植物染色体倍性鉴定方法概述

植物细胞染色体倍性鉴定方法魏爱民;杜胜利;韩毅科;张历【摘要】综述了植物细胞染色体倍性鉴定的染色体计数法、流式细胞分析法、检测气孔大小及气孔保卫细胞叶绿体数目法等各种检测方法，并对其优缺点进行了评述。

【期刊名称】《天津农业科学》【年(卷),期】2001(007)002【总页数】3页(P41-43)【关键词】植物;倍性;染色体;流式细胞分析;气孔;叶绿体【作者】魏爱民;杜胜利;韩毅科;张历【作者单位】天津市黄瓜研究所,;天津市黄瓜研究所,;天津市黄瓜研究所,;天津市黄瓜研究所,【正文语种】中文【中图分类】农业科学【文献来源】https:///academic-journal-cn_tianjin-agricultural-sciences_thesis/020*********.html2001 年 6 月Jun ． 2001 天津农业科学 TianjinAgricultural Sciences第 7 卷第2 期Vol.7No． 2植物细胞染色体倍性鉴定方法魏爱民，杜胜利，韩毅科，张历 (天津市黄瓜研究所，天津 300192)摘要：综述了植物细胞染色体倍性鉴定的染色体计数法、流式细胞分析法、检测气孔大小及气孔保卫细胞叶绿体数目法等各种检测方法，并对其优缺点进行了评述。

关键词：植物；倍性；染色体；流式细胞分析；气孔；叶绿体中图分类号：S641.3文献标识码：A文章编号：1006-6500(2001)02-0041-03倍性鉴定在植物遗传育种中具有十分重要的作用。

在单倍体育种中，通过花药（花粉小孢子）、未受精子房等途径再生出的植株，往往是单倍体、双单倍体及其他倍性植株的混合群体，有效的倍性鉴定是了解其遗传背景和进一步应用的基础。

尽早检测出单倍体有利于对其进行加倍处理。

在三倍体无子西瓜、甜瓜的种子检测中，倍性鉴定可用来检测种子纯度。

另外，倍性鉴定也可用于分析细胞分裂活动等生理和遗传研究。

国内外关于各种鉴定方法的报道不少，但较分散，而且很少见将各种方法加以综合和比较的报道。

浅谈植物多倍体鉴定方法【摘要】多倍体育种作为一种重要的育种手段，目前已被广泛应用，其中倍性鉴定是多倍体育种的一个重要环节，快速、准确地进行倍性鉴定对加速育种进程有重要的意义。

本文概括了目前最常用的几种多倍体鉴定方法，并对各自优缺点进行简要比较。

【关键词】植物；多倍体；鉴定多倍体植物通常具有生物产量高、适应性强、抗逆性强、有效成分含量高等特征，然而仅靠染色体自然加倍很难满足现代植物育种的需要。

为此，人为通过物理方法、化学方法、生物学方法等途径使植物细胞染色体组加倍，获得多倍体材料，用以选育符合人们需要的优良品种，是近年来植物育种研究的一个热点。

目前，育种学家已在150属的若干种上进行了研究，并已诱导出许多多倍体。

一批二倍体材料经处理后，其中一些材料的染色体加倍成为多倍体，一些未能加倍依然为二倍体，还有一些为混倍体，因此，准确地辨认多倍体并将其挑选出来，是多倍体育种的一个重要环节。

目前常用的鉴定方法主要有以下几种：1 植株形态学鉴定随着细胞染色体倍性的增加，植物细胞和各器官体积一般趋于增大，表现出茎杆粗壮，叶色变深，叶片变厚，生长缓慢，多倍体的花、果实一般均比二倍体的大，而且花瓣肥厚，花色较鲜艳。

因此，巨型性是多倍体植物最为显著的外部形态特征。

苹果多倍体植株外观具有茎矮、粗壮、节间短、叶宽圆、叶片厚、叶色浓绿、叶脉突起等形态特征[1]。

颖长可以作为水稻染色体倍数的又一指标，水稻单倍体与二倍体的颖长一般以5.6?L为界，二倍体与三倍体的颖长以7.8?L为界[2]。

黄瓜单倍体与双单倍体雌、雄花花冠具有明显区别：单倍体花冠深裂，而双单倍体花冠浅裂，可以作为区别单倍体和双单倍体植株的标志，单倍体能结果，但果形多异常，无正常种子，多空瘪籽，双单倍体种子饱满[3]。

根据植株外部形态特征进行鉴定是初步鉴定多倍体的主要方法，也是最直观，最粗放的方法，优点是简便、快速，不需要任何仪器，可以在苗期做出早期鉴定，为育种工作者减轻工作量。

