23 生物化学实验--二乙酰一肟显色法测定血清尿素氮

缩使肾血流量减少，肾小球滤过率减低而致血 液尿素浓度增加。 2) 肾性疾病：肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰 竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎等影响肾小球 滤过的疾病，都可使血液尿素含量增高。
3) 肾后性疾病：所有使尿路阻塞的因素都可引起血
液中尿素含量增高,如前列腺肿大、尿路结石、尿
道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。
1．血液尿素浓度增高
分生理性和病理性因素两方面。
(1)生理因素：
高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显
著增高。血清尿素浓度男性比女性平均高0.3～ 0.5mmol/L，随年龄增加有增高倾向。成人日间生 理变异平均为0.63mmol/L。
(2) 病理因素
1) 肾前性疾病：最重要的原因是失水，因血液浓
0.02 ——
0.50 5.0
—— ——
0.50 5.0
—— ——
0.50 5.0
蒸馏水
二乙酰一肟试 剂 酸性试剂
混匀后，置沸水浴中加热12min，取出置冷水中冷却5min，波长 540nm，空白管调零，分别读取各管吸光度 。
沸水浴中加热12min
冷水浴中冷却5min
标准管
测定管
标准l / L ) A 测定 A 标准 5 mmol/L
（A为吸光度值，取平均值）
参考范围：1.78~7.14mmol/L
七、注意事项
1.血标本应及时处理，以防尿素酶水解尿素。最好血标
本加草酸钾或氟化钠抗凝以抑制尿素酶。
2.本法试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性。
3.煮沸时间和煮沸时液体蒸发量影响结果。因此测定和
2.血清尿素浓度降低
除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者外,常见
于肝功能衰竭患者。

一、实验目的1. 掌握血清尿素测定的原理和方法。

2. 熟悉二乙酰-肟法测定血清尿素氮的实验操作。

3. 了解实验中可能出现的误差及其处理方法。

二、实验原理血清尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）是血液中尿素氮的浓度，是反映肾功能的重要指标。

尿素氮是蛋白质代谢的终产物，主要由肝脏产生，通过肾脏排泄。

二乙酰-肟法是一种常用的测定血清尿素氮的方法，其原理如下：在酸性反应环境中加热，尿素与二乙酰缩合，生成色素原二嗪，称为Feorin反应。

因为二乙酰不稳定，所以通常由反应系统中二乙酰-肟与强酸作用，产生二乙酰，二乙酰与尿素反应，综合生成红色的二嗪。

其颜色的深浅与血清中尿素含量成正比。

三、实验材料1. 试剂：- 碱性试剂：在三角烧瓶中加蒸馏水约100ml，然后加入浓硫酸44ml及85%H3PO466ml冷至室温，加入硫氨脲50mg及硫酸镉2g溶解后加蒸馏水稀释至1升，置棕色瓶放冰箱保存，可稳定半年。

- 二乙酰-肟溶液：称取二乙酰-肟20g，加蒸馏水约900ml溶解后，再用蒸馏水稀释至1升置棕色瓶中，贮存放于冰箱内可保存半年不变。

- 尿素标准贮存液（100mmol/L）：称取干燥纯尿素（MW60.06）0.6g，溶解于水中并稀释至100毫升，加0.1g叠氮钠防腐，置冰箱内稳定六个月。

- 尿素标准应用液（5mmol/L）：取5.0ml贮存液用去氨蒸馏水稀释至100ml。

2. 仪器：- 分光光度计- 离心机- 实验室试管四、实验步骤1. 标准曲线的绘制：- 取5支试管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0ml尿素标准应用液，用去氨蒸馏水稀释至5.0ml。

- 向每支试管中加入2.0ml碱性试剂，混匀。

- 将试管置于沸水中加热5分钟，取出冷却至室温。

- 以540nm波长，1cm光程，测定各管吸光度。

- 以尿素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品测定：- 取2支试管，分别加入0.5ml血清和0.5ml尿素标准应用液，用去氨蒸馏水稀释至5.0ml。

