体外诊断试剂研制常用技术指标之分析性能评估

1 定量标记免疫分析方法分析性能评估的主要指标
1.1 灵敏度 1.1.1 分析灵敏度：试剂盒的灵敏度即最低检出量是
作者单位：南方医科大学生物技术学院，广东，广州 510515
指在统计学意义上能与零剂量区别的量。一般用 95％可信限计算：重复测定零剂量点（n≥10），计算反 应量的均值（_x）和标准差（SD），以_x+2SD（夹心法试剂 盒）或均值_x-2SD（竞争抑制法试剂盒）的反应量计算 出相应的浓度，即为该试剂盒的分析灵敏度，这是我 们注册资料所需提供的内容。 1.1.2 功能灵敏度：将低值样本倍比稀释后重复测 定 （n≥10），计算反应量的变异系数 （CV%），CV% 大于 20％时所对应的剂量点，即为该试剂盒的功能 灵敏度。 1.2 特异性
应注意： ①配制国际或国家标准品的稀释液应与试剂盒
校准物质稀释液相同，以保证两条剂量－反应曲线在 相同反应体系下反应；
②配制国际或国家标准品的浓度范围应与试剂 盒校准物质实际浓度范围相当，以保证反应能在试剂 盒工作范围内进行。 1.5.2 回收率实验 1.5.2.1 添加回收率：选择经纯化、分析过的，性能稳 定的已知高浓度的抗原定量加入低浓度被测样本中， 并进行分析测定，测定结果与已知理论浓度相比较， 应在 90.0%～110.0%范围内。 1.5.2.2 稀释回收率：同样选择经纯化、分析过的，性 能稳定的已知高浓度的抗原，按照一定比例稀释成系 列溶液，并与试剂盒剂量－反应曲线同时测定，高浓 度抗原系列与剂量－反应曲线相比较，应不显著偏离 平行（t 测验），效价比应在 0.900～1.100 之间。
分子诊断与治疗杂志 2010 年 3 月第 2 卷第 2 期 J Mol Diagn Ther, March 2010, Vol. 2 No. 2
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5 pmol/L/ 1 000 pmol/L * 100%=0.5%。 1.2.2 实际测量值：对于不能用物质的量表示的被测 物，如糖蛋白激素 FSH、LH、TSH 和 HCG，这 4 种激素 具有相同的α亚单位，仅仅是α亚单位上部分氨基酸不 同，实际操作中很容易产生交叉反应，而这 4 种激素又 分别有各自的同形异构物，其量的表达方法还不能用 物质的量（mol/L，ng/mL）表示，而只能借助于生物测 定的活性单位（IU/L，mIU/L）表示，而每一种激素的活 性单位（IU）又有完全不同的生物学意义，相互之间没 有任何关联，即并且每一种激素定义的单位意义完全 不同，不同来源相同质量的某一种激素的活性单位也 不同，它们之间的交叉反应绝对不能用交叉反应率表 示，因此往往选择实测值表示。 1.2.3 选择交叉反应对照物：当交叉反应的测量结果 高于我们期待的结果时，可以从两个方面分析：首先， 该试剂盒抗体确实与这一交叉反应因子存在交叉反 应，如 FSH 在结构上与另外 3 种激素仅仅是α亚单位 上个别氨基酸的不同，其特征抗体与其它位点有一定 程度的结合的可能性是存在的，这种非特异结合被限 制在一定范围内是可以接受的。在另一方面，如果选 择的交叉反应对照物中含有少量的被测物，如：欲考 察 FSH 试剂盒对 LH 的交叉反应，选择的 LH 抗原中含 有少量的 FSH，高浓度的这种抗原在 FSH 试剂盒中的 测量结果很可能高于所期待的结果，应充分认识到这 种结果并不是由于 FSH 抗体的交叉反应引起的。因 此，当交叉反应的测量结果高于我们期待的结果时， 可以选择另一来源的交叉反应对照物重新测试，以排 除由于抗原不纯而引起的对该试剂盒抗体交叉反应 的误解。 1.2.4 交叉反应物对测定结果的影响：多大的交叉反 应是可能接受的，主要取决于被测物和交叉反应物在 人体内的相对含量。如 3，5，3’ -三碘甲腺原氨酸 (Triindonhyroxine，T3)和甲状腺素 (Thyroxine，T4)，因 为血清中 T4 的含量是 T3 的近千倍，所以对于测量 T4 的试剂盒而言，与 T3 存在 10%以下的交叉反应率都 不会影响 T4 的测定，而如果对于测量 T3 的试剂盒而 言，即使与 T4 存在 1%的交叉反应率，都会严重影响 T3 的测定。 1.2.5 其它影响因素：评价试剂盒时还应注意其它 因素，如：溶血、高血脂、抗凝剂、其它药物、异 嗜性抗体及自身免疫性疾病患者等对样本测定结果 的影响，这种影响对不同方法、不同检测项目的影
响程度是不一样的，应逐一充分认识。此部分内容可 放入抗干扰能力。 1.3 剂量－反应曲线建立
定量标记免疫分析的最主要特征就是建立剂 量－反应曲线，通过已知浓度的校准物质（自变量，X） 和相应的反应量（因变量，Y）建立剂量－反应关系，并 同时测量待测品，通过待测样品的反应量（Y'），计算 出未知样品的浓度（X'），因此，这种剂量－反应关系 需要有良好的相关性，即统计学上的“相关系数（r）” （coefficient correlation），当相关系数越趋近于 1 时，表 明剂量－反应关系越密切。建立剂量－反应曲线时 应注意： 1.3.1 选择适当的数学模型拟合
[关键词] 体外诊断试剂；注册；实验室性能评估
Evaluation index for in vitro diagnostic products(IVD) during R&D
