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微生物生产维生素C的发酵工艺优化与控制-----维生素C二步发酵培养基优化实验方案20 世纪 70 年代初，我国科学家尹光琳等建立了一种工业生产 VC 的混菌发酵工艺，因其由两个发酵步骤组成，故又称为“二步发酵法”。
虽然该方法涉及二步三种菌，菌种传代困难，不能直接把葡萄糖作为发酵原料，但该方法仍是目前唯一成功应用于大规模工业生产V-c的微生物转化法，得到国内外V-c生产商的高度评价，先后在中国、欧洲、日本和美国等申请了专利，并于上世纪80年代向全球最大的维生素生产商———瑞士Roche公司进行了技术转让。
二步发酵法第2步发酵过程中，作为产酸菌的氧化葡萄糖酸杆菌起到糖酸转化的作用，但单独存在的转化率很低；作为伴生菌的巨大芽孢杆菌不具有糖酸转化的能力，但可以促进前者提高转化效率。
由于其有关酶系和混菌发酵过程中菌体代谢机理尚不十分明确，故二步发酵法有待进一步深入研究。
本实验方案主要从发酵培养基优化方面入手，采用正交设计方法，对发酵培养基中的主要营养成分配比开展研究，并对得到的最优组合进行了验证和讨论。
维生素C的生产工艺菌种选择维生素C工业生产中,高效菌株的选育是提高产率的关键。
氧化葡萄糖酸杆菌为产酸菌,但单独培养传代存活率及产2-酮基-L-古龙酸能力均较低,只有与伴生菌混合培养才可促使其快速生长和产酸。
作为伴生菌的菌株较多,生产上应用的主要有假单孢菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等。
优良伴生菌———在混合菌发酵过程中,大菌所起的作用仅仅是促进小菌的生长,而对产酸的促进作用是因使小菌密度提高的结果。
用紫外线诱变法处理巨大芽孢杆菌与氧化葡萄糖酸杆菌，混合发酵生产2-KLG的山梨糖转化率高达90%。
故选择巨大芽孢杆菌作为大菌，氧化葡萄糖酸杆菌为小菌。
培养基维生素C的培养基包括碳源（葡萄糖）、氮源（玉米浆）、前体（D-山梨醇）、无机盐等（CaCO3）等。
玉米浆具有酸性性质，需要用磷酸缓冲液调节PH。
２－酮基－Ｌ－古龙酸（简称２－ＫＬＧ）是合成维生素Ｃ的重要前体。
我国的维生素Ｃ生产采用“二步发酵法”，其中第二步发酵是由Ｌ－山梨糖转化为２－ＫＬＧ，此过程由巨大芽孢杆菌（俗称大菌）和酮古龙酸杆菌（俗称小菌）两种菌的混合发酵，利用Ｌ－山梨糖氧化生成２－ＫＬＧ。
两菌的生物学特性不同，小菌与大菌间既有共生作用，又有拮抗作用。
普遍认为，小菌微产古龙酸菌，单独培养时，生长较弱，产酸很少；大菌为小菌的伴生菌，不产酸，在有大菌的参与下，小菌生长很好且产酸较快。
大菌对小菌的影响表现在对小菌数量和产酸速率的促进。
有关大菌对小菌的影响，吕淑霞等认为，大菌在发酵过程中会产生几种蛋白质，这些蛋白质共同作用从而促进小菌产生２－ＫＬＧ［１］；王淑娟等对大菌的伴生活性进行了相关研究和分析［２］。
但是具体是何物质对小菌产生了如此大的影响，本文通过对大菌培养液上清分离并探讨了不同组分对小菌的影响。
１实验材料和方法１．１材料１．１．１菌株酮古龙酸杆菌（小菌）、巨大芽孢杆菌（大菌）。
１．１．２培养基ＬＢ液体培养基ｐｅｐｔｏｎｅ（日本产）１．０％、ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ（英国产）０．５％、ＮａＣｌ０．５％；ｐＨ７．２，分装５０ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶，１２１℃，２５ｍｉｎ灭菌。
ＬＢ固体培养基ｐｅｐｔｏｎｅ（日本产）１．０％、ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ（英国产）０．５％、ＮａＣｌｌ０．５％、ａｇａｒ２．０％；ｐＨ７．２，１２１℃，２５ｍｉｎ灭菌。
