如何检测RNA病毒

流感病毒RNA荧光RT-PCR检测技术实时荧光定量PCR是在常规PCR基础上发展起来的定量PCR技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最后根据ct值和标准曲线，对未知模版进行定量分析。

常用的实时荧光定量PCR又分为非特异性荧光标记的SYBR Green 法和特异性荧光标记的TaqMan法和分子信标法。

一、实时荧光定量PCR原理：1、SYBR Green法：SYBR Green是一种双链DNA结合染料，游离状态下不发光，非特意地掺入到双链DNA中后发出荧光信号，其强度与双链DNA的数量相关，随着扩增产物量的增加，检测到的荧光信号增强。

2、TaqMan法：在扩增反应液中，加入一特异性探针，该探针5‘端和3’端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，两基团位置靠近，5‘端报告基团的荧光能量被3’端淬灭基团吸收，此时检测不到荧光信号，在扩增过程中，探针与模板结合形成Taq 酶的5‘→3’外切活性底物，当Taq酶沿模板向前延伸到探针结合处时，发生链的置换，Taq酶的5’→3’外切活切将探针5‘端连接的报告基团从探针上切割下来，5’端报告基团的荧光能量脱离3’端荧光淬灭基团的吸收，可检测到荧光信号，每经过一个PCR循环，荧光信号也和扩增产物一样，有一个同步增长的过程。

3、分子信标法：探针设计成茎环结构的发夹状，环部核苷酸序列与扩增产物序列互补，两端核苷酸序列互补形成茎部，且一端标记有报告基团，另一端标记有淬灭基团，探针未与模板结合时，报告基团和淬灭基团空间位置靠近，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收，此时，检测不到荧光信号，与模板结合后，探针的构象由发夹状改变为链状，报告基团和淬灭基团分离，可检测到荧光信号。

核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。

本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。

流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA，即为cDNA。

流感病毒RNA荧光RT（PCR检测技术）-流感病毒核糖核酸荧光逆转录聚合酶链反应检测技术实时荧光定量聚合酶链反应是在常规聚合酶链反应基础上发展起来的定量聚合酶链反应技术。

通过在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累，对整个聚合酶链式反应过程进行实时监控。

最后，根据ct值和标准曲线对未知模板进行定量分析。

常用的实时荧光定量PCR可分为非特异性荧光标记的SYBR Green法、特异性荧光标记的TaqMan法和分子信标法。

1。

实时荧光定量聚合酶链反应原理:1。

SYBR Green方法:SYBR Green是一种双链DNA结合染料，在自由状态下不发光，当无意中掺入双链DNA时会发出荧光信号。

它的强度与双链DNA 的数量有关。

随着扩增产物数量的增加，检测到的荧光信号增加。

2，TaqMan方法:在扩增反应液中加入特异性探针，探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，当探针完成时，两个基团的位置接近，5’端报告基团的荧光能量被3’端淬灭基团吸收，此时未检测到荧光信号，在扩增过程中，探针与模板结合形成5’→3’切除活性底物当Taq酶沿着模板向前延伸到探针连接处时，发生链置换。