XU Weiwen (School of Biotechnology, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China)
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分子诊断与治疗杂志 2010 年 3 月第 2 卷第 2 期 J Mol Diagn Ther, March 2010, Vol. 2 No. 2
·讲 座·
体外诊断试剂研制常用技术指标之分析性能评估
徐伟文
[摘 要] 体外诊断试剂是疾病有效诊治的重要辅助手段。依据《体外诊断试剂注册管理办 法》进行该类产品的注册申报，是我国食品药品监督管理局对体外诊断试剂市场准入的要求。本文 对体外诊断试剂实验室评价的指标设立及其意义进行整理阐述，以利于研发设计及验证。
如前所述，在评价试剂盒时，我们通常用双对数 （适用于非竞争性双位点夹心法标记免疫分析）数学 模型和 log-logi（t 适用于竞争法标记免疫分析）数学模 型。一般认为，经适当的函数转换后的标记免疫分析 的剂量－反应相关系数或其绝对值（r 或|r|）应不低于 0.9900。 1.3.1.1 双对数数学模型：顾名思义，双对数数学模 型因函数自变量（剂量）和因变量（反应量）都经对数 转换而得名。自然对数和常用对数对剂量－反应曲 线的影响仅仅在于截距（A）的不同，通常我们取自然 对数：lnY=A+B*lnX。大量的经验表明：多数夹心法 标记免疫分析（特别是微量或超微量分析，小于 10－9 克）经双对数函数转换后，相关系数都能大于 0.9900； 对于微克级的被测物，选择半对数函数有时能得到更 好的相关系数。 1.3.1.2 log-logit 数学模型：经验表明，对于抑制法标 记免疫分析，log-logit 数学模型因其计算方法相对简 单，且大多数情况下可以得到较好的相关性，因此是 评价这类试剂盒的首选数学模型。方程式：
[ABSTRACT] In vitro diagnostic products（IVD）are very important for both disease diagnosis and therapy. Getting to market with IVD, certification of registration from SFDA is essential. The performance index for evaluation are discussed in this paper.
①抗体的浓度是否与抗原浓度相适应； ②选择的剂量范围是否合适； ③选择的函数方程是否合适。 1.4 精密度评价 精密度是考察试剂盒对同一样本重复测定时能 否得到相同实验结果的能力的指标，通常用重复多次 样本测量结果的变异系数（CV%）表示，精密度评价是 质量控制的重要内容。 1.4.1 分析内(intra assay)精密度：同一次实验内（同 一块微孔板上或实验条件完全相同的情况下）同一样 本（如：质控血清）重复测定（n≥10），测定结果的变异 系数(CV%）应不高于 10.0%。分析内精密度的变化 或异常升高，应从方法学改进、实验室条件改变、操作 失当等方面排查原因。 1.4.2 分析间(inter assay)精密度：分析间精密度涵盖 的内容非常广泛，至少应包含入下内容： 同一试剂盒，不同批次之间； 同一试剂盒，同一批次，不同实验室之间； 同一试剂盒，同一批次，同一实验室，不同操作者 之间； 同一试剂盒，同一批次，同一操作者，有效期内不 同时间之间等。 不同层次的分析间精密度的意义不尽相同，在评 价试剂盒质量时应引起质量控制工作者的足够认 识。评价分析间精密度时，同一样本（如：质控血清） 在上述条件下重复测定（一般 n≥10），测定结果的变 异系数（CV%）应不高于 15.0%。 1.5 准确性评价 准确性评价通常指测量结果趋近于真值的程 度。但是，正如我们所认识到的，对于标记免疫分析， 特别是具有多种同形异构体的大分子物质而言，目前 的分析方法还很难得到真值，因此，还没有真正意义 上的“准确性评价”方法，目前通常是通过标准品核对 实验或回收率实验进行考察。 1.5.1 标准品核对实验：试剂盒内校准品与相应浓度 的国际或国家标准品同时进行分析测定，要求两条剂 量－反应曲线不显著偏离平行（t 测验），以国际或国 家标准品为对照品，试剂盒内校准品的实测效价与标 示效价之比应在 0.900～1.100 之间。标准品核对实验
[KEY WORDS] In vitro diagnostic products（IVD）; Registration; Performance evaluation
疾病的治疗，诊断是第一步，而体外诊断试剂是 重要的辅助手段。随着新技术的发展和新疾病靶标 的发现，开发新型的体外诊断试剂生生不息。但一个 新开发的试剂能否真正面市，除了建立反应模式和体 系并进行优化外，合理的性能分析与评估，是必经的 程序，也是质量保障的基础。自从我们开始涉及体外 诊断试剂的研制开发，就结合临床流行病学中诊断试 剂评价的有关内容以及国家食品药品监督管理局对 体外诊断试剂注册审评的要求，对研发的体外诊断试 剂试验室评价时的一些实验设计提出一些方案。大 部分内容在接下来的应用中得到了肯定，但部分还是 存在不清晰或不合理现象。为更好地执行新的《体外 诊断试剂注册管理办法》，同时也为了进一步提高研 制人员对相关技术指标的科学涵义及其评价设计的 认识，促进注册报批质量的提高，特整理相关资料，希 望对我们的工作有所帮助。