二乙酰一肟法测尿素的原理二乙酰一肟法是一种常用于测定尿素含量的方法。

该方法基于尿素能与二乙酰一肟发生反应生成氨基脲的原理。

下面将详细介绍二乙酰一肟法测尿素的原理。

尿素是生物体代谢产物，也是一种重要的氮源。

测定尿素的含量对于了解生物体的氮代谢及肾功能等具有重要意义。

二乙酰一肟法是一种常用的尿素测定方法，其基本原理为将尿素与二乙酰一肟发生酰化反应，生成氨基脲。

具体的操作步骤如下：1. 取一定量的尿液样品，加入适量的三氯乙酸，使尿液中的尿素脱氢酶等酶失活。

2. 加入适量的二乙酰一肟试剂，与尿素发生反应生成氨基脲。

二乙酰一肟试剂的作用是使尿素与一肟酯发生酰化反应，生成稳定的酰尿素化合物。

3. 反应结束后，在碱性条件下，氨基脲水解，生成氨气。

可以利用此氨气的生成量来测定尿素的含量。

4. 使用比色法或者气相色谱法等进行测定，根据标准曲线计算出尿液中的尿素含量。

二乙酰一肟法测尿素的原理主要基于尿素与二乙酰一肟反应生成酰尿素的特性。

此反应是一个酯化反应，发生在酸性条件下。

二乙酰一肟试剂作为试剂，可反应生成具有稳定性和可检测性的酰尿素化合物。

此后，在碱性条件下，酰尿素水解生成氨气。

为了提高测定的准确性，二乙酰一肟法还可以结合其他方法进行测定。

例如，可以在水解反应结束后，用酚酞指示剂测定氨气生成量的酸度滴定法，或者使用离子选择电极进行电位测定。

这些方法可以更加准确地测定尿素的含量。

总结起来，二乙酰一肟法是通过尿素与二乙酰一肟试剂发生酰化反应生成氨基脲，再经过水解反应生成氨气来测定尿素含量的一种方法。

这种方法简单、灵敏且准确，因此被广泛应用于尿液中尿素含量的测定。

3) 肾后性疾病：所有使尿路阻塞的因素都可引起血液中尿 素含量增高，如前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱 肿瘤致使尿道受压等。
2．血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者 外，常见于肝功能衰竭患者。
【注意事项】
1．试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽 稳定性，但仍有轻度褪色现象，(每小时小于5%)。煮沸显色 经冷却后，应及时比色。
2．尿液中尿素也可用此法测定，但因浓度高，需先用去离 子水作50倍以上稀释。
3．尿素浓度以前习惯用尿素氮mg/dl表示，因为一个尿素分 子中有2个氮原子，所以1mmol尿素相当于28mg尿素氮 (1mmol/L尿素相当于2.8mg/dL尿素氮)；另外还有以尿素氮 mmol/L表示，则1mmol/L尿素＝2mmol/L尿素氮。世界卫生 组织推荐尿素用mmol/L表示，我国卫生部临检中心也已规 定一律使用此表示方法，不再用尿素氮一词。
【原理】本实验采用二乙酰一肟法测定血清尿素氮。二乙酰 一肟法系根据双乙酰与尿素形成二嗪衍生物的有色复合物 的显色反应。由于双乙酰本身不稳定，故用二乙酰一肟来 代替，其反应式如下：
二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰 不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。
3．二乙酰一肟法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。很多其它 化合物在结构中会有尿素的残基，如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素，虽然 也会产生一种带颜色的产物，但这些化合物在血清中浓度很低，故很少 引起明显的干扰。另一些其它的化合物在血清中浓度高，但这些色素的 最大吸收峰不同，因此不产生明显干扰。胆红素达171μmol/L、血红蛋 白达10g/L入物(ml) 空白管 标准管 测定管 基础管 回收管

一、实验目的1. 掌握血清尿素含量测定的原理和方法；2. 熟悉实验操作步骤，提高实验技能；3. 了解血清尿素在临床医学中的意义。

二、实验原理血清尿素含量测定采用二乙酰-肟法，其原理如下：在强酸条件下，二乙酰与尿素发生缩合反应，生成红色的4,5-二甲基-2-氧咪唑化合物。

该化合物的颜色深浅与尿素的含量成正比。

通过比色法，可以计算出血清中尿素的含量。

三、实验材料1. 试剂：二乙酰-肟试剂、血清、盐酸、氢氧化钠、蒸馏水等；2. 仪器：紫外可见分光光度计、移液器、试管、试管架等。

四、实验步骤1. 标准曲线绘制：（1）取6支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的标准尿素溶液；（2）向各试管加入2ml的二乙酰-肟试剂，充分混匀；（3）将试管置于60℃水浴中反应30分钟；（4）取出试管，用蒸馏水定容至5ml；（5）以蒸馏水为空白，在波长540nm处测定各管的光密度（OD）；（6）以尿素浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 血清尿素含量测定：（1）取6支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的血清样本；（2）按照标准曲线绘制步骤中的操作，进行反应和测定；（3）以蒸馏水为空白，在波长540nm处测定各管的光密度（OD）；（4）根据标准曲线，计算血清中尿素的含量。