猕猴桃属十个种的染色体倍性鉴定Chromosome ploidy of ten species in genus ActinidiaWANG Faming，LI Jiewei*，HU Yakang，MO Quanhui，JIANG Qiaosheng，GONG Hongjuan，YE Kaiyu，LIU Pingping （Guangxi Key Laboratory of Plant Conservation and Restoration Ecology in Karst Terrain，Guangxi Institute of Botany，Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences，Guilin *****，Guangxi，China ）Abstract：The genus Actinidia contains more than 66 species and 118 taxa（In the latest revision of the genus，all of them were classified as 54 species and 21 varieties），and most of them were Chinese endemic. As we know，inappropriate mating between parents with different ploidies usually result in crossbreeding failing or offspring-infertility in kiwifruit crossbreeding，so ploidy test would be one of the prerequisites for selecting crossing parents. But so far the chromosome ploidy of quite a number of species in actinidia has been poorly understood，which limits further development and utilization of these resources. In this study，ten ploidy-unknown species of Actinidia：A. albicalyx，A. cylindrica，A. diversicolora，A. linguiensis，A. indochinensis Merr. var. ovatifolia，A. persicina，A. wantianensis，A. longicarpa，A. rongshuiensis and A. pentapetala were studied for their chromosome ploidy with acid hydrolysis method，as most of the ten species are Guangxi endemic harboring unique and excellent horticultural traits and possess great production and development value. The results showed that all of the ten species were diploid （2n=2x=58）. The findings expand the genetic diversity database of Actinidia and provide information for the further rationaldevelopment and utilization of these resources.Key words：Actinidia，ploidy，acid hydrolysis method，resistance to bacterial canker，Guangxi endemic獼猴桃属（Actinidia）植物全世界共有66个种，约118个种下分类单位（变种、变型）（黄宏文等，2000），也有最近的文献将其划分为54个种（Li et al，2007），其中绝大部分为中国特有。

