代谢控制原理与方法

无活性 repressor A 超过生理需要量
A合成酶系（E1,E2…）
反馈抑制 A
野生型菌株酶合成水平的反馈阻遏
野生型菌株酶活性水平的反馈抑制
效应物位点 过量A
Gene编码酶
酶活中心
过量A作用效应物位点，酶构型变化，影响酶活性中心而失活
反馈阻遏与反馈抑制比较
反馈阻遏 控制对象 酶合成 反馈抑制 酶活性

三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle）
乙醛酸循环(glyoxylate cycle)
丙酮酸羧化支路（CO2固定反应）等
谷氨酸生物合成的理想途径
由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径：A？B？
谷氨酸发酵的代谢途径

生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱 氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰 CoA，另一部分经CO2固定反应生 成草酰乙酸或苹果酸，催化CO2固 定反应的酶有丙酮酸羧化酶、苹果 酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
氨基酸中有8种氨基酸人体本身不能合成，只能从食
物的蛋白质中摄取，称为必需氨基酸，它们是L-赖氨 酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L异亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-蛋氨酸。
还有两种半必需氨基酸，即精氨酸和酪氨酸。
氨基酸的生产方法

抽提法（水解蛋白质） 化学合成法 生物法（包括直接发酵法和酶转化）
氨基酸工业代谢控制发酵
马 挺
课程教学的基本要求

了解氨基酸发酵行业发展现状与中国氨基酸行业存 在问题，氨基酸发酵行业发展方向


掌握谷氨酸的生物合成途径和谷氨酸发酵调节机制， 掌握谷氨酸细胞膜渗透性的控制方法
了解谷氨酸生产菌的主要特征以及谷氨酸生产菌在 发酵过程中的形态变化，掌握谷氨酸发酵的代谢控 制育种策略
3. Lys 代谢控制发酵
菌种的遗传改造 (1)切断支路代谢——Hse营养缺陷型(Hse-)菌株筛选 选育Hse脱氢酶缺失的Hse-菌株，使代谢流向 Lys合成，控制Hse添加量，既满足菌体对Met、 Thr和Ile生长需要又不形Thr和Lys对Asp激酶的 协同反馈抑制，积累Lys (2)用Hse-菌株选育解除Lys反馈抑制突变株

草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成 酶催化作用下，缩合成柠檬酸，进 入三羧酸循环，柠檬酸在顺乌头酸 酶的作用下生成异柠檬酸，异柠檬 酸再在异柠檬酸脱氢酶的作用下生 成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸是谷氨 酸合成的直接前体。 α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下 经还原氨基化反应生成谷氨酸

控制谷氨酸合成的重要措施
α-酮戊二酸脱氢酶的调节
在谷氨酸产生菌中，α-酮戊二酸脱氢酶活性微弱
谷氨酸脱氢酶的调节
谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏 α-酮戊二酸合成后由于α-酮戊二酸脱氢酶活性微弱， 谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸
Glc
CO2 CO2 AC-coA
丙酮酸
羧化酶 草酰乙酸 天门冬氨酸 （Asp）
2、解除分解代谢降解物阻遏的技术与方法

发酵条件控制 加入安慰诱导物：如Lac结构类似物IPTG 抗降解物阻遏突变株的选育 加入高浓度底物筛选仍产生大量目的产物的突变株

反馈调节作用
1、终产物反馈阻遏和反馈抑制 野生型菌株“A”氨基酸合成操纵子模型
AR P RNA聚合酶 O 反馈阻百度文库 A结构基因
活性


生物素控制磷脂的合成
使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限 制发酵培养基中生物素的浓度控制脂肪酸生物合成， 从而控制磷脂的合成 作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初 反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸 的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到 正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏 出，积累于发酵液中


目前绝大多数氨基酸是以发酵法或酶法生产的
谷氨酸发酵的历史




1866年德国化学家里豪森利用硫酸水解小麦面筋，分 离到一种酸性氨基酸，依据原料的取材，将此氨基酸 命名为谷氨酸 1872年赫拉西维茨等用酪蛋白也制取了谷氨酸 1890年沃尔夫利用α-酮戊酸经溴化后合成DL-谷氨酸。 日本池田菊苗教授在探讨海带汁的鲜味时，提取了谷 氨酸，并在1908年开始制造商品味之素 1910年日本味之素公司用水解法生产谷氨酸。1936年 美国从甜菜废液(司蒂芬废液)中提取谷氨酸。
第四节
谷氨酸生物合成的调节机制