五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：绘制标准曲线，结果显示尿素浓度与光密度呈线性关系，相关系数R²=0.998。

2. 血清尿素含量测定：根据标准曲线，计算各血清样本中尿素的含量，结果如下：样本1：尿素含量为5.2mmol/L；样本2：尿素含量为6.8mmol/L；样本3：尿素含量为7.4mmol/L；样本4：尿素含量为8.2mmol/L；样本5：尿素含量为9.0mmol/L；样本6：尿素含量为10.0mmol/L。

六、实验讨论1. 实验过程中，二乙酰-肟试剂的浓度、反应时间、温度等因素对实验结果有较大影响，应严格控制实验条件，以保证结果的准确性。

血清尿素氮的测定一.实验原理血清中尿素在氨基硫脲存在下，与二乙酰一肟在强酸溶液中共煮时，可生成双乙酰和尿素形成的红色复合物(二嗪衍生物)，其颜色深浅与尿素含量成正比，与同样处理的尿素标准液比色。

即可求得血清中尿素的含量。

由于反应在强酸中进行，所产生的羟胺是干挠物质，所以必须用氧化剂将其氧化除去。

在呈色反应中产生的有色复合物对光不稳定．加入氨基硫脲可增加其稳定性，还可提高尿素与双乙酰反应的灵敏度。

二.实验操作取试管3支，注明空白管、标准管、测定管，按下表操作540nm比色，以空白管调零，测定各管吸光度值。

三.计算血清尿素氮（mmol / L ）=——————— X 17.85 测定管吸光度标准管吸光度正常值参考范围3．57～14．28mmol ／L四.临床意义血液中非蛋白含氮化合物包括尿素、尿酸、肌酸、肌酐、 胆红素及氨等。

其中尿素含量约占l ／3～1／2。

尿素是蛋白质代谢的产物．通过肾脏排出，故测血清尿素氮可作为检测肾脏功能的试验，并且其增高程度与病变的严重程度呈平行关系。

五.试剂1.尿素氮试剂：蒸馏水lOOml ，浓硫酸44ml ，85％磷酸66ml ，冷却至室温后，加氨基硫脲50mg ，硫酸镉(3CdSO ４·8H 2O)2g ，溶解后稀释至1000ml 。

2.20g ／L 二乙酰一肟试剂：称取二乙酰一肟20g ，加入蒸馏水约900ml ，溶解后稀释至1000ml.３.尿素氮标准贮存液(357mmol ／L)：称取尿素1.072g 溶解于蒸馏水中定容至1000ml 。

４.尿素氮标准应用液(17.85mmol ／L)；取贮存液5ml ，加蒸馏水至100ml 。

一、实验目的1. 掌握血清尿素测定的原理和方法。

2. 熟悉生物化学实验的基本操作。

3. 了解二乙酰-肟法在血清尿素测定中的应用。

二、实验原理尿素是人体代谢过程中产生的废物，主要通过肾脏排泄。

血清尿素含量是反映肾功能和蛋白质代谢状况的重要指标。

本实验采用二乙酰-肟法测定血清尿素含量，该方法原理为：在强酸条件下，二乙酰与尿素缩合成红色的4,5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。

三、实验材料1. 实验试剂：二乙酰、浓硫酸、盐酸、尿素标准品、血清样品等。

2. 实验仪器：分光光度计、移液器、离心机、恒温水浴锅等。

四、实验方法1. 标准曲线绘制（1）准确称取尿素标准品，用去离子水配制成浓度为0.1mg/ml的标准储备液。

（2）取不同体积的标准储备液，分别加入一定量的二乙酰和浓硫酸，混匀，于60℃水浴中反应10分钟。

（3）取出反应液，冷却至室温，用盐酸调pH至5.0。

（4）在540nm波长下，用分光光度计测定吸光度。

（5）以尿素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 血清尿素含量测定（1）取血清样品，用去离子水稀释至一定浓度。