收稿日期:2017-01-09基金项目:上海市农委项目[沪农青字(2016)第1-22号];上海市科委项目(18DZ2291400);上海市农委项目[沪农科种字(2013)第9号];上海市科委项目(14391900500)作者简介:李心(1986 ),女,博士,助理研究员,主要从事花卉育种㊁栽培生理及分子机制研究㊂E-mail:saaslx@ ㊀∗通信作者,E-mail:yangliuyan61@上海农业学报㊀2018,34(4):1-6Acta Agriculturae Shanghai DOI:10.15955∕j.issn1000-3924.2018.04.01文章编号:1000-3924(2018)04-001-06朱顶红染色体核型分析及倍性鉴定李㊀心,张永春,姜红红,孙㊀翊,李青竹,杨柳燕∗(上海市农业科学院林木果树研究所,上海201403)摘㊀要:以朱顶红新生根尖为材料,采用常规压片法进行染色体制片,对朱顶红属品种进行了染色体核型分析及倍性鉴定㊂结果表明:0.002mol∕L 8-羟基喹啉水溶液4ħ预处理朱顶红根尖9 24h,1mol∕L HCl 溶液60ħ解离根尖9min 获得的染色体制片效果最好㊂首次对朱顶红品种 柠檬冰糕 进行核型分析,发现其为三倍体朱顶红,核型公式为K(2n)=3x =33=12m +12sm +9st,核型不对称系数(As.K)为70.19%,核型类型为3B型㊂根据染色体制片结果对6个朱顶红品种进行倍性鉴定表明: 凤蝶 为二倍体朱顶红, 特伦蒂诺 为三倍体朱顶红, 粉色惊奇 快车 苹果花 樱桃妮芙 均为四倍体朱顶红㊂关键词:朱顶红;染色体制片;核型分析;倍性鉴定中图分类号:S682.2㊀㊀文献标识码:A Karyotype analysis and ploidy identification of HippeastrumLI Xin,ZHANG Yong-chun,JIANG Hong-hong,SUN Yi,LI Qing-zhu,YANG Liu-yan ∗(Forest and Fruit Tree Research Institute ,Shanghai Academy of Agricultural Sciences ,Shanghai 201403,China )Abstract :Taking the new root tips as materials,karyotype analysis and ploidy identification of Hippeastrum cultivars were carried out by traditional chromosome tabletting method.The results showed that the best chromosome morphology was observed when root tips treated with 0.002mol∕L 8-Hydroxyquinoline for 9 24h at 4ħand 1mol∕L HCl for 9min at 60ħ.The karyotype of Hippeastrum cultivar Lemon Sorbet was analyzed for the first time.It was found that Lemon Sorbet was triploid,the karyotype formula was K(2n)=3x =33=12m +12sm +9st,the asymmetrical karyotype coefficient(As.K)was 70.19%and the karyotype type was 3B .With the same method,the ploidy identification of 6Hippeastrum cultivars showed that H.papilio was diploid, Trentino was triploid, Pink Surprise , Rapido , Apple Blossom and Cherry Nymph were all tetraploid.Key words :Hippeastrum ;Chromosome preparation;Karyotype analysis;Ploidy identification朱顶红为石蒜科朱顶红属(Hippeastrum Herb.)多年生球根花卉,是本属原生种和现代改良园艺杂交种的总称[1-2]㊂朱顶红原产于南美洲,17世纪传入欧洲和北美,20世纪初引入中国,目前全球约有75个原生种和超过600个园艺品种[3-4]㊂朱顶红花大色艳,形态优美,观赏价值极高,不仅可以作为重要的盆栽和切花材料,还可以作为露地景观栽植,具有极其广泛的应用价值[5]㊂植物细胞染色体的观察与分析技术是细胞遗传学一项基本技术,多被应用于染色体核型分析[6-7]㊁倍性鉴定[8-9]等生物学领域㊂针对染色体形态进行的核型分析有助于了解生物的遗传物质组成㊁变异规律㊁物种起源㊁进化关系等,在细胞分类学㊁染色体工程㊁品种间亲缘关系鉴定中具有重要地位[10]㊂依据染色体计数进行的倍性鉴定方法是目前最直接㊁最可靠㊁应用最广泛的鉴定方法,在辅助植物杂交育种研究和植物遗传学研究中具有重要的应用价值[11]㊂2李心,等:朱顶红染色体核型分析及倍性鉴定迄今为止,国内外鲜见关于朱顶红染色体制片技术及核型分析的报道㊂1994年,邹琦丽等[12]通过对朱顶红原生种 线缟华胄 (H.rutilum)的染色体核型分析,发现其染色体数目为33条,核型公式为K(2n)=3x=33=12m+9sm+12st,被鉴定为三倍体朱顶红㊂2013年,陈瑞娇[13]通过0.1%秋水仙素溶液预处理朱顶红根尖进行常规压片,对白肋朱顶红(H.reticulatum