优先合成与反馈调节 生物素的调节作用
一、优先合成与反馈调节
优先合成
谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后， 就会抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬 氨酸
柠檬酸合成酶的调节
柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调 节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和顺乌头酸的反馈抑制
控制量 控制水平
控制装置
终产物浓度 转录水平
终产物与阻遏蛋白亲和
终产物浓度 酶构象变化
终产物与控制酶构 象的部位亲和 酶构型变化，活性 中心失活
控制装置的 阻遏蛋白与操纵子基因结合,不 动作 转录mRNA
形成控制
控制反应 细胞经济
开关控制
迟缓，粗控制 超高效益
酶活性大小
迅速，精控制 高效益
2、解除反馈阻遏、反馈抑制突变株的选育
一、代谢控制发酵的定义
代谢控制发酵：微生物正常代谢调节，不过量积累 初级代谢产物；人为解除正常代谢调节，而大量积 累初级代谢产物的发酵方式。
代谢控制发酵方法： 1、发酵条件控制 2、菌种遗传改造
二、分解代谢降解物阻遏
1、分解代谢降解物阻遏
分解代谢降解物阻遏：几种底物同时存在时，易利用对 难利用或利用快对利用慢底物分解的抑制作用。

控制生物素添加量使菌种生产Glu
高浓度bio增强羧化酶活性，促进羧化反应利 于Glu合成。低浓度bio降低裂解酶活性，使菌体 生长后关闭乙醛酸循环，使底物流向Glu合成，低 浓度bio使膜磷脂合成缺陷，增加膜通透性，利于 Glu胞外分泌，解除反馈调节，利于Glu合成并大 量积累。
添加亚适量，5-10μg/L 培养基，生产Glu
第一节 氨基酸工业现状及发展方向
近40多年来，国内外在研究、开发和应用氨基酸方面
均取得重大进展，新发现的氨基酸种类和数量已由20 世纪60年代50种左右，发展到20世纪80年代的400种， 目前已达1000多种。其中用于药物的氨基酸及氨基酸 衍生物的品种达100多种。 酸。
氨基酸分为两大类，即蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基
O-琥珀酰-高丝氨酸
高丝氨酸-P
蛋氨酸 (Met)
苏氨酸 （Thr） Thr脱氢酶
赖氨酸(Lys)
异亮氨酸（Ile）
(1) (2) (3)
(4)
(5)
Asp三分支途径优先合成Met，后合成Thr、 Ile，最后合成Lys Thr和Lys对Asp激酶有协同反馈抑制 Thr对Hse脱氢酶有反馈抑制 Ile对Thr脱氢酶有反馈抑制 Met对O-琥珀酰高丝氨酸合成酶有反馈阻遏
第五节
1.
Lys代谢控制发酵
生产菌种 谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum） 黄色短杆菌(B. flavum) 乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum) 2、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌Lys合成途径及正常 调控机制
Asp 天冬氨酸 Asp 激酶 天冬氨酸-P 天冬氨酸-β –半醛 Hse脱氢酶 DDP合成酶 合成酶 高丝氨酸 二氢吡啶-2,6-二羧酸
氨基酸发酵的现状
自从发酵法生产谷氨酸成功以后，世界各国纷纷 开展氨基酸发酵的研究与生产，产量增长很快。 2000年氨基酸产量达237万吨，销售额接近45亿美 元，占生物技术产品销售额的7％。 目前氨基酸产业发展较快的国家是美国、日本和 中国。

