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13-2多肽与蛋白质类药物

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生物制药多肽与蛋白质类药物

生物制药多肽与蛋白质类药物
• b．种子培养基 1％蛋白胨、0.5％酵母提取 物、0.5％NaCl。
• c．种子摇瓶培养 在4个1000mL三角瓶中， 分别装入250mL种子培养基，分别接种人干 扰素αⅡb基因工程菌，30℃摇床培养10h，
第28页/共46页
• d．发酵培养基 1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、 0.01％NH4Cl、0.05％NaCl，0.6％ Na2HPO4、0.001％CaCl2、0.3％KH2PO4、 0.01％MgSO4、0.4％葡萄糖、50mg/ml氨 苄西林、少量消泡剂。
第9页/共46页
• 沉淀4加原体积l/25000量pH=8.0的 0.1mol/L PBS溶解，调至pH=7~7.5，对 PBS(pH=7.3)透析，过夜，离心，收集上清液， 检测，得IFN-B。上清液3中加盐酸使pH值降 至3.0，离心，得沉淀5。沉淀5加入原体积 1/5000量的pH=8、0.1mol/L PBS溶解，加 NaOH调节pH=7~7.5，对PBS(pH=7.3)透 析过夜，离心收集上清液，检测，得IFN-A。 每份灰黄层约能制备100万单价的纯化干扰素。
第10页/共46页
• 此法特点是一次纯化量大，回收率高于60％； 经济，简便，易于普及。效价可达1.2×108 U/ml，比活2.2×106 U/mg(蛋白)。IFNA中干扰素含量占回收干扰素的82％，比活 也比较高。IFN1的比活较低[5×104 U/mg (蛋白)]，一般可作外用滴鼻剂或点眼剂等。
第14页/共46页
• 将0.5µg平头末端cDNA用末端转移酶加15 个dC，并将2µg质粒pBB322在PstⅠ位点 线性化，用末端转移酶加15个dG，再将两者 连接，利用这种方法可产生新的PstⅠ位点， 利于从载体上再次切下cDNA。将产生的质 粒转化大肠杆菌HB101后，用微量板培养。 合成引物5′-CCTTCTGGAACTG- 3′，该序 列是IFN-α、β最长的不间断保守序列，用其 作引物可同时调出IFN-α、β。

多肽与蛋白质类药物

多肽与蛋白质类药物
A. 许多活性蛋白质、多肽都是由无活性的蛋白质前体，经 过酶的加工剪切转化而来的有共同的来源，相似的结构 ，保留着若干彼此所特有的生物活性。研究活性多肽结 构与功能的关系及活性多肽之间结构的异同与其活性的 关系，将有助于设计和研制新的活性多肽药物。
B. 对蛋白质类药物进行结构修饰
多肽、蛋白质类药物分类
3.3.1 反相高效液相色谱
3.3.1 反相高效液相色谱
分离机理：
①用C4～C8烷基作配基，将配基键合在固定基质上作为固定相 ，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流 动相（流动相极性大于固定相）。
②蛋白质分子中既有亲水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH 等），也有疏水性基团（如苯环、-CH3、-CH2和-CH等）。
理论上，每公顷红花田可生产出1公斤人胰岛素原料药。
3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法
加拿大渥太华大学生物技术研究中心的科研人员也利 用另两种高产作物——烟草和水稻植株生产出了一种 名为“胰岛素样生长因子”(ILGF)的新型降血糖药物 。
据称，ILGF的降糖效果甚至优于常规口服降糖药。 如果ILGF能通过临床试验并成功上市，或将成为前景
3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法
加拿大SembioSys生物工程公司利用北美洲普遍栽培的高 产油料作物——红花作为转基因植物“平台”，成功生 产出“红花子来源人胰岛素”，
该胰岛素顺利通过动物实验与Ⅰ～Ⅱ期临床试验，其药 代动力学与药效学试验结果与美国礼来利用大肠杆菌表 述胰岛素基因生产的重组DNA人胰岛素基本一样。
多肽和蛋白质的物化性质
4. 变性 ➢ 天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下，
其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生 物学活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性， 称之为蛋白质的变性作用(denaturation)。 ➢ 变性蛋白质和天然蛋白质最明显的区别是溶解度降低