var.striatifolium)进行染色体制片,核型分析结果表明,白肋朱顶红的染色体数目为22条,核型公式为K(2n)=2x=8m+6sm+8st,核型不对称系数(As.K)为69.96%,核型类型为3B型,被鉴定为二倍体朱顶红㊂本试验以朱顶红新生根尖为材料,通过低温与8-羟基喹啉水溶液相结合的预处理方法和HCl解离对朱顶红的染色体制片技术进行进一步的研究,并首次对朱顶红园艺品种 柠檬冰糕 ( Lemon Sorbet )进行了染色体核型分析㊂同时,依据染色体计数结果对6个朱顶红商业品种 凤蝶 (H.papilio)㊁ 特伦蒂诺 ( Trentino )㊁ 粉色惊奇 ( Pink Surprise )㊁ 快车 ( Rapido )㊁ 苹果花 ( Apple Blossom )㊁ 樱桃妮芙 ( Cherry Nymph )细胞水平进行倍性鉴定,以期为朱顶红属资源多样性研究㊁新品种选育㊁亲本选配等奠定细胞遗传学基础㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料取9ħ冷藏处理后的朱顶红开花球,于2015年12月种植于上海市农业科学院花卉基地塑料大棚中,待长出新根后,取新根用于染色体制片㊂1.2㊀方法切取朱顶红品种 柠檬冰糕 新生根尖1cm左右为试验材料,取样时间为上午9:00 10:00;4ħ条件下,用0.002mol∕L的8-羟基喹啉水溶液对根尖材料分别进行不同时间(1h㊁3h㊁6h㊁9h㊁12h㊁24h)的预处理;预处理后的根尖用蒸馏水清洗后置于卡诺氏固定液中,4ħ固定12 24h;蒸馏水清洗后可暂存于70%酒精中;之后取出根尖用蒸馏水清洗,在60ħ条件下用1mol∕L HCl水溶液进行解离处理,时间分别为6min㊁9min㊁12min;清洗后在蒸馏水中低渗30min;用刀片切除根冠后,再切取1mm根尖于载玻片上,捣碎后滴加卡宝品红染色液染色10 20min;常规压片后镜检并于100倍油镜下拍照㊂探索到合适的条件后,以同样的方法对 凤蝶 特伦蒂诺 粉色惊奇 快车 苹果花 樱桃妮芙 进行染色体制片㊂根据染色体制片结果,对朱顶红品种 柠檬冰糕 进行核型分析,并通过染色体计数对 凤蝶 特伦蒂诺 粉色惊奇 快车 苹果花 樱桃妮芙 进行倍性鉴定㊂核型分析根据李懋学等[14]制定的标准进行,使用ImageJ图像处理软件进行染色体配对㊁排列㊁测量等㊂染色体类型分类根据Levan等[15]的方法进行,核型不对称系数采用Arano[16]的方法计算㊂核型类型根据Stebbins[17]的方法划分㊂相关公式为:臂比(L∕S)=长臂(L)∕短臂(S);染色体相对长度=染色体长度∕染色体组总长度ˑ100%;核型不对称系数(As.K)=长臂总长∕染色体组总长度ˑ100%㊂2㊀结果与分析2.1㊀染色体制片2.1.1㊀预处理时间随着0.002mol∕L8-羟基喹啉水溶液预处理时间的增加,染色体逐渐缩短,细胞质浓度逐渐降低,染色体分散程度越来越好(图1)㊂其中1h㊁3h㊁6h预处理后,染色体虽渐渐缩短,但仍然未浓缩到一定程度,相互缠绕现象严重;而9h㊁12h㊁24h预处理后,染色体缩短程度基本相差不明显,且分散程度良好,结构清晰,因此在朱顶红染色体制片中,选用9 24h预处理时间较为合适㊂2.1.2㊀解离时间使用1mol∕L的HCl溶液解离6min后,细胞分散效果良好,染色清晰,但染色体酸解程度不够,相互缠绕现象严重,无法进行染色体相关分析;解离12min后,细胞分散较好,但染色体过度酸解,结构已受到破坏,着色较淡,同样无法进行分析;而9min的解离时间相对适宜,细胞分散良好,染色体酸解适当,着色良好,结构清晰(图2)㊂3上㊀海㊀农㊀业㊀学㊀报1h3h6h10μm10μm10μm 9h12h24h10μm10μm10μm图1㊀不同预处理时间下的染色体形态Fig.1㊀Chromosome morphology under different pretreatment time6m i n9m i n12m i n20μm20μm20μm图2㊀不同解离时间下的染色体形态Fig.2㊀Chromosome morphology under different dissociation time2.2㊀核型分析在 柠檬冰糕 染色体制片图中,选择30个染色体分散良好的细胞进行计数,所有染色体数目均为33条,占计数细胞的比例为100%,因而确定 柠檬冰糕 的染色体数目为2n=33㊂选择染色体形态清晰㊁分散较好的分裂相进行染色体长短臂测量,根据染色体长度由长至短进行配对㊁排列和编号(表1㊁图3 5)㊂表1㊀ 柠檬冰糕 染色体参数Table1㊀Chromosome parameters of Lemon Sorbet染色体序号相对长度∕%臂比(L∕S)类型㊀19.00+3.60=12.60 2.50sm28.54+3.44=11.98 2.48sm38.60+3.13=11.73 2.74sm47.45+2.61=10.06 2.85sm57.84+2.19=10.03 3.57st67.70+2.02=9.72 3.81st77.02+1.82=8.84 3.85st8 4.17+2.70=6.87 1.55m9 3.53+3.06=6.60 1.15m10 3.42+2.66=6.08 1.29m11 2.92+2.57=5.50 1.13m根据配对结果确定 柠檬冰糕 为三倍体朱顶红品种,其染色体数目为2n=3x=33,具有3个染色体组,染色体基数为11㊂核型分析结果表明, 柠檬冰糕 核型公式为K(2n)=3x=33=12m+12sm+9st㊂其中1㊁2㊁3㊁4号为近中部着丝粒染色体(sm);5㊁6㊁7号为近端部着丝粒染色体(st);8㊁9㊁10㊁11号为中部着丝粒染色体(m)㊂染色体的相对长度变化范围为5.50% 12.60%,臂比的变化范围为1.13 3.85,最长染色体与最短染色体长度比为2.29㊂核型不对称系数(As.K)为70.19%㊂臂比大于2ʒ1的染色体所占比例为李心,等:朱顶红染色体核型分析及倍性鉴定63.64%,根据Stebbins 的核型分类标准, 柠檬冰糕 核型类型为3B 型㊂10μm 图3㊀ 