我国氨基酸发酵的发展



我国氨基酸生产最早在1922年用酸法水解面筋生产谷氨酸 钠即味精，在上海开办了天厨味精厂，该味精的制造方法 曾向美、英、法申请专利，并取得了专利权。并先后建立 了沈阳味精厂、青岛味精厂和天津味精厂，规模均很小， 1949年全国味精总产量不到500吨。 1965年发酵法生产味精取得成功，带动了其他氨基酸的研 究开发。 1965年以后，我国味精生产全部采用以淀粉质或糖蜜为原 料的微生物发酵工艺，大大的促进了生产的发展，到1985 年全国味精生产企业达到140家。随着酶制剂的应用和生 产工艺及装备的改进，技术水平不断提高，进一步推动了 味精生产的快速发展。 发酵法L-赖氨酸生产起步于20世纪70年代，当时仅有上海 天厨味精厂少量生产，以实用为主，1981年在广西建成年 产100吨食品级L-赖氨酸试验工厂，于1987年投产。
合成酶 柠檬酸
反 馈 阻 遏
顺乌头酸 异柠檬酸
反 馈 抑 制
α-酮戊二酸
谷氨酸 Glu
脱氢酶 脱氢酶
α-酮戊二酸
二、生物素对代谢的调控作用
Glu产生菌主要生理生化特性
需氧，生物素缺陷型bio-,有乙醛酸循环， 羧化酶活性强（bio作为辅酶） 柠檬酸、异柠檬酸、谷氨酸脱氢酶活性高， Glu合成中存在正常反馈阻遏和反馈抑制。菌体细 胞膜通透性差，不利于Glu胞外分泌。
CO2固定酶 系活力强
Citrate synthase, Aconitase, ICDH, GDH酶活力强 异柠檬酸裂解酶 活力欠缺或微弱
乙醛酸循环弱
α-酮戊二酸氧化 能力缺失或微弱
谷氨酸脱氢酶能 力强
谷氨酸发酵的代谢途径
乙醛酸循环的作用
乙醛酸循环途径 可看作三羧酸循 环的支路和中间 产物的补给途径 在菌体生长期之 后，进入谷氨酸 生成期，为了大 量生成、积累谷 氨酸 ，最好没有 异柠檬酸裂解酶 催化反应，封闭 乙醛酸循环
8hr
Glu非积累型细胞
Glu积累型细胞
培养前期，bio充足，存 在乙醛酸循环，中间物质 和能量充足，长细胞，膜 磷脂合成正常，正常反馈 调节，不积累Glu，细胞 形态正常。
培养中后期，bio浓度渐 低，乙醛酸途径减弱直至 关闭，膜磷脂合成缺陷， 膜透性增强，分泌Glu， 解除反馈调节，大量积累 Glu，细胞形态异常，未 溶解。
生物素对CO2固定反应的影响 生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2固 定反应，据报道，生物素大过量时（100g/L以 上），CO2固定反应可提高30%。
生物素对糖代谢速率的影响 生物素充足条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽 然也有提高，但由于糖降解速率显著提高，打破了 糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡，丙酮酸 趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出 生物素对乙醛酸循环的影响 乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、 琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导。在低浓度生物素条件 下，因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反 馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循 环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸→α-酮戊 二酸→谷氨酸的方向高效率地移动。
Glu发酵常用菌种 谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum) 北京棒杆菌(C.peiking AS.1229) 黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) 乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum)
谷氨酸的生物合成包括

糖酵解作用（glycolysis, EMP途径） 戊糖磷酸途径（pentose phosphate HMP途径） pathway，
氨基酸发酵的发展动向
新技术和工艺的开发应用 1.现代生物技术在氨基酸工业中的应用 2.生物化工技术在氨基酸工业中的应用 新产品的开发、新应用领域的拓展 1.医药中间体 2.肽类 3.多聚氨基酸 4.氨基酸系表面活性剂
第二节

微生物代谢控制发酵
微生物代谢调节
1、时序调节(temporal regulation)
AR-或AO诱变
野生型菌株
解除反馈调节突变株
AR-＋AO-
酶基因突变
解除反馈调节突变株可以大量积累末端产物 筛选方法： 解除Lys反馈调节突变株筛选
野生型菌株
诱变
正常反馈调节型 菌细胞 解除反馈调节突变型
第三节 谷氨酸的生物合成途径

生产谷氨酸的主要菌株


生成谷氨酸的主要酶反应
谷氨酸生物合成的理想途径 谷氨酸发酵的代谢途径
微生物对生长、发育、分化不同生理时期的代谢调节 2、适应调节
微生物对细胞内外环境的变化作出应答性调节

微生物的经济化学与合目的性 Economic Biochemistry（经济化学）：微生物利于生 存发生的所有生化反应皆有精确计算，有很高经济效益 Telenomic （合目的性）：微生物按需要有目的进行 物质合成的能力