多肤与蛋白质类药物

多肤与蛋白质类药物
• 下面对分离纯化各阶段对各种方法的选择的一般原则作简单的 讨论:
• (1).分离纯化早期使用方法的选择 • 分离纯化的早期，提取液中物质十分复杂，制备物质浓度较稀、
物理性质上与被制备物相似的杂质数量较多。因此早期分离纯化 用萃取、沉淀、吸附等一些分辨力低的方法比较有利。这些方法 可以出去大部分理化性质相差较大的杂质，同时萃取、沉淀、吸 附分离方法还起着浓缩的作用，可为以后进一步分离纯化创造良 好的基础。
肽链的氨基和羧基的方法来完成。因活化氨基的反应激烈， 而且常常产生消旋化，所以，总是采用羧基活化的方法，也 就是说，合成肽的常规方法是从C-端向N-端进行。 • 肽的合成法可分为阶梯伸长法（stepwise elongation）和片断 缩合法（fragment condensation）。
• (1) 阶梯伸长法 • 常用于活化羧基的方法是混合酸酐和活化酯化。 • DOC法（N,N-二环己基碳二亚胺）得到广泛应用。使用碳二亚胺
• 2.提取
• 提取是分离纯化的第一步，它是将目的物（制备物）从复 杂的生物体系中转移到特定的人工液相体系中（通常是水、 缓冲液、稀盐溶液或有机溶液）。提取的总要求是最大限 度地把有效成分提取出来，关键是溶剂的选择。提取所用 溶剂的选择标准，首先对被制备物具有最大溶解度，并在 提取中尽可能减少一些不必要的成分。为了更好地达到以 上目的，常用的手段是调节溶剂的pH、离子强度、溶剂成 分分配比和温度范围等。
• 6.纯度检查
• 蛋白质的纯度是化学和物理学的概念，它和蛋白质所具有的生物 活性有着更复杂的关系，蛋白质的聚合状态、辅基的存在、蛋白 质的变性作用等极大地影响其生物活性，而这些因素的影响有些 往往是用一般纯度检查的方法所查不出来的，这是值得注意的一
种情况。常用蛋白质纯度检查的方法有：HPLC或FPLC、电 泳法、免疫化学法、生物测定法、分光光度法等。

蛋白质多肽类药物

蛋白质多肽类药物
▪ 20世纪80年代 研究者克隆了人干扰素基因，实现了基因工程
rhuIFN的大规模生产。
▪ 到了20世纪90年代 以提高rhuIFN的生物利用度和药代动力学
为主要开发方向，进行了干扰素聚乙二醇（PEG）修饰，研制了长效 干扰素，减少了给药次数，提高了疗效。
▪ 1986年 第一个重组人α干扰素Roferon(Huffman-La Roche)上市,现
复杂的化学降解和物理变化而失活。
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蛋白多肽类药物的关键问题
提高稳定性的方法： （1）温和的生产条件如对温度、机械搅拌强度和有 机溶剂的选择，对无菌条件的控制，容器的吸附效 应，水分控制，低温冷藏等。 （2）设计正确的处方如PH、缓冲对、电解质；加 入适宜稳定剂、冻干保护剂、阻聚剂如非离子表面 活性剂、糖、甘露醇、山梨醇、PEG、人血清白蛋 白等以及制备包合物等。
实用文档
蛋白多肽类药物的关键问题 蛋白多肽类药物关键问题
▪1）结构特征：蛋白质分子的化学结构决定其活性；药物的空间结
构即二维、三维结构也同样影响生物活性；另外，多肽及蛋白质的分子 量常为数千至几十万，颗粒大小在l～100nm之间，不能透过半透膜。
▪2）体内外不稳定性：蛋白质药物在体内外环境可能经受多种
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▪粒细胞/单核细胞集落刺激因子GM-CSF（1985年Wong和克隆出人GM-CSF的cDNA，并实现了表 达，1993年张智清等人在国内首次克隆了人GM-CSFcDNA，并在大肠杆菌里获得表达）
▪其他造血相关因子
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人细胞因子
▪刺激网织红细胞的早期向血液中释放 EPO 的功效在一
定剂量范围内呈剂量依赖性，但剂量超过太大后并不增加药效。
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rHuEPO的应用