柠檬冰糕 染色体形态Fig.3㊀Chromosome morphology ofLemon Sorbet㊀㊀1234567891011图4㊀ 柠檬冰糕 染色体核型Fig.4㊀Chromosome karyotype ofLemon Sorbet 123456789染色体序号6420246810相对长度/%1011图5㊀ 柠檬冰糕 染色体核型模式图Fig.5㊀Chromosome karyotype pattern of Lemon Sorbet‘凤蝶’‘特伦蒂诺’‘粉色惊奇’‘快车’‘苹果花’‘樱桃妮芙’10μm10μm 10μm10μm 10μm 10μm图6㊀不同朱顶红品种的染色体形态Fig.6㊀The chromosome morphology of different Hippeastrum cultivars2.3㊀倍性鉴定6个朱顶红园艺品种的染色体制片结果表明: 凤蝶 染色体计数为22条; 特伦蒂诺 染色体计数为33条; 粉色惊奇 快车 苹果花 樱桃妮芙 染色体计数均为44条(图6)㊂因朱顶红品种染色体基数为11,故 凤蝶 染色体数目为2n =2x =22,具有两个染色体组,为二倍体朱顶红; 特伦蒂诺 染色体数目为2n =3x =33,具有三个染色体组,为三倍体朱顶红; 粉色惊奇 快车 苹果花 樱桃妮芙 染色体数目为2n =4x =44,具有四个染色体组,均为四倍体朱顶红㊂45上㊀海㊀农㊀业㊀学㊀报3㊀讨论染色体制片技术环节主要包括:取材时间与部位㊁预处理方法㊁固定时间㊁解离试剂与时间㊁低渗时间等[18]㊂其中预处理的主要作用是阻断纺锤体形成㊁提高中期分裂相频率㊁促进染色体缩短㊁改变胞质粘度等㊂目前常用的化学处理试剂为8-羟基喹啉㊁秋水仙素㊁饱和对二氯苯和α-溴萘,藜芦碱㊁风油精㊁放线菌酮等也有少量研究者使用[19]㊂物理处理方法主要是0 8ħ低温处理[20]㊂朱顶红的核型分析中,邹琦丽等[12]并未提及研究中所用的预处理方法,陈瑞娇[13]采用的是秋水仙素预处理朱顶红根尖的方法㊂本研究首次使用了8-羟基喹啉与低温处理相结合的方法,其试剂毒性相对秋水仙素较小,获得的染色体形态分散良好㊁缩短长度适宜㊁缢痕明显,可以在朱顶红染色体制片研究中推广应用㊂解离的作用是促进细胞分散和染色体分离㊂酶解主要使用的试剂是纤维素酶与果胶酶,费用相对昂贵,温度在25 37ħ,时间一般在1 4h[6]㊂酸解一般使用的试剂为盐酸,费用低廉,温度为60ħ,时间一般为5 20min[7,20]㊂由此可知,酸解是一种比较高效低廉的解离手段,本研究和陈瑞娇[13]均采用了酸解的方法,效果非常理想,因而在朱顶红制片中应优先采用㊂本研究认为朱顶红品种 柠檬冰糕 的核型公式为K(2n)=3x=33=12m+12sm+9st,其中1㊁2㊁3㊁4号染色体类型为sm,5㊁6㊁7号染色体类型为st,8㊁9㊁10㊁11号染色体类型为m㊂邹琦丽等[12]和陈瑞娇[13]分别对朱顶红原生种 线缟华胄 和白肋朱顶红进行了核型分析,其核型公式分别为K(2n)=3x= 33=12m+9sm+12st和K(2n)=2x=8m+6sm+8st,其中1㊁2㊁3号染色体类型为sm,4㊁5㊁6㊁7号染色体类型为st,8㊁9㊁10㊁11号染色体类型为m㊂本研究和前人研究结果基本一致,唯一的分歧在于4号染色体类型㊂前人的研究中4号染色体臂比值为3.06 3.07,而本研究中4号染色体臂比值为2.85,比值相差并不大,因而这种差异很有可能是染色体测量误差导致㊂综合这3次核型分析结果来看,朱顶红核型不对称系数(As.K)分别为72.59%㊁69.96%㊁70.19%,核型类型均为3B型㊂在生物进化过程中,染色体核型不对称程度越高,其进化程度也越高[17],因此朱顶红应该是植物演化史中进化程度较高的物种㊂另外,这3个朱顶红品种染色体基数均为11,核型也基本一致,说明朱顶红属植物在亲缘关系上较为接近,这与朱顶红大部分原生种可以轻易杂交这一现象也比较一致㊂本研究还对6个朱顶红品种 凤蝶 特伦蒂诺 粉色惊奇 快车 苹果花 樱桃妮芙 进行了倍性鉴定㊂ 凤蝶 原产巴西,是1970发现的原生种; 特伦蒂诺 为南非园艺品种,于2007年育成; 粉色惊奇 快车 苹果花 樱桃妮芙 是荷兰育种家分别于2005年㊁2001年㊁1954年和2004年培育成的园艺品种㊂研究结果表明: 凤蝶 为二倍体, 特伦蒂诺 为三倍体, 粉色惊奇 快车 苹果花 和 樱桃妮芙 均为四倍体㊂花瓣形态数据表明, 粉色惊奇 快车 苹果花 和 樱桃妮芙 相比 凤蝶 特伦蒂诺 花径更大(未发表),观赏性状更为优良㊂说明朱顶红多倍体育种在观赏性方面改进较大,具有较为重要的意义㊂另外,杂交育种在朱顶红育种工作中占有重要地位,在近年来国内外育种家的共同努力下,朱顶红园艺品种越来越多,而对这些来源不同的品种进行的系统性归纳和研究并不多㊂本研究对其中1个原生种和5个园艺品种在染色体水平上进行了倍性鉴定,为杂交育种和倍性育种工作的开展提供了细胞遗传学理论基础㊂参㊀考㊀文㊀献[1]HANNEKE V D,MINEKE K.The complete encyclopedia of bulbs&tubes[M].Lisse:Rebo publishers,2001:159-160.[2]LCZUKI A,WINKELMANN T,RICHARTZ S,et al.In vitro propagation of Hippeastrumˑchmielii Chm.-influence of flurprimidol and theculture in solid or liquid medium and in temporary immersion systems[J].Plant Cell 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实验18 植物多倍体鉴定技术多倍体广泛分布于植物界，如普通小麦是异源六倍体，棉花是四倍体，栽培草莓是八倍体等，多倍体产生途径除自然发生外，化学药剂诱导是很有效的途径。

