如测试速度、测试力等。

3.安装样品将待测样品夹在两个夹具之间，并调整夹具间距和夹紧力，使其符合实验要求。

4.进行测试按下启动按钮，仪器开始进行拉伸或压缩测试。

在测试过程中，可以通过控制系统实时监测样品的变形量和力值，并记录下相关数据。

5.分析结果根据实验数据，可以对样品的拉伸性能或压缩性能进行分析和评价。

同时，还可以通过对比不同材料、不同条件下的实验结果来研究材料特性和性能变化规律。

四、注意事项1.在使用宁波全自动膜片钳进行实验时，需要严格按照操作规程进行，避免误操作或操作失误导致事故发生。

2.在安装样品时，需要注意夹具间距和夹紧力的调整，以保证测试结果的准确性。

3.在进行拉伸或压缩测试时，需要控制好测试速度和力值，避免样品过度变形或破坏。

4.在分析实验结果时，需要结合实验要求和实际情况进行综合评价，避免片面或误导性结论的出现。

五、总结宁波全自动膜片钳是一种重要的材料测试仪器，其工作原理和操作步骤相对简单，但在使用过程中需要注意安全和准确性。

膜片钳技术原理膜片钳技术是一种常见的实验技术，广泛应用于生物学、药理学、细胞生物学等领域。

它是利用一种特殊的仪器，通过对细胞膜的控制和操作，实现对细胞内外环境的调控和研究。

膜片钳技术的原理主要涉及到膜片形成、膜片钳的构造和工作原理等方面，下面将对这些内容进行详细介绍。

首先，膜片的形成是膜片钳技术的基础。

膜片是由玻璃或石英毛细管制成的，其内外涂有一层导电性金属。

在形成膜片的过程中，需要将毛细管和细胞膜接触，利用毛细管的吸附作用将细胞膜抽附到毛细管上，形成一个微小的膜片。

这一步骤的关键是要保持膜片的完整性和稳定性，以确保后续实验的准确性和可靠性。

其次，膜片钳的构造是实现膜片钳技术的重要工具。

膜片钳通常由微操作系统、压力控制系统、电压控制系统等组成。

微操作系统用于控制膜片的形成和定位，压力控制系统用于控制膜片与细胞膜的接触压力，电压控制系统用于记录和调节膜片与细胞膜之间的电压变化。

这些系统的协同工作，使得膜片钳能够对细胞膜进行高度精准的操作和控制。

最后，膜片钳技术的工作原理是通过对膜片与细胞膜之间的接触和电学特性的测量，实现对细胞内外环境的调控和研究。

在实验中，可以通过改变膜片与细胞膜的接触压力和电压，观察细胞膜的电学特性和通透性的变化，从而研究细胞的离子通道、受体通道等功能。

同时，也可以利用膜片钳技术对细胞内外环境的离子浓度、pH值等进行精准调控，以研究细胞的生理和病理过程。

总之，膜片钳技术是一种重要的细胞生物学实验技术，其原理涉及膜片的形成、膜片钳的构造和工作原理等方面。

通过对这些原理的深入理解和掌握，可以更好地应用膜片钳技术进行细胞内外环境的调控和研究，为生物学、药理学等领域的研究工作提供重要的技术支持。

膜片钳记录法（Patch Clamp Recording）是一种生理学实验技术，用于测量细胞膜离子通道或受体的电生理特性和活动。

该技术的基本原理是使用微型玻璃电极将一个非常小的玻璃管（称为膜片）贴附到单个细胞的表面上，从而形成一个微小的、高阻抗的突触点。

然后在膜片和细胞膜之间形成一个密封，并使用微电极或电极芯片记录跨越这个突触点的电位变化。

这种技术可以测量非常小的电流变化（尤其是亚毫安级别），因此非常适合研究离子通道和受体的活动。

通过控制细胞环境的情况，例如改变温度、pH值或添加化学物质，可以进一步调节离子通道和受体的电生理属性及其响应模式。

这种方法还可以用于研究各种细胞类型的电生理特性，包括神经元和心肌细胞等。

膜片钳记录法是一种十分精密的技术，在操作过程中需要非常小心谨慎，以避免损坏细胞或膜片。

同时，该技术需要一定的专业知识和设备支持，因此通常由有经验的生理学家和技术人员来执行。

总之，膜片钳记录法是一种重要的电生理技术，已经成为研究离子通道和受体的电生理学特性的关键工具之一，对于揭示神经、心血管等多种疾病的发病机制和治疗方法也具有重要意义。

膜片钳技术1、膜片钳技术原理膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。

膜片钳的基本原理则是利用负反馈电子线路，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。

膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗数值可达10～100 GΩ(此密封电阻是指微电极内与细胞外液之间的电阻)。

由于此阻值如此之高，故基本上可看成绝缘，其上之电流可看成零，形成高阻密封的力主要有氢健、范德华力、盐键等。

此密封不仅电学上近乎绝缘，在机械上也是较牢固的。

又由于玻璃微电极尖端管径很小，其下膜面积仅约1 μm2，在这么小的面积上离子通道数量很少，一般只有一个或几个通道，经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少，可以忽略，也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略，那么，只要保持电极内电位不变，则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变，从而实现电位固定。

膜片钳技术的原理图[51]Rs是与膜片抗阻串联的局部串联电阻（或称入路阻抗），Rseal是封接阻抗。

RS通常为1~5MΩ，如果Rseal高达10GΩ以上是成为Ip/I=Rseal/(Rs+Rseal)-1。

此Ip可作为I~V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻（Rf）的电压下降而被检测出。

实际上这是场效应管运算放大器（A1）的输出中包括着膜电阻成分，这部分将在通过第二级场效应管运算放大器（A2）时被减掉。

本实验采用的是全细胞记录模式。

全细胞记录构型(whole-cell recording)高阻封接形成后，继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂，电极胞内液直接相通，而与浴槽液绝缘，这种形式称为“全细胞”记录。