多肽与蛋白质类药物 ppt课件

多肽与蛋白质类药物 ppt课件
疾病发病机理的揭示, 对体内各种酶, 辅酶, 生长代谢调 节因子的深入认识, 可以针对性开展多肽和蛋白质类药物 的研发。
12
多肽和蛋白质类药物研发技术与方向
1) 化学合成方法
2) 改造生物活性多肽及现有多肽药物
3) 提高活性多肽及现有多肽药物档次
4) 针对具生物活性的多肽天然产物研发
13
三、多肽及蛋白质类药物的生产方法
（3）胰岛素及其它激素 生长素释放抑制因子，是一种人 脑激素，治疗肢端肥大症， 50万个羊脑提取5mg. 工程菌：7.5L培养液可得到5mg.
肢端肥大症
2.血浆蛋白质
白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血纤蛋白等
3.蛋白质类细胞生长调节因子 干扰素α、 β、 γ（IDN）,白细胞介素（1~16）（IL）神经生 长因子等
IFN：干扰素 IL：白细胞介素 hGH：生长激素 FDGF：成纤维细胞衍化生长因子
CSF：克隆刺激因子 EPO：红细胞生成素
10
二、多肽和蛋白质类药物特点
1) 基本原料简单易得 多肽和蛋白质类药物主要以20种天然氨基酸为基本结构
单元依序连接而得,代谢物氨基酸为人体生长的基本营养成分, 可通过农产品发酵而制备。
t-PA(tissue-plasminogen activator)译成中文为组织纤溶 酶原激活剂，人体内自然存在，同时也是临床上用于急性心 肌梗死的一种生物蛋白药物，有18个半胱氨酸，9对二硫键
1953年，人类用化学合成法合成了有生物活性的多
肽----催产素。
（2）天然动植物及重组动植物提取法
通过生化工程技术，从天然动植物中分离纯化。由 于天然动植物中的有效成分含量过低，杂质太多，引起人 们对重组动植物的重视。
重组动植物只通过基因工程技术手段，将药物基因 或能对药物基因起调节作用的基因转导入动植物细胞，以 提高动植物合成药用成分的能力，再经过生化分离，制得 生物制品。

蛋白质与多肽类药物探讨

蛋白质与多肽类药物探讨

蛋白质与多肽类药物探讨摘要：在蛋白质、多肽类的制药和应用中，如何提高其稳定性和吸收率是一个重要的问题。

本文通过蛋白质、多肽类药物的稳定性、给药方式进行分析，对如何提高该类药物的稳定性，促进药物吸收进行了研究。

关键词：药物；制药；蛋白质；多肽引言当前蛋白质、多肽类药物在临床上被广泛的应用，蛋白质类药物如胰岛素、干扰素等，多肽类药物有多肽疫苗、抗菌肽等。

该类药物具有效果显著、副作用低的特点。

但由于该类药物多为大分子物质，因此在保持稳定性和吸收上存在着一定的困难，导致药效难以达到理想的水平。

本文从蛋白质、多肽类药物的稳定性、给药方式进行研究，对如何提高该类药物的稳定性，促进药物吸收进行了研究。

1.蛋白、多肽类的稳定性对于蛋白质、多肽类药物来说，其在稳定性上与其他小分子药物存在着一定的差异。

蛋白、多肽类药物的稳定性不仅取决于一级结构，还受到其空间构型和构象，即高级结构的影响。

该类药物一级结构的稳定性决定了其化学稳定性，主要体现在天然蛋白质、多肽类药物的氨基酸残基容易发生各种反应而被修饰变化；高级结构则决定了其物理稳定性，主要体现在当蛋白质、多肽二级结构的氢键以及三、四级结构的次级键发生变化而导致其三维构象发生改变，进而导致药物变性，使其药物效果发生改变。