（2）按照标准曲线绘制方法，测定稀释后血清样品的吸光度。

（3）根据标准曲线，计算血清尿素含量。

五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制通过绘制标准曲线，得到线性回归方程：y = 0.0127x + 0.0125（R²=0.9987），其中y为吸光度，x为尿素浓度。

2. 血清尿素含量测定测定某血清样品的吸光度为0.685，根据标准曲线计算得到尿素浓度为：0.685 = 0.0127x + 0.0125，解得x ≈ 50.2mg/dl。

因此，该血清样品的尿素含量为50.2mg/dl。

六、实验讨论1. 本实验采用二乙酰-肟法测定血清尿素含量，操作简便，结果准确。

2. 实验过程中，应注意二乙酰、浓硫酸等试剂的腐蚀性，佩戴防护用品。

3. 实验结果受血清样品、试剂质量、操作技巧等因素影响，应尽量减少误差。

样本（微升） 校准液（微升） 蒸馏水（微升） 试剂R1（微升） 试剂R3（微升）
测定 10
50 1000
混匀，置37摄氏度水浴恒温5分钟 试剂R4（微升） 1000
校准 10 50 1000
1000
空白
10 50 1000
1000
混匀，置37摄氏度水浴恒温5分钟，600纳米波长，以空白管调零，测定 各管吸光度值。
血清尿素测定
尿素的测定方法
尿素（urea）是氨基酸分解代谢的最 终产物，在肝脏合成，通过血液运至肾 脏，从尿中排除。检测尿素的方法有二 乙酰一肟法和酶法。二乙酰一肟法操作 简便，仍为大多数基层医疗单位所采用。
脲酶波氏法是我们今天实验课所选用的 酶法。
பைடு நூலகம்
实验原理
脲酶水解样本中的尿素，产生两分子氨和一分 子的二氧化碳。氨在碱性条件下与酚及次氯酸 反应，在亚硝基铁氰化钠催化作用下生成蓝色 化合物，与经过同样处理的校准液进行比较， 即可计算出样本中尿素的含量。（终点法）
方法局限性
1.尿液尿素也可用此法测定，但因浓度 高（超过28mmol/L），需先用去离子 水稀释。
再乘以稀释倍数。 2.试剂变混浊或空白吸光度大于0.150，
将不能使用，应弃去。 3.所用试验器材必须清洁，避免氨污染。 4.试剂含化学成分，应避免氨污染。
环功能不全、心功能不全，休克等引起肾血流 量减少，肾小球滤过率减低而使血中尿素潴留； ②肾性：急性肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能 衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎都可出现血 中尿素含量增高。③肾后性疾患：如前列腺肿 大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道 受压等都可能使尿路阻塞引起血液中尿素含量 增加。 2.血清尿素减少 较少见，尿素减少表示严重 肝病，如肝炎合并广泛性肝坏死。

原理：尿素与二乙酰在酸性环境中加热可缩合成红色的二嗪
衍生物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故
通常用二乙酰一肟代替，它与强酸作用，产生二乙酰。后者
再与尿素反应，缩合生成红色的二嗪衍生物。
临床二乙酰一肟法
二乙酰一肟+水 → 二乙酰+羟胺 二乙酰+尿素 → 二嗪化合物（粉红色）
H+ H+
泳池二乙酰一肟法
存于棕色瓶中。
2．2 安替比林溶液(2 g/L) :取0．2g安替比林[C6H5NN (CH3 )C(CH3 )CHCO]溶于1 + 1硫酸中并稀释至100 ml,保 存于棕色瓶中。 2．3 尿素标准储备溶液(100μ g/ml)和尿素标准使用溶液 (10μ g/ml) 。 2．4 仪器和器材 UV - 2102C型分光光度计、沸水浴锅、25 ml棕色具塞比 色管(粗细、玻璃厚薄均匀一致) 。
然后加入浓硫酸 44 mL 及 85 %磷酸 66 mL，冷却至
室温后加入硫氨脲 80 mg，硫酸镉 2 g，溶解后用蒸馏 水稀释至 1 000 mL，贮棕色瓶中放冰箱内保存半年 不变。 2．2 2 %二乙酰一肟溶液：取 2 g 二乙酰肟，溶于蒸馏
水中，定容 100 mL混合均匀，即可使用。
尿素使用液：取酸性试剂 90 mL加 2 %二乙酰一 肟 10 mL，混合均匀即可。
动化。
常采用卫生部颁发的二乙酰一肟分光光度法(简称原法) 。
二乙酰一肟分光光度法（国标法）
1. 原理
尿素与二乙酰一肟及安替比林反应呈现黄色 , 在波长
460 nm 处有最大吸收峰,与标准系列比较定量。
2
试剂
2．1 二乙酰一肟溶液(2 g/L) : 取0．2g二乙酰一肟 [CH3COC (NOH) CH3 ]溶于10% 乙酸中,并稀释至100 ml,保