Taq酶的5’→3’切除活性切割从探针上切割连接到探针5’端的报道基团。

5’末端报道基团的荧光能量与3’末端荧光淬灭基团的吸收分离，并且可以检测荧光信号。

在每个聚合酶链反应循环之后，荧光信号也有一个同步生长过程，就像扩增产物一样3.分子信标法:将探针设计成发夹形的茎环。

环的核苷酸序列与扩增产物的序列互补。

两端的核苷酸序列互补形成茎。

一端用报道基团标记，另一端用淬灭基团标记。

当探针不与模板结合时，报道基团和淬灭基团在空间上彼此靠近，报道基团的荧光能量被淬灭基团吸收。

此时，无法检测到荧光信号。

与模板结合后，探针的构象由发夹状变为链状，报道基团和淬灭基团分离，并呈荧光核酸检测是鉴定流感病毒基因组的一种强有力的方法，即使基因组含量很低或可以检测到死病毒。

实验三病毒RNA的提取及肠道病毒的鉴定一、实验目的：1、掌握病毒RNA的提取技术；2、了解肠道病毒的常用鉴定方法。

二、实验设备与仪器：(1)QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒，1.5mlRNase-free离心管，乳胶手套，一次性口罩，10ul、200ul、1000ulRNase-free无菌枪头及加样枪，普通冰箱，废液缸，新洁尔灭、混合振荡器、离心机、异丙醇、无水乙醇、EP管架(2)PCR扩增仪、加样器、枪头、300ulEppendorf管、掌上离心机、小镊子、试剂盒（PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2）、EB染料、琼脂糖、称量纸、天平、微波炉、50ml三角烧瓶、20ml烧杯、50ml量筒、TAE电泳液、上样缓冲液6×Buffer、制胶盒、样品梳、DNA 分子量marker引物：Control F-1 Primer 5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′Control R-1 Primer 5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′三、实验方法：（一）病毒RNA提取：原理：QIAamp Viral RNA Mini Kit利用硅胶膜的选择吸附的特性，结合真空或分离柱处理，可同时纯化多个样品。

先将样品在高变性条件下裂解，灭活RNase，确保病毒RNA的完整性。

调节buffer至QIAamp膜吸附RNA的最佳条件，将样品转入QIAamp Mini column。

RNA与膜结合，而其他污染物则用两种不同的洗液分两步除去。

用特殊的Rnase-free缓冲液洗脱得到的高质量的RNA，可以直接进行下游实验，也可储存备用。

无需酚/氯仿抽提或酒精沉淀，QIAamp膜就可以保证高纯，完整的RNA。

所有缓冲液和试剂都保证是无Rnase污染的。

试剂准备（由老师课前准备）：1、吸取310ul buffer AVE加入到装有310ug冷冻carrier RNA的管子中，配成1ug/ul的溶液。

欧易生物rna测序步骤欧易生物RNA测序步骤RNA测序是一种用于研究基因表达的技术，可以帮助科学家了解细胞内基因的表达情况。

欧易生物RNA测序是一种高通量的RNA测序技术，可以同时测序数千个基因，具有高灵敏度和高准确性。

下面将介绍欧易生物RNA测序的步骤。

1. RNA提取RNA提取是RNA测序的第一步，目的是从样本中提取出RNA。

欧易生物RNA测序使用的是磁珠法提取RNA，该方法可以快速、高效地提取RNA，并且可以避免RNA降解和污染。

2. RNA质量检测RNA质量检测是RNA测序的关键步骤之一，目的是确定RNA的质量和纯度。

欧易生物RNA测序使用的是Agilent 2100生物分析仪进行RNA质量检测，该仪器可以检测RNA的完整性、浓度和纯度。

3. RNA文库构建RNA文库构建是RNA测序的核心步骤之一，目的是将RNA转化为cDNA，并将其连接到测序适配器上。

欧易生物RNA测序使用的是Illumina TruSeq RNA文库构建套装进行RNA文库构建，该套装可以快速、高效地构建RNA文库，并且可以避免文库污染和偏差。