种液培养基Ｌ－山梨糖２．０％、玉米浆０．５％、尿素０．１％、葡萄糖０．１％、碳酸钙０．２％；ｐＨ６．７，分装５０ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶，１２１℃，２５ｍｉｎ灭菌。
发酵培养基Ｌ－山梨糖８．０％（单独灭菌）、玉米浆１．０％、酵母膏０．２％、尿素１．２％（单独灭菌）、磷酸二氢钾０．１％、硫酸镁０．０１％、ｐＨ７．０，分装２０ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶，１２１℃，２５ｍｉｎ灭菌。
１．２方法１．２．１小菌菌悬液的制备保藏的小菌甘油管，接种到ＬＢ液体培养基中，２９℃，２２０ｒ／ｍｉｎ培养１６ｈ，其ＯＤ６００＝０．２－０．３。
第三章发酵代谢及其调节控制第一节发酵过程的代谢变化第二节发酵过程调节控制一次成功的发酵同时受到两方面因素的制约，一是生产菌种的遗传特性，二是发酵条件，因此，必须了解有关环境条件对生产菌种的影响，因地制宜地适应菌种的特性，测定发酵过程中各种参数的变化规律，才能有效地实现发酵工艺的优化和控制。
第一节发酵过程的代谢变化由于发酵过程的复杂性，使得发酵工业生产过程的在线监控比其他行业落后，其重要原因是有效检测过程状态变量的传感器质量不过关，以至很难实现在线分析和控制。
变化过程中的参数可分为物理参数、化学参数、生物学参数等，但目前较多的测定参数仅包括温度、罐压、空气流量、搅拌转速、pH值、溶氧、糖含量、菌体浓度、基质浓度等，且其中大多数为非在线测定。
一、与代谢变化有关的参数1、温度：影响微生物的生长代谢、系统中酶的反应速率、溶氧量、菌体的浓度变化、产物合成等等。
注意：微生物生长和产物合成的温度要求不同；发酵过程中的发酵热，包括生物热、搅拌热、蒸发热、辐射热等等影响发酵过程的温度变化。
（一）物理参数：2、罐压：作用：形成正压，防止污染增加溶氧，但二氧化碳的溶解量也上升，因此罐压不宜太高；减少泡沫（一）物理参数：3、搅拌参数：（转速、功率）作用：增加溶氧，但也与泡沫形成等有关；搅拌功率：影响传氧效率；菌体损伤（尤其是丝状真菌）（一）物理参数：4、空气流量流量越大，泡沫越多，发酵液总体积上升，装料系数下降；流量越大，空气在罐内停留时间短，氧的有效利用率下降，耗电量上升；罐外相对湿度一般为60%，出罐时100%，带走水分，蒸发量大。
（一）物理参数：5、空气湿度（尤其对固态发酵重要）湿度低，不易染菌，但太低，发酵液挥发速度上升，液体体积下降，不利于发酵。
以空气湿度60%利于发酵。
（一）物理参数：6、溶解氧浓度与氧的传递能力关：搅拌速率；发酵罐内的结构（挡板等）；料液黏度；发酵液本身摄氧率（一）物理参数：7、发酵液的表观黏度：表观黏度越大，溶氧能力越弱与发酵液成分有关；与液化糖化程度有关；与菌体浓度，菌种种类（如有无荚膜）、菌种代谢特性有关；与噬菌体污染有关。
维生素C前体2-KGA发酵过程建模及基质流加优化维生素C是人和其他一些灵长类动物不能合成又必需的一种营养元素，不仅在医药和保健品行业有极大的需求，在食品饮料行业、饲料行业和化妆品行业也有着广泛的应用。
世界市场上维生素C需求量巨大，而且以每年约3-4%的速度在增长。
维生素C两步发酵法（俗称二步法）是目前维生素C主流生产方法，包含两步发酵，第一步是从D-山梨醇发酵生成L-山梨糖，第二步是从L-山梨糖发酵生成维生素C前体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。
二步法的第二步是本文的研究对象。
本文以提高L-山梨糖到2-KGA发酵过程的产率和转化率为主要目标，研究了发酵条件对2-KGA发酵的影响，对2-KGA混菌发酵过程进行了建模研究，并基于模型进行了优化控制研究。