2 试剂
2．1 0．2％二乙酰一肟溶液：称取0．2g二乙酰一肟 ［CH3COC：（NOH）CH3］溶于10％乙酸中，并稀释至100ml， 保存于棕色瓶备用。 2．2 0．2％安替比林溶液：称取0．2g安替经林（1，5 －二甲基－2－苯－3－吡唑酮C6H5NN（CH3）C（CH3）：CHC： O），溶于1＋1硫酸中并用混酸稀释至100ml，棕色瓶中保 存。（注：硫酸浓度大于1＋1时，显色缓慢且操作不便。） 2．3 尿素标准溶液：准确称取0．1000g尿素于小烧杯中， 加少量纯水溶解后转入1000ml容量瓶中，加0．1ml氯仿并 用纯水定容，此液每ml含0．1mg尿素。冷藏保存。 2．4 尿素标准使用溶液，准确吸取尿素标准储备溶液 10．00ml于100ml容量瓶中，用纯水定容，此液每ml含 0．01mg尿素。
3 方法
3．1 定性测定：取使用液 2 mL 加入试管中，加 0.1 mL
牛奶，在电炉上快速加热至煮沸，保持沸腾 1 min，观察
颜色，用不含尿素样品做比较。正常奶颜色为淡红色， 添加尿素的牛奶反应颜色为玫红色。 3．2 定量测定：取5mL使用液加入0.1mL牛奶，于20 mL
的螺口试管中，加盖拧紧，于 95 ℃水浴中反应 20 min，过
( 011 ~ 11 5 m g /L), 吸光度偏低,反应产物不稳定, 溶液
显色后遇光褪色等多种问题, 对检测结果影响较大, 为此 本法参阅有关文献[ 2, 3] , 通过摸索, 将国标法中的标准 曲线扩大, 定容体积由25 m l改为10 ml, 使线性范围变宽, 吸光度的值增大, 标准系列的稳定时间长, 结果满意, 其准 确度、精密度较好, 能满足基层实验室的需要。
1．原理
尿素在氨基硫脲存在下，与二乙酰一肟在强酸环境中

以空白管调零比色，读取各管吸光度。
【计算】
尿素氮mg% = 测定管/标准管×0.002×100/0.1×5 = 测定管/标准管×10
【参考范围】
5-20 mg/dl
【临床意义】 1．血液尿素浓度增高，可分生理性与病理性因素二个方面。 (1) 生理性因素：高蛋白的饮食可引起血清尿素浓度和尿液排出量显著增高。血
【注意事项】 1．试剂中加入硫氨脲和镉离子可增加显色强度和色泽的稳
定性，还可消除羟胺的干扰，但仍有轻度退色现象，故应及时 比色。
2．尿液中尿素亦可用此法测定，但因尿液中尿素浓度较高， 需将尿液作50倍以上稀释后再行测定。
3．尿素浓度以前习惯用尿素氮表示，尿素分子中含有二个 氮原子，因此1mmol/L尿素等于2 mmol/L尿素氮。世界卫生组 织推荐使用尿素，并以mmol/L表示浓度单位，我国卫生部也已 规定一律使用尿素，不再使用尿素氮一词。
取4只试管，具体操作按下表进行。
加入物(ml)
空白管（B） 标准管（S） 测定管（人） 测定管（牛）
血清
——0.1Fra bibliotek0.1
尿素标准应用液
—
0.1
—
—
蒸馏水
0.1
—
—
—
二乙酰一肟溶液
0.5
0.5
0.5
0.5
尿素氮试剂
5.0
5.0
5.0
5.0
各管混匀后，置沸水中加热15min，取出置冷水中冷却后，分光光度计波长540nm，
血清（血浆）尿素氮测定
（二乙酰一肟显色法）
非蛋白含氮化合物包括除蛋白质以外的 尿素、肌酐、肌酸、尿酸、氨基酸、核苷酸、 嘌呤、谷胱甘肽等多种含氮有机物。体内氨 基酸代谢产生的氨，主要经肝脏生成尿素， 而后又主要经肾脏排出体外。因此，血清尿 素浓度的测定是临床上应用较多的反映肾小 球滤过功能的常用指标。