通常情况下，蛋白质、多肽类药物具有一定的抵抗外界因素导致其展开变性的能力，即热力学稳定性，一般使用其展开变性后与天然结构下的吉布斯能差进行表示，能差越高表示其越稳定。

蛋白质、多肽类药物抵抗非自然条件导致的不可逆结构变化的能力则被称为动力学稳定性或长期稳定性，其主要是指蛋白质展开速度，一般以半衰期来表示，半衰期越长则表示其越稳定。

2.蛋白、多肽类药物给药系统及障碍在蛋白质、多肽类药物的使用上，给药途径的选择对于药物的吸收情况有着非常大的影响。

（1）蛋白质类药物如果口服给药则会被胃酸或其他消化酶破坏，导致其失去活性，因此口服给药通常仅适用于缤纷多肽类药物。

（2）黏膜给药通常会选择人体的鼻腔黏膜或者口腔黏膜，这些部位的血管分布较多，黏膜通透性较好，且很少受到消化液、消化酶的影响，因此药物吸收率较高，其中鼻腔黏膜是最好的黏膜给药途径。

蛋白质与多肽类药物的研究及应用

蛋白质与多肽类药物 的研究及应用
昆明医科大学基础医学院 生物化学与分子生物学系 武静
目前市场上的主流药物
小分子化合物药物
优点：相对分子量小，易透过细胞膜，物化性
质明确，稳定及热不敏感，无抗原性，直接化学 合成，价格低廉，口服给药等 缺点：副作用大，易引起抗，耐药性等
生物药物 疫苗 小分子
多肽和蛋白质
• 进入 20 世纪 90 年代，随着 PCR 技术、抗体库 技术和转基因技术的发展，治疗性单抗最终实
现全人源化，使抗体最终可应用于临床治疗 。
全人抗体
基于噬菌体可把抗体片段，再经体外加工可形成有功 能的完全人抗体。 全人抗体成功的例子：Humira：abbott 公司（雅 培）抗TNF 全人单抗，用于治疗关节炎。
人－鼠嵌合抗体
用人IgG 的恒定区取代小鼠IgG 的恒定区，保留鼠 单抗的可变区序列，形成一个人 - 鼠杂合的抗体。 其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性， 却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另 外，它还具有人抗体的效应功能，如补体固定、抗 体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）等。 嵌 合 抗 体 成 功 的 例 子 ： Rituxan ： Idec pharmaceutical/Genentech 的小鼠抗CD20 抗体， 含人IgG1 恒定区，用于治疗B 淋巴瘤。它的抗淋巴 瘤作用主要可能来自于补体作用、ADCC 和诱导肿 瘤细胞凋亡。
免疫球蛋白水解片段
Fab Fab
木瓜蛋白酶 Fc
木瓜蛋白酶
胃蛋白酶 胃蛋白酶
F(ab’)2
pFc’
单链抗体scFv
• 通过基因工程设计，只编码抗体的重链可变区以 及轻（VH+VL），通过一段多肽连接，形成单链 抗体的可变区（scFv）。连接肽将VH 的C 端与VL 的N 端连接，反之也可以。它保留了抗体与抗原 的特异性，可以使用大肠杆菌表达。穿透力强但 往往亲和力下降。分子量~25KD。 • 现在FDA 没有批准一个单链抗体（scFv）上市， 但是有10 多个项目在临床试验。 例如： Pexelizumab, 为 Alexion Pharmaceutical 公 司研制，在2004 年进入临床I 期，正在临床III 期， 主要用于治疗冠状动脉疾病。