4. RNA测序RNA测序是RNA测序的最后一步，目的是将RNA文库进行高通量测序。

欧易生物RNA测序使用的是Illumina HiSeq X Ten测序平台进行RNA测序，该平台可以同时测序数千个基因，并且具有高灵敏度和高准确性。

5. 数据分析数据分析是RNA测序的最后一步，目的是对RNA测序数据进行分析和解读。

欧易生物RNA测序使用的是生物信息学分析软件进行数据分析，该软件可以对RNA测序数据进行差异表达分析、通路分析和功能注释等。

欧易生物RNA测序是一种高通量、高灵敏度和高准确性的RNA测序技术，可以帮助科学家了解细胞内基因的表达情况，为生命科学研究提供了有力的工具。

未知RNA病毒自由培养的检测和识别简介大规模并行测序技和信息学的进步重新确定了分析的灵敏度，目的是为了检测和识别病原微生物。

常规的RT-PCR测序，毛细管电泳和微阵列杂交的方法具有一定的局限性。

他们的限制主要是在复杂性方面，他们需要依靠已有的DNA序列的知识，并需要不断的完善来应对快速突变和杂交。

这些方法也取决于分离，培养以及丰富的材料来源。

本文论述了来自于临床样品所有RNA病毒的自由培养的方法。

该方法是被泰国的一所武装部队研究所开发的，该信息分析工作流程能够快速识别已知病原体。

其可以加上额外的算法来鉴定和描述新的或意想不到的病毒在一个样品中的出现。

这种方对于疾病检测和临床快速诊断的应用是一种强大的新工具。

方法1.样品准备使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)试剂盒提取总的RNA，样品来自病人的鼻咽拭子和从相同specimen1隔离培养的病毒。

RNA样品的测序使用的是TruSeq试剂盒。

在MiSeq平台上采用的是2 X 150读长的双端测序。

2.数据分析生成的数据是在两个阶段进行分析的。

第一阶段的分析是测序的Reads和已知的呼吸道病原体数据库进行比对。

病原体的鉴定可以从比对上的Reads中推测出来。

第二阶段的分析包含使用Trinity软件从头拼接比对Reads和使用Blast软件比对来确定病毒是否在数据库中找到。

这两个层次上的方法可以进行病毒序列与一个已知参考数据库的快速筛选同时也可以识别该病毒有没有可能出现在数据库中。

结果样品在MiSeq平台上进行测序，大约产出1百万的Reads。

甲型流感H3N2通过MiSeq平台从同一临床和属于同一样本的分离样品中被成功的鉴定出来。

图3A展示了8个H3N3病毒的临床样品的最小覆盖度都是300 X。

高比对的覆盖率给临床样本的病毒识别提供了一个良好的条件。

同样的分析在病毒的分离配对中也被证实。

MiSeq自动分析的整个流程大约花费了1个小时的时间。

RNA、DNA提取与检测技术（内容：目前RNA提取有哪些主流试剂，有什么优点，价格如何？提取RNA有何注意事项？Northern杂交分析法的一般过程是怎样的？提取质粒目前有哪些好用的试剂盒，提取过程中有些什么注意点？价格如何？Southern杂交的一般过程是怎样的？DNA转染可用哪些方法，各有何优点和缺点？目前主流用哪几种转染方法，所用试剂价格如何，有哪些好的生物公司提供？）一.RNA的提取完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。

所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点，即１）：样品细胞或组织的有效破碎；２），有效地使核蛋白复合体变性；３），对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；5），对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。

但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。

RNA 的提取目前阶段主要可采用两种途径，1),提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2),直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。

第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。

一些公司推出的总RNA提取试剂盒,可以用来制备高质量的可用于建库的RNA。

该总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。

GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。

而进一步从复合体中纯化RNA,则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。

低pH值的酚将使RNA进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。

水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。

进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。

RNA含量的测定—紫外吸收法一、目的1、掌握利用紫外吸光法测定RNA含量的原理和方法2、了解紫外分光光度计的使用原理。

二、原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统(－C＝C一C＝C 一)，能够强烈吸收250~280nm 波长的紫外光。