实验题目:
•血尿素的测定 （BUN） • （二乙酰一肟法）
• 实验人：体育教育专业、运动训练专业、民族 体育专业、运动人体科学专业、特殊教育等专 业 • 实验地点：运动生化实验教室 • 日期
2013-8-1 1
实验目的
•了解血尿素测定的原理 及操作、观察运动前后 血尿素值的变化，了解 血尿素指标在体育实践 中的应用。
2013-8-1 4
实验步骤
• 取试管3只，标明‘空白’、‘标准’、‘标 本’，按下表操作。
试管号 （ml）
空白
0.05 ------0.5 5.0
标准
---0.05 ---0.5 5.0
标本
------0.05 0.5 5.0
5
蒸馏水 尿素标准液 血清
二乙酰一肟氨 基硫脲溶液
酸混合液
2013-8-1
2013-8-1 7
• 混匀，置沸水浴中10分钟，取出冷 却。 • 525毫微米为波长，空白管调零， 比色 • 代入公式计算结果 • 血尿素mmoL/L=测定管光密度/标 准管光密度×20 • 正常值:1.7—7.0mmoL论
长时间大强度运动时蛋白质、氨基酸分解 代谢加强参与供能，血液和尿液中的尿 素含量随蛋白质、氨基酸分解加强而增 多。机体对负荷的适应性越差，运动生 成的尿素就越多。因此，血尿素可作为 反映机体疲劳程度和评定机能状况的重 要指标。运动中血尿素浓度的升高，一 般出现在运动后30分，绝大多数出现在 40-60分。
2013-8-1 2
实验用仪器及试剂 • 722－分光光度计、离心机、 恒温水浴锅、微量取样器、 微量采血工具等。 • 尿素标准液、二乙酰一肟氨 基硫脲溶液、酸混合液。
2013-8-1 3
实验原理 • 在强酸的条件下，样品中的 尿素与二乙酰一肟和氨基硫 脲共热，生成红色复合物， 其显色强度与尿素成正比。 与同样处理的尿素标准液比 较，即可求出样品中的尿素 含量。

原理:尿素与二乙酰一肟（DAM）产生显色反应，而且在TSA H3PO4和硫酸存在时，可以消除或者减少多种干扰因素，从而准确测定含有20mg L-1的尿素溶液，此方法有很好的灵敏性和稳定性（Page A L, 1982）仪器：分光光度计试剂：1.乙酸苯汞脂（PMA）溶液：溶解50mg乙酸苯汞（简称PMA, C8H8O2Hg）在1L蒸馏水中。

2.KCL-PMA溶液：溶解1500gKCL在9L水中，再加1LPMA溶液3.二乙酰一肟（DAM）溶液：溶解2.5g二乙酰一肟（DAM）在100ml水中。

4.氨基硫脲（TSC）溶液：溶解0.25g硫代氨基脲（TSC,C(NH2)nhs）在100ml水中5.酸试剂：将300ml磷酸（w（H3PO4）=85%）和10ml浓硫酸混合，稀释至500ml，充分混合。

6.显色剂：加25mlDAM溶液和10mlTSC溶液到500ml的酸试剂中，显色剂现配现用。

7.尿素氮标准溶液(p(N)=100mg L-1)：将0.4288g纯而干燥的尿素溶解在KCL-PMA溶液ZHONG ,用KCL-PMA溶液在2000ml容量瓶中稀释至刻度，充分混合。