不管以何种方式产生，检测、鉴定多倍体就显得很重要和迫切。

鉴定多倍体，可采用间接和直接的方法。

间接方法包括形态学和细胞学的观察，直接法是直接对试材检测染色体的数目。

一般来讲，多倍体植物在形态学和细胞学上的特征表现为: 气孔、花器、花粉粒、种子、果实甚至叶片等明显变大，单位面积叶片上的气孔数目减少而密度降低等。

考虑到染色体观察、记数较为烦琐，首先对试材从形态学和细胞学上来初步判断是否为多倍体，然后把初步断定为多倍体的试材再观察、记录染色体数目是否真正地发生了倍性的变异，从而最终确定为多倍体。

芽变选种是无性繁殖植物育种的一种有效途径，多以嵌合体的形式存在，特别是多倍体芽变。

通过检测梢端分生组织LⅠ、LⅡ、LⅢ三层细胞的细胞、细胞核及核仁的大小，可以鉴定芽变材料倍性嵌合体的类型。

本实验学习多倍体鉴定的基本方法。

一、试材及用具1．试材:玉米、小麦、棉花、草莓、番茄、苹果等。

2．用具:显微镜、剪刀、培养皿、载玻片、盖玻片、吸水纸、镊子、纱布、酒精灯、物镜测微尺、目镜测微尺等。

3．试剂及配制（1）卡诺氏固定液: 冰醋酸1份，加纯（或95%）酒精3份，混匀，现用现配。

（2）醋酸纤维素液: 称取10g醋酸纤维素，加入到100 mL的丙酮溶液中，用玻棒搅拌数分钟至醋酸纤维素全部溶解。

（3）醋酸洋红染色剂: 取45 mL冰醋酸，加入55 mL蒸馏水，加热至沸腾，慢慢加入2 g洋红，煮沸约5 min，冷却后加入2% 硫酸亚铁。

过滤，贮于棕色瓶中。

（4）解离液: 铬酸2g，浓硫酸8 mL，浓硝酸3 mL，蒸馏水89 mL，充分混匀。

二、方法步骤（一）间接方法1．形态学观察观察试材的形态学特征，例如叶片、果实、种子、花器等是否有较明显的增大现象，如果肉眼就能观察到明显的增大现象，说明试材很有可能是多倍体。