核酸(DNA，RNA)的最大紫外吸收值在260nm 处。

遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。

在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。

所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。

三、材料1、干酵母粉（市售）。

2、0.2氢氧化钠溶液，2gNaoH溶于蒸馏水并稀释至1000ml。

3、标准RNA溶液：100μg/mL。

4、95%酸性乙醇和无水乙醇。

5、分析天平6、紫外分光光度计7、离心机和离心管8、烧杯(10mL) 锥形瓶和玻璃棒9、容量瓶(100mL)10、移液管(5mL)和移液枪11、试管和试管架。

四、操作1、RNA的提取置4g干酵母粉于 200ml锥形瓶中，加入0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌，后流水冷却，4000r/min，离心15分钟，留上清夜加入95%酸性乙醇40mL,边加边搅拌，后静置5-10分钟，再4000r/min离心5分钟，保留沉淀，再每次用10mL95%乙醇洗涤沉淀，3000r/min，离心5分钟，洗涤两次，再用无水乙醇洗涤两次，每次3000r/min 离心5分钟，收集沉淀于滤纸上，沉淀即为粗RNA，晾干后测定RNA的浓度。

2、样品处理称取0.2—0.25g粗品RNA，加入2ml0.2%的NaOH溶液，和1mlH2O溶解，调成糊状，再加入40—50mlH2O溶解，调节pH至7.0，然后定容至100ml。

（再取2ml定容至100ml待测）3、标准曲线绘制与样品测定配制标准RNA溶液梯度，取11支试管，洗干净后，标号为0、1、2、3、4、5、6、7、五、实验结果1、列表2、标准RNA曲线的绘制由吸光度-RNA浓度标准曲线可得，RNA样品溶液浓度为：C=25μg/mL，因此可求出RNA 样品溶液中RNA的含量为：则RNA样品的纯度为：则干酵母粉中RNA的比例为：六、实验分析1、样品中RNA含量较低，可能原因如下：1)粗制的RNA在空气下长时间放置，性质改变.2)实验环境较差，人体唾液中含有RNA酶，飞溅到RNA上，RNA降解一部分。

rna的鉴定实验报告RNA的鉴定实验报告引言：RNA（核糖核酸）是一种重要的生物分子，它在细胞内起着传递遗传信息和蛋白质合成的关键作用。

为了深入了解RNA的结构和功能，本实验旨在通过一系列鉴定实验，对RNA进行详细的分析和研究。

实验一：RNA的提取与纯化首先，我们从细菌或植物细胞中提取RNA。

这一步骤的关键是使用合适的缓冲液和酶来破坏细胞膜和核膜，释放出RNA。

随后，通过离心等手段，将RNA从其他细胞组分中分离出来。

最后，通过酒精沉淀法将RNA纯化，去除杂质。

实验二：RNA的电泳分析为了确定提取到的RNA的纯度和完整性，我们进行了RNA的电泳分析。

首先，将RNA样品与一定浓度的缓冲液混合，然后将混合物加载到琼脂糖凝胶上。

随后，通过电场作用，RNA在琼脂糖凝胶中移动，根据RNA分子量的不同，形成不同的条带。

最后，通过紫外光照射，观察和记录RNA的分离情况。

实验三：RNA的逆转录与扩增为了进一步研究RNA的表达情况，我们进行了RNA的逆转录与扩增实验。

逆转录是将RNA转化为DNA的过程，通过引入逆转录酶和适当的引物，将RNA的信息转录成相应的DNA序列。

随后，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增DNA，使其数量增加，以便进行下一步的分析和研究。

实验四：RNA的序列测定为了确定RNA的具体序列，我们进行了RNA的序列测定实验。

通过使用高通量测序技术，我们能够快速、准确地测定RNA的碱基序列。

这一步骤的关键是将RNA转化为cDNA，并引入特定的DNA引物，然后通过测序仪对DNA进行测序。

最终，我们可以得到RNA的详细序列信息。

实验五：RNA的功能研究在了解RNA的序列后，我们进行了RNA的功能研究。

通过生物信息学分析和实验验证，我们可以确定RNA的功能和作用机制。

例如，我们可以通过敲除实验来验证某个RNA在细胞中的功能，或者通过RNA干扰技术来研究RNA对基因表达的调控作用。

结论：通过一系列的实验，我们对RNA进行了全面的鉴定和研究。