具体研究工作如下所述：通过实验研究了影响2-KGA发酵的一些关键条件，如初始MgSO4·7H2O浓度、初始L-山梨糖浓度、温度和pH等。
关键条件的优化是基于维生素C现有工业生产规范的调整。
对初始MgSO4·7H2O浓度和初始L-山梨糖浓度对2-KGA发酵过程的得率和产率影响，分别实施了单因素实验，对二者初始浓度进行了优化。
对2-KGA发酵中pH和温度的影响也进行了单因素实验优化，结果表明，分阶段pH控制有利于缩短发酵周期，而调高发酵温度设定值有利于提高2-KGA最终浓度，但只适用于在发酵接近终点时使用。
建立了2-KGA发酵过程的非结构化模型。
2-KGA发酵过程的模型化比较困难，遵循循序渐进的原则，首先进行了非结构化模型的建模研究。
2-KGA发酵过程涉及到氧化葡萄糖酸杆菌（俗称小菌）和巨大芽孢杆菌（俗称大菌）两个菌株，它们的相互作用比较复杂。
已有的2-KGA发酵过程建模均采用Monod型模型描述大小菌的生长。
然而，Monod型模型不能完全描述大小菌混合培养时所表现的生长特征，如大菌完全死亡或变成芽孢，小菌在大菌死亡时快速生长，在大菌变成芽孢或死亡后小菌缓慢生长等。
维生素c的发酵流程(总24页)本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March目录1绪论1.1引言-------------------------------------------------------------------- 1.2维生素c-------------------------------------------------------------- 1.2.1维生素c的性质-------------------------------------------- 1.2.2维生素c的功能与用途-----------------------------1.2.3维生素c的生产现状------------------------1.2.4维生素c的发展状况-------------------------2.发酵机制2.1我国维生素C二步发酵法发酵机制------------3.发酵工艺及特点--------------------------3.1二步发酵法---------------------------3.2二步发酵法生产维生素C的工艺流程----------3.2.1加热沉淀法--------------------------------3.2.2化学凝聚法--------------------------3.2.3超滤----------------------------3.2.4其他方法---------------------4.菌种培养基及种子的扩大培养-------------4.1第一步发酵-----------------------4.1.1菌种----------------------------4.1.2一级种子扩大培养----------------4.1.3第一步发酵培养-----------------4.2第二步发酵---------------------------4.2.1菌种---------------------------------4.2.2二级种子扩大培养---------------4.2.3第二步发酵培养----------------------5.发酵工艺中的部分设备-------------5.1机械搅拌罐---------------------5.2气升式发酵罐----------------------6.