太子参染色体倍性鉴定方法研究姚丽园;张伟伟;叶祖云【摘要】应用气孔观测法和染色体计数法,开展秋水仙素诱导后的太子参各株系染色体倍性鉴定.结果表明：太子参同源四倍体植株的气孔长度48-60μm,保卫细胞的叶绿体数量24-38个,染色体为2n=4x=64;二倍体植株的气孔长度36-44μm,保卫细胞的叶绿体数量12-22个,染色体为2n=2x=32.太子参四倍体植株的气孔长度明显比二倍体的长,四倍体的保卫细胞叶绿体数目大约是二倍体的两倍.对52个太子参株系的倍性鉴定显示植株成熟叶片下表皮气孔的大小及保卫细胞叶绿体的数量与其染色体数目形成准确的对应关系,气孔观测法可作为鉴别太子参四倍体与二倍体的简便方法,再用染色体计数法,能进一步确定其染色体倍性.%Using methods of stoma observation and chromosome counting,identified the chromosome ploidy of Pseudostellaria heterophylla after the induction by colchicines.The results showed that the autotetraploid plants had 48-60 μm stomata length,24-38 chloroplast number in stomata guard cell and2n=4x=64 chromosome number;The diploid plants had 36-44 μm stomata length,12-22 chloroplast number in stomata guard cell and 2n=2x=32 chromosome pared with diploid,autotetraploid showed characteristics of larger stomata and about two times chloroplast number in stomata guard cell.The results of 52 Pseudostellaria lines ploidy identification indicated that accurate corresponding relationship was formed between stomata size in mature leaf lower epidermis and chloroplast number in guard cell and chromosome number of plant.The stomatal observation method is a simple method to identifiyautotetraploid or diploid of Pseudostellaria,the chromosome counting method can further define its chromosome ploidy.【期刊名称】《宁德师范学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(024)001【总页数】4页(P47-50)【关键词】太子参;染色体;倍性鉴定【作者】姚丽园;张伟伟;叶祖云【作者单位】宁德师范学院生物系,福建宁德352100;宁德师范学院生物系,福建宁德352100;宁德师范学院生物系,福建宁德352100【正文语种】中文【中图分类】Q343.244太子参（Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax）为石竹科孩儿参属植物，是我国地道中药材，以块根入药，具有益气生津、补肺健脾之功效[1].其药用成分主要是太子参多糖类、皂甙类、氨基酸类、环肽类物质，具有抗疲劳、抗应激、促进免疫等作用[2，3]，可作为人参和西洋参的代用品，老少皆宜.染色体倍性化在植物进化、作物品种改良上作用重大.准确鉴定植物染色体倍性是作物倍性育种及其应用的重要环节，应用简便方法有效且尽可能早期鉴定出植株的倍性水平，可以大大减少倍性育种的工作量及盲目性，缩短育种时间.药用植物多倍体通常具有器官巨型化、抗逆性强、药用成分含量高等特性，这在药材育种上具有较高的应用价值和增产前景.本文在对太子参进行多倍体诱导和植株再生研究的基础上[4]，开展秋水仙素诱导后的太子参各株系组培苗染色体倍性鉴定研究，旨在探索一套简便而又准确的太子参倍性鉴定方法.1 材料和方法1.1 材料福建省柘荣县栽培的太子参优良品种“柘参1号”和“柘参2号”的组培苗及其经秋水仙素诱导培养的太子参组培植株.1.2 方法1.2.1 太子参植株的培养与增殖将秋水仙素诱导后培养成活的太子参植株进行编号，取其0.3 cm长的顶芽，接入培养基单独培养，培养30 d，形成植株，再取其顶芽培养30 d后，第3次取其顶芽于同一条件下培养60 d，形成一健壮植株，将植株剪成单茎节接材，接材带顶芽或腋芽，接入相同培养基，每瓶接5-10个接材，培养60 d，再继代培养1-2次，使每个株系都增殖形成20株左右的健壮组培苗.使用的培养基均为MS+0.2mg/LNAA，含3%蔗糖和0.8%琼脂，pH=5.8.培养条件：光照强度2000 lx，光照时间14 h/d，培养温度(25±1)℃.1.2.2 植株气孔特征观察比较剪取太子参各株系健壮组培苗的成熟叶片，用尖嘴镊子撕叶片下表皮，置于载玻片上，加一小滴0.35mol/LNaCl溶液，盖上盖玻片，在目镜带测微尺的普通显微镜下观察气孔特征，低倍镜下取3个视野测定气孔密度；高倍镜或油镜下随机测量10个气孔的长度，随机计数10个保卫细胞内叶绿体的数量.使用LEICA DM750数码生物显微镜进行拍照.每个株系测定3个不同植株的成熟叶片，统计比较各株系气孔长度、气孔密度、保卫细叶绿体数量.1.2.3 植株染色体观察计数在无菌条件下剪取生长旺盛的组培苗的茎尖10个左右，长度约0.5 cm；去除叶片，将茎尖浸入萘丸饱和液中，置于0-4℃冰箱内低温处理24 h；将茎尖转入Carnoy固定液中固定24 h左右，转到70%酒精中保存备用.压片时，用清水将茎尖洗涤3次，置于盐酸解离液中（浓盐酸∶乙醇=1∶1），室温解离20min；然后去除解离液，加清水洗涤3次，将茎尖放在载玻片上，体视镜下剥离出茎尖顶端生长点，滴加1-2滴卡宝品红（改良苯酚品红）染液，染色20min左右；用吸水纸吸去多余染液，盖上盖玻片，再盖上滤纸条或一片载玻片，先用镊子柄轻轻敲打，然后用铅笔的橡皮头垂直敲打，使细胞和染色体分散开.显微镜下观察压好的片子，低倍镜下寻找有分裂相的细胞，高倍镜下观察染色体呈分散状态的中期细胞，转到油镜下计数并拍照.每个株系观察计数10个染色体分散状态良好的细胞.2 结果及分析2.1 各株系的气孔大小及保卫细胞叶绿体数量秋水仙素诱导后培养成活的太子参植株，通过连续的顶芽培养与增殖，最后形成52个株系.对各太子参株系的组培植株成熟叶片下表皮气孔大小、密度及保卫细胞叶绿体数量的观察计数、统计分析，结果显示：38个株系植株的气孔特征与原品种“柘参1号”和“柘参2号”的组培植株的相同，成熟叶片下表皮气孔长度36-44μm，气孔密度约216个/mm2，保卫细胞的叶绿体数量12-22个（图1，a），是太子参二倍体植株的气孔特征；14个株系的植株叶片下表皮气孔长度48-60μm，保卫细胞的叶绿体数量24-38个（图1，b），是太子参同源四倍体植株的气孔特征.14个四倍体株系中11个株系的气孔密度比原品种小6.7%-23.4%，另外3个株系的气孔密度与原品种大致相同.太子参四倍体植株气孔大小及保卫细胞叶绿体数量与原品种的差异显著，气孔长度约为原品种的1.35倍，保卫细胞的叶绿体数量约为原品种的两倍，而气孔密度上没有显示出明显的规律性差异.因此，对于太子参组培植株，气孔观测法以气准确判定植株为二倍体还是四倍体.气孔观测法用于观察植株气孔特征的叶片必须是成熟叶片，植物成熟叶片下表皮的气孔特征比较明显且较一致.观察时，撕取叶片主脉与侧叶缘中间位置的下表皮，可减少观测结果的误差，使结果具代表性和普遍性.保卫细胞吸水和失水，引起气孔宽度变化较大，顾气孔宽度不宜作为观察指标.叶绿体呈绿色，无需染色，易观察计数.孔大小及保卫细胞叶绿体数量作为观测指标，能较图1 太子参二倍体与同源四倍体的气孔特征比较a：二倍体植株气孔及保卫细胞叶绿体；b：四倍体植株气孔及保卫细胞叶绿体图2 太子参二倍体与同源四倍体的染色体数目比较a：二倍体染色体2n=2x=32；b：四倍体染色体2n=4x=642.2 各株系的染色体数目与倍性太子参各株系的组培植株的茎尖生长点压片观察、细胞染色体计数，结果显示：气孔特征与原品种一样的38个株系的细胞染色体数目都是2n=2x=32条（图2，a），是二倍体植株；气孔特征与原品种有显著差异的14个株系的细胞染色体数目均为2n=4x=64条（图2，b），其染色体数目比原二倍体品种增加了1倍，是同源四倍体植株.观察的52个株系的气孔的大小及保卫细胞叶绿体的数量与其染色体倍性形成准确的对应关系.可见，太子参组培阶段，气孔观察法可作为鉴别太子参四倍体与二倍体的简便方法，进一步使用染色体计数法，能更准确地确定其染色体倍性.由于太子参组培苗形成的根非常细小，分生组织少，取根尖压片观察时，很难观察到细胞处于分离中期的染色体；以茎尖为材料，需在解剖镜下剥取顶端生长点，虽然操作繁琐些，但能缩短观察时间，能迅速找到较多分离中期的细胞.3 讨论植物染色体倍性鉴定之前，必须获得遗传稳定、细胞染色体倍性一致的植株.在使用秋水仙素诱导植物细胞染色体加倍过程中，往往伴随着染色体倍性不同的细胞及染色体非整倍性的细胞存在，使植株呈现嵌合体状态.随着植株或细胞培养时间的延长，非整倍性细胞由于生活力较弱而逐渐减少，细胞存在向整倍性回归的现象[5].秋水仙素诱导后培养成活的太子参植株，连续三次取其顶芽进行培养后，进行扩繁，可获得细胞染色体倍性一致的植株.植物染色体倍性鉴定方法较多，总体上可分为三个水平：以观测植株、叶片、气孔、花粉、种子、果实为主的形态学水平，观察染色体的细胞水平，检测DNA的分子水平，植株形态学观测最直观简便，细胞染色体观察最准确[6，7].太子参组培阶段，应用气孔观测法就能较准确判定植株的倍性，该方法可早期筛选、简便迅速、破坏性小、准确度高，对已筛选的株系再用染色体计数法进一步确定，即节省人力物力，又提高鉴定效率，两种方法结合构成了一套简单、高效、准确的太子参染色体倍性鉴定方法.已确定的太子参四倍体株系，采用太子参微块根诱导技术[8]，进行工厂化种苗繁育[9]，能使四倍体株系迅速进入大田试验阶段，尽早应用于育种实践.参考文献：[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京化学工业出版社，2010.[2]刘训红，王玉玺.太子参多糖抗应激和免疫增强作用的实验研究[J].江苏中医，2000，21(10)：51-52.[3]余永邦，秦民坚，余国奠.太子参化学成分、药理作用及质量评价研究进展[J].中国野生植物资源，2003，22(4)：1-7.[4]Ye Zuyun，Wang Yaying，Tian Huiqiao.Regeneration of plantlets and tetraploidy induction in Pseudostellaria hterophylla[J].Ac ta Biologica Cracoviensia Series Botanica，2009，51（2）：13-18.[5]王瑞，张亚楠，王雅英，等.中国水仙六倍体的诱导和染色体数目的变异[J].分子细胞生物学报，2007，40(3)：263-270.[6]张晓艳，刘剑锋，王丽品.药用植物多倍体诱导与鉴定研究进展[J].吉林师范大学学报，2009(4)：128-131.[7]陶抵辉，李小红，王利群.植物染色体倍性鉴定方法研究进展[J].生命科学研究，2009，13(5)：453-458.[8]叶祖云，王雅英，田惠桥.太子参试管微块根形成及其应用初探[J].植物生理学通讯，2009，45（3）：263-266.[9]叶祖云，阮少江，杨卓飞，等.四倍体太子参种苗繁育技术体系的建立[J].中药材，2011，34（3）：340-342.。