蛋白质、多肽类药物质量控制


可能导致产品质量存在差异，需要加强批次间一致性的控制。
03
稳定性差
蛋白质、多肽类药物容易受到温度、湿度、光照等因素的影响，导致其
稳定性较差，需要加强存储和使用过程中的保护措施。
未来发展方向
加强创新研究
加强国际合作与交流
通过加强创新研究，开发更加精准、 高效的质量控制技术和方法，提高蛋 白质、多肽类药物的质量控制水平。
可以揭示蛋白质的三维结构，对于理解蛋白质功能和药物设计具有重要意义。
纯度测定
总结词
纯度测定是评估蛋白质、多肽类药物质量的重要指标，主要通过色谱技术、电泳技术和质谱技术等方法进行。
详细描述
纯度测定是评估蛋白质、多肽类药物中目标成分的纯度和杂质的含量。色谱技术如凝胶电泳、高效液相色谱等可 以根据分子大小、电荷和疏水性等性质将目标成分与杂质分离。电泳技术则根据蛋白质、多肽的电荷和大小进行 分离。质谱技术可以用于鉴定和定量目标成分和杂质，具有高灵敏度和高分辨率的特点。
蛋白质、多肽类药物 质量控制
目录
CONTENTS
• 蛋白质、多肽类药物概述 • 蛋白质、多肽类药物质量控制标准 • 蛋白质、多肽类药物质量控制方法 • 蛋白质、多肽类药物质量控制现状与挑
战 • 新技术与新方法在蛋白质、多肽类药物概述
定义与分类
定义
蛋白质和多肽类药物是指通过基 因工程技术或化学合成方法制备 的，具有特定生物学活性的大分 子药物。
04 蛋白质、多肽类药物质量 控制现状与挑战
质量控制现状
蛋白质、多肽类药物质量控制标准不断完善
随着蛋白质、多肽类药物的广泛应用，各国药典和国际组织不断完善相关质量控制标准， 以确保药物的安全性和有效性。
质量控制技术不断进步

氨基酸、多肽及蛋白质类药物

适应缺氧环境，同时能延长小鼠寿命。
氨基酸药物 三、典型氨基酸药物
单一氨基酸药物
用于肝脏疾病的氨基酸 用于消化道疾病氨基酸 用于脑病的氨基酸
氨基酸药物 三、典型氨基酸药物
单一氨基酸药物
用左于旋肝多脏巴疾片病的氨基酸 用成于份消：化左道旋疾多病巴氨基酸 功能主治：用于帕金森病及帕金森综合征。 用于脑病的氨基酸
基本知识 一、蛋白质基本知识
动物
植物
微生物
生命 物质基础
人体
基本知识 一、蛋白质基本知识
蛋白质 功能
生物催化 结构功能 运动收缩 运输功能 代谢调节 保护防御
其他功能
基本知识
定氮法
一、蛋白质基本知识
多数蛋白质含氮量相对 固定，约为16%，这是 蛋白质的一个重要特点。 因为氮元素容易通过凯 氏定氮法进行测定，故 蛋白质的含量可以由氮 的含量乘以6.25 （100/16）计算得到。
基本知识 三、多肽基本知识
多肽是α－氨基酸以肽键连
多 肽
接在一起而形成的化合物， 它也是蛋白质水解的中间产 物。
肽与蛋白质
02
氨基酸类药物
氨基酸药物 一、氨基酸药物分类
治疗消化道疾病 治疗肝病 治疗脑及神经系统疾病 用于肿瘤治疗 其他氨基酸药物
氨基酸药物 二、氨基酸药物生产
水解法
以毛发、血粉及废蚕丝等为原料，通过酸、碱或 蛋白水解酶水解成氨基酸混合物，经分离纯化获 得各种药用氨基酸的方法称为水解法。 分离、精制和结晶 胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸等
氨基酸药物 二、氨基酸药物生产
水解法 发酵法 化学合成法 酶合成法
酶合成法是以化学合成法配 制基质，利用酶促反应（即 酶的水解、裂解、合成作用） 直接制备各种氨基酸。 特别是固定化酶和固定细胞 等技术的迅速发展，解决了 酶合成法中较为突出的缺点， 从而促进了在生产实际中的 应用。