无菌空气制备系统-------6.1发酵空气的标准-----------6.2空气预处理与设备------------------6.3空气除菌的工艺流程-----------------7.部分工艺计算---------------7.1物料衡算-------------------7.2每天发酵液体积----------------7.3发酵罐公称体积--------------------7.4种子罐容积和台数------------------7.5种子罐公称体积-------------------7.6发酵罐发酵过程中热效应计算-------------8.三废处理----------------------8.1三废生物处理的目的-------------8.2废水处理方法--------------------------8.3生物滤过法净化处理------------8.4生物滤过池法的基本流程--------------------- 9参考文献-------------------------------维生素C的发酵生产1绪论1.1引言维生素C（英语：Vitamin C，又称L-抗坏血酸）是高等灵长类动物与其他少数生物的必需营养素。
VC二步发酵中伴生菌的作用机制作者：褚冬领陈宏战张高鹏张志岩来源：《中国化工贸易·下旬刊》2019年第07期摘要：Vc二步法发酵是我国常见的工业化生产方法。
本文研究了Vc二步法发酵相关菌的作用机理。
关键词：巨大芽孢杆菌;氧化葡萄糖酸杆菌;2-酮基-L-古龙酸在Vc生产的二步发酵过程中，混合菌发酵是第二步发酵，利用芽孢杆菌与产酸菌的协同作用，实现了L-山梨醇向2-酮基-L-古龙酸的转化。
生酮古龙酸细菌是产酸细菌，负责糖和酸的转化。
但单独培养存在产酸低、菌体薄的缺陷;相关的伴生菌没有参与糖酸的转化过程，而能促进产酸菌的生长和产酸。
1 Vc简介Vc又称L-抗坏血酸，化学名称为L-2，3，5，6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯，其分子式为C6H8O6。
纯Vc呈白色或淡黄色晶体，无臭、味酸，久置后呈黄色，溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚、氯仿。
其是以内酯形式存在的不饱和多羟基六碳水化合物，氢在2到3个碳原子之间的醇羟基可分解，所以它具有酸性。
在pH此外，Vc还被广泛认为是一种重要的抗氧化剂，参与体内许多羟化反应，是促进胶原合成、胆固醇转化和类固醇激素合成、芳香族氨基酸代谢等多種羟化酶的辅助因子。
因Vc应用的多样化，广泛应用于食品、医药、饲料、化妆品等行业，具有广阔的应用前景。
2 我国“二步发酵法”的研究自二步发酵法建立以来，为了将其进一步完善与改进，许多科学家进行了大量的研究。
经许多厂家不断实践、改进和完善后，已逐步在全国推广使用。
另外，Vc的生产受到很多因素的影响，如何使各因素协调一致，是提高Vc生产效率的关键所在。
对“二步发酵法”生产的2-酮基-L-古龙酸的发酵体系，细胞的生长代谢受基质浓度、培养基的成分组成、pH、温度、溶氧饱和度等外部条件的影响，并且也受到混合菌株间的相互作用影响，同时良好的产量和合理的搭配也是影响发酵的重要因素之一。
因此，优良菌株的选育、工艺路线的制定、混合菌的合理搭配与相互关系、代谢途径及相关酶的研究具有重要意义。
发酵法生产维生素C的综述摘要：维生素C（英语：Vitamin C，又称L-抗坏血酸）是高等灵长类动物与其他少数生物的必需营养素。
抗坏血酸在大多的生物体可借由新陈代谢制造出来，但是人类是最显著的例外。
最广为人知的是缺乏维生素C会造成坏血病。
在生物体内，维生素C是一种抗氧化剂，保护身体免于自由基的威胁，维生素C同时也是一种辅酶。