橡胶树种质资源的倍性鉴定橡胶树（Hevea brasiliensis）是一种重要的经济作物，广泛栽培以供橡胶生产。

在橡胶树种质资源的利用和种质改良中，倍性鉴定对于选育优质橡胶树品种、提高橡胶产量和生产效益具有重要意义。

倍性鉴定可以帮助筛选出高产、高质、抗病性强的优良橡胶树种质资源，从而推动橡胶产业的发展。

一、橡胶树的倍性概述倍性指的是一个生物个体所拥有染色体组的倍数。

在植物中，常见的倍性有二倍体（2n）、四倍体（4n）、六倍体（6n）等。

橡胶树的倍性变异较为复杂，已经鉴定出了2n、4n、6n和8n等倍体群体。

橡胶树的自然倍性变异主要来源于杂交和多倍体群体的起源。

杂交是自然界中广泛存在的现象，橡胶树也经常发生自然杂交，导致新的倍性类型的出现。

多倍体橡胶树群体也是通过无性繁殖如自然倍化（包括无盖落、有盖落和人工无性繁殖等）或化学诱导倍化形成的。

这些多倍体橡胶树群体在产量、抗逆性等性状上常常具有独特的优势，因而倍性鉴定对于利用这些多倍体群体进行橡胶树种质改良和产业发展具有重要意义。

二、橡胶树倍性鉴定方法橡胶树的倍性鉴定方法多种多样，包括了细胞学、生殖生物学、分子生物学等多种手段。

细胞学方法是辨识倍性最直接的手段之一，通常通过观察组织细胞的染色体数目和形态来判断倍性。

细胞学方法一般包括了根尖染色体检查、胚胎发育鉴定、花药母细胞染色体行为鉴定等。

生殖生物学方法也常用于橡胶树的倍性鉴定，通过观察杂交后代的染色体数目和性状表现来鉴定橡胶树的倍性。

分子生物学方法则是通过测定橡胶树DNA组的染色体数目和特定基因的拷贝数来判断倍性。

以上方法各有利弊，通常综合运用效果更佳。

橡胶树种质资源的倍性鉴定对于橡胶产业的发展和种质改良具有重要意义。

一方面，橡胶树的倍性鉴定可以帮助筛选出高产、高质、抗病性强的优良橡胶树品种，从而为橡胶产业提供更多的优良种质资源。

橡胶树的多倍体群体常常具有独特的性状优势，倍性鉴定可以帮助鉴定这些多倍体群体，从而为橡胶树的种质改良和新品种选育提供更多的资源。