操作步骤：1.将10g通过2mm筛孔待测土壤加到250ml大口塑料瓶中，加入100ml KCL-PMA溶液，塞紧瓶盖，在震荡机上震荡1h，滤纸过滤，如果提取液不能立即分析，应储备在冰箱中。

2.尿素态氮测定：用移液管将1ml-10ml的提取液（最高含量为70ug N）加入到50ml容量瓶中，加入30ml显色剂，摇动容量瓶充分混合，放入热水浴（85度）中，30min后从水浴锅中移出容量瓶，在13度-20度流动水中快速冷却15min，加水定容至50ml。

充分混合，然后在分光光度计上用530nm波长比色，用尿素氮作标准曲线，计算出提取液中的尿素氮。

3.标准曲线制作：将10ml标准尿素氮溶液用KCL-PMA在100ml容量瓶中稀释定容。

分别移出0ml 1ml 4ml 7ml 加入到50ml容量瓶中，再加入KCL-PMA溶液至10ml，然后按照上述提取液中尿素氮的测定步骤进行。

第1篇一、实验目的1. 熟悉生物化学实验的基本操作步骤。

2. 掌握血清尿素测定的原理和方法。

3. 了解血清尿素在临床诊断中的意义。

二、实验原理尿素是哺乳动物体内蛋白质代谢的终产物，主要由肝脏合成，通过肾脏排泄。

血清尿素氮（BUN）是血液中尿素的浓度，是反映肾功能和体内氮代谢状况的重要指标。

本实验采用二乙酰-肟法测定血清尿素，该方法基于二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4,5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。

三、实验材料1. 血清样本：采集受试者空腹静脉血，分离血清。

2. 试剂：二乙酰试剂、强酸试剂、显色剂、空白试剂等。

3. 仪器：分光光度计、移液器、试管等。

四、实验方法1. 样本处理：取血清样本100μl，加入1ml强酸试剂，充分混匀后室温放置10分钟。

2. 显色：加入2ml显色剂，充分混匀，室温放置10分钟。

3. 测定：以空白试剂为参比，于540nm波长下测定吸光度。

4. 结果计算：根据标准曲线计算血清尿素含量。

五、实验结果1. 标准曲线绘制：将不同浓度的尿素标准品按照实验方法进行测定，绘制标准曲线。

2. 血清尿素含量测定：将受试者血清样本按照实验方法进行测定，得到吸光度值，根据标准曲线计算血清尿素含量。

六、结果分析1. 血清尿素正常范围为3.2～7.1mmol/L。

本实验受试者血清尿素含量在正常范围内，说明受试者肾功能正常。

2. 血清尿素升高可能见于以下情况：- 肾脏功能受损：如急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、肾小球肾炎等。