其广泛的食物来源为各类新鲜蔬果。
维生素C（英语：Vitamin C，又称L-抗坏血酸）为酸性己糖衍生物，是稀醇式己糖酸内酯，Vc主要来源新鲜水果和蔬菜，是高等灵长类动物与其他少数生物的必需营养素。
Vc有L-型和D-型两种异构体，只有L-型的才具有生理功能，还原型和氧化型都有生理活性。
其结构是一种含有6个碳原子的酸性多羟基化合物，分子式为C6H8O6，分子量为176.1。
天然存在的抗坏血酸有L型和D型2种，后者无生物活性。
维生素C是呈无色无臭的片状晶体，易溶于水，不溶于有机溶剂。
在酸性环境中稳定，遇空气中氧、热、光、碱性物质，特别是由氧化酶及痕量铜、铁等金属离子存在时，可促进其氧化破坏。
氧化酶一般在蔬菜中含量较多，故蔬菜储存过程中都有不同程度流失。
但在某些果实中含有的生物类黄酮，能保护其稳定性。
0 前言维生素C的发酵是指通过发酵作用将原料转化为维生素C，再通过生物分离技术将其从发酵液中分离提纯，获取满足要求的维生素C产品。
维生素C的发酵过程中包含菌种的培育、菌种的保藏、种子的制备、发酵动力学、发酵环节的控制和染菌及防治六个方面。
概括地说，在发酵的整个过程中要选育出优秀的发酵菌种并采取合理有效的方法予以保藏，保持其优良性状；在实际生产时要对菌种进行扩大培养，满足生产上对发酵菌的数量要求；对于发酵还应全面的考虑发酵的消耗、产率问题，并通过适当的控制方法提高效率；染菌和污染是发酵过程中的一个非常严重的问题，需要严格控制，频繁检测确保发酵罐安全，避免或较小损失。
1 发酵机制目前，维生素C发酵主要有葡萄糖发酵和山梨醇发酵，工业中使用的发酵方法分别为莱氏法和二步发酵法。
维生素C的制备--浅析两步发酵法生产维生素C技术㈠维生素C简介中文名称：维生素C英文名称：vitamin C其他名称：抗坏血酸(ascorbic acid)定义：显示抗坏血酸生物活性的化合物的通称，是一种水溶性维生素，水果和蔬菜中含量丰富。
在氧化还原代谢反应中起调节作用，缺乏它可引起坏血病。
结构式：物理性质外观：无色晶体熔点：190 - 192℃沸点：（无）紫外吸收最大值：245nm荧光光谱：激发波长－无nm，荧光波长－无nm溶解性：水溶性维生素比旋度：+20.5°至+21.5°化学性质分子式：C6H8O6分子量：176.13IUPAC名：2,3,4,5,6-五羟基-2-己烯酸-4-内酯酸性，具有较强的还原性，加热或在溶液中易氧化分解，在碱性条件下更易被氧化，为己糖衍生物。
［1］㈡两步发酵法制备维生素C：历史：我国从1969年开始在微生物发酵-化学合成法的基础上进行维生素C二步发酵生产工艺的研究，在1974年取得很大成功，是目前唯一成功应用于维生素C工业生产的微生物转化法。
意义：两步发酵法生产维生素C，实质上是通过微生物发酵法代替莱氏法中的化学合成阶段，避免了丙酮，酸，碱或苯等有机溶剂的大量使用。
其工艺是D-葡萄糖以为原料，经催化氧化得D-山梨醇，然后经两步发酵（微生物氧化）得2-酮基-古龙酸，再经转化得葡萄糖。
目前在我国已应用于生产，因其简化和缩短了莱氏法，加快了维生素C的生产速度，具有一定的优越性。
［2］制备流程：（1）D-山梨醇的制备原理：D-山梨醇是己六醇化合物，含有4个手性碳原子，具有D-葡萄糖的构型，故将D-葡萄糖C-1上的醛基还原成醇基而制得［3］［4］工艺过程：将水加热至70-75℃，在不断搅拌下，逐渐加入葡萄糖至全溶，制成50%葡萄糖水溶液，再加入活性炭75，搅拌10min,滤去碳渣，然后用石灰乳液调节PH 至8.4。
料液压到氢化釜！，加入骨架镍催化剂（葡萄糖量的20%），通入氢气，于3.43MPa ，140反应至不吸收氢气为反应终点，料液先静置沉降，除去催化剂，再经离子交换树脂,活性炭处理后，减压浓缩至浓度60%-70%的无色或淡黄色透明的黏稠液体。