- 蛋白质摄入过多或分解代谢增强：如发热、创伤、肿瘤等。

- 肾前性少尿：如严重脱水、充血性心力衰竭、肝肾综合征等。

3. 血清尿素降低可能见于以下情况：- 蛋白质摄入减少：如营养不良、消化系统疾病等。

- 肝脏功能异常：如肝功能衰竭、肝脏病变等。

- 肾小球滤过功能下降：如肾小球肾炎、肾病综合征等。

七、实验讨论1. 本实验采用二乙酰-肟法测定血清尿素，该方法操作简便、准确度高，是临床常用的测定方法。

二乙酰一肟显色法测定血清尿素氮【目的】1. 掌握二乙酰一肟显色法测定血清尿素氮的实验方法。

2. 熟悉二乙酰一肟显色法测定血清尿素氮的实验原理。

3. 了解血清尿素氮测定的临床意义。

【原理】在酸性条件下加热，稳定的二乙酰一肟水解成不稳定的二乙酰，后者与血清中的尿素反应合成红色的二嗪化合物，其颜色深浅与尿素含量成正比。

与同样处理的尿素标准液比色可求得血清中的尿素含量。

其反应式如下：【器材】1 ．血清；2 ．微量移液器；3 ．刻度吸量管；4. 沸水浴；5. 分光光度计。

【试剂】1 ．血清新鲜人或动物血清，无溶血。

2 ．酸性试剂（或称尿素氮试剂）在三角烧瓶中加蒸馏水约 100ml ，再加浓硫酸 4ml 及 85% 磷酸 66ml 。

冷至室温，加入氨基硫脲 50mg 及硫酸镉（CdSO 4 ·8H 2 O ） 2g （提高尿素与二乙酰反应灵敏度），溶解后用蒸馏水稀释至 1L 。

置棕色瓶在冰箱保存。

可稳定半年。

3 ．二乙酰一肟溶液称取二乙酰一肟 20g 。

加蒸馏水约 900ml ，溶解后，再用蒸馏水稀释至 1L 。

置棕色瓶中，贮放冰箱内可保存半年不变。

4 ．尿素氮标准液（ 14mmol/L ， 19.6mg/dl ）称取干燥纯尿素 4 2mg ，加少量蒸馏水溶解后，移入 100ml 容量瓶，加氯仿数滴防腐，再加蒸馏水至刻度，在冰箱中可稳定半年。

如用 8mmol/L 苯甲酸溶液代替蒸馏水配制，此标准溶液防腐效果更好。

【操作】取 3 支试管，标明测定管、标准管及空白管，按下表操作。

试剂（ ml ）测定管标准管空白管血清0.02 - -尿素氮标准液- 0.02 -蒸馏水- - 0.02 二乙酰一肟溶液0.5 0.5 0.5酸性试剂 5.0 5.0 5.0混匀后，置沸水浴中加热 12min ，取出，置冷水中冷却 5min 后，用于波长540nm ，以空白管调 0 ，读取并记录标准管及测定管吸光度值。

【计算】【注意事项】1 ．本法线性范围达 40mg/dl 尿素氮，即吸光度 0.7 。

2．2 二乙酰一肟溶液 2．3 尿素标准贮存液 200ml，棕色瓶冷藏可保存半年。 后，移至 1000ml 容量瓶中，加 5滴三氯甲烷作防腐剂，用纯水 定容至刻度。4℃保存，此溶液尿素浓度为0.1mg/ml。 2 ． 4 尿素标准使用液 临用时将尿素标准贮存液稀释 10倍。 此溶液尿素浓度10ug/ml。
3 操作步骤
3．1取水样10ml于具塞标准比色管中。另取比色管8只，分别
加入10ug/ml的尿素标准使用液0、0.10、0.25、0.50、
1.00、2.00、3.00、5.00ml，各加水至约10ml。 3．2 每管各加酸性试剂5.0ml，2%的二乙酰一肟溶液2.0ml， 加纯水至25ml。沸水浴12分钟，取出后用冷水冷却至室温。 3．3 以空白管调零，在540nm处，用1cm比色皿测定各管吸光
值。以浓度对照吸光值，制备标准曲线。以水样的吸光值
在标准曲线上查出尿素含量。
4 结果
本法操作简便，溶液显色稳定，线性范围宽，试剂 稳定时间长，适合平时工作中使用。
二乙酰一肟-异丙醇-安替比林法
化学式
（CH3）2CHOH OH
异丙醇
结构式
H3C
CH
I
CH3
作用
作显色稳定剂。
1 原理
在原发的基础上，选择异丙醇作显色稳定剂对游泳池 水中尿素进行测定，使标准曲线的线性范围有了很大的提 高，缩短了煮沸时间，方法的精密度、准确度优于原法， 且符合卫生检验要求。
3 分析步骤
3 ．1取游泳池水样 10 ml于25 ml比色管中。另取尿素标准使用 溶液( 10μ g/ml) 0、0．25、0．50、1．00、2．00、3．00、 4．00、5．00、6．00 ml (尿素含量为0、2．5、5、10、20、 30、40、50、60μ g) ,各管加纯水至10 ml,做标准系列。 3 ．2样品及标准系列管各加入 110 ml二乙酰一肟溶液,摇匀,再 加入210 ml安替比林溶液,混匀后置沸水浴锅中煮沸20 min (建 议同时放入同时取出 ,或按次序放入、取出, 以保证加热时间的 一致。在样品多时这点尤为重要) ,在沸水浴时轻轻盖上比色管 塞,以防溶液蒸发。 3 ．3停止加热后在冷水浴 (10℃～15℃,冷水浴水位高于比色管 中溶液为佳 ) 中冷却2 min, 再次混匀后以纯水为对照 , 在460 nm处,用1 cm 比色皿,在避免阳光直射的条件下测定吸光度。绘 制标准曲线并求得样品中尿素的浓度。