蛋白质、多肽类药物质量控制

杂质来源：不稳定氨 基酸，高温灭菌，生 产工艺差距。
2.2 分子量与分子量分布
2.2.1
分子排阻色谱
原理 • 多孔凝胶为固定相，流动 相中组份分子量大的先流 出，分子量小的后流出。
优点 • 最简单，样品量少，条件 温和，设备简单。
缺点 • pH6-8范围内线性关系良 好，极端pH蛋白质变性， 误差5%左右。
甲酰等）反应，再分离检测。
优点：灵敏度高，分辨率 高，普通HPLC即可分析。
番外篇——氨基酸类药物的有关物质 研究
目前《中国药典》 2015年版对于氨基 酸类制剂的杂质控制 是测定“其他氨基酸 ”，采用TLC法喷茚 三酮试液显色。
其他杂质如何控制？
难点：种类多，分子 量小，弱紫外吸收， 两性电解质，溶解性 差异大。
《中国药典》2015年版四部通则3405肽图检查 法
第一法 胰蛋白酶裂解——反相高效液相色谱 法
– 供试品和对照品用胰蛋白酶恒温水解，终止反应后， 离心取上清。液相C18或C8柱，0.1%三氟乙酸的水和 0.1%三氟乙酸的乙腈梯度淋洗，检测波长214nm。
第二法 溴化氰裂解——SDS聚丙烯酰胺凝胶
3.1 凯氏定氮法
适用 0.2～2.0mg氮，用于标 范围 准蛋白含量的准确测定。
优点
范围广泛，重现性好， 误差±2%
缺点
灵敏度低，费时，测定 结果偏高。
3.2 福林酚法
原理：在碱性条件下， 蛋白质与铜作用生成络 合物，蛋白质中的酪氨 酸和苯丙氨酸残基将 FolIn试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐中六价钨还原 成深蓝色混合物。在 650nm处的吸光度与蛋 白质含量成正比。
供电试泳品图谱与对 事实是基本做
照品图谱进行比 较，即得。
不出来一样的
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下丘脑激素
甲状腺激素 胰岛激素 胃肠道激素
胸腺激素
表皮生长因子（EGF），转移因子（TF）， ），转移因子 （2）多肽类细胞生 表皮生长因子（EGF），转移因子（TF）， 心钠素（ANP）等。 长调节因子 心钠素（ANP） 骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、 （3）含有多肽成分 骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、 的其它生化药物 脑氨肽、蜂毒、蛇毒、胚胎素 胚胎素、 助应素、 脑氨肽、蜂毒、蛇毒 胚胎素、 助应素、 神经营养素、胎盘提取物、 提取物、 神经营养素、胎盘提取物、花粉 提取物、 脾水解物、肝水解物、心脏激素等。 脾水解物、肝水解物、心脏激素等。
二、多肽与蛋白质类药物的制造方法
蛋白质与多肽类药物的提取分离与纯化法 多肽与蛋白质的化学合成法 基因工程法
（ 一） 蛋白质药物
原料选择
发 酵 沉 淀
变性 复性
生物 组织 破碎 提取
上清液
蛋白质纯化 纯度 活性鉴定
合格 不合格
精品
1、原料选择
2、提取
3、分离纯化
纯化 根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。 根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。
1963年 固相合成（1963年R.B.Merrifield 创立，并因此获1984年获诺贝尔化学奖） 创立，并因此获1984年获诺贝尔化学奖） 1984年获诺贝尔化学奖
→将氨基酸的C-末端固定在不溶性树脂上，然后将此树脂 将氨基酸的C 末端固定在不溶性树脂上， 上几次缩合氨基酸，延长肽链，合成蛋白质。 上几次缩合氨基酸，延长肽链，合成蛋白质。
例如：人胰岛素（Insulin） 例如：人胰岛素
B30 A8 ;A10 ;B30 B28 ;B29 B28 A21 ;B31 ;B32 B30去除；B29修饰
猪胰岛素 牛胰岛素 赖脯人胰岛素（礼来公司、速效Ins,lispro） 赖脯人胰岛素（礼来公司、速效 ） 诺和诺德公司、速效Ins 门冬胰岛素 （诺和诺德公司、速效 ,aspart） ） 安万特公司、 甘精胰岛素 (安万特公司、长效 安万特公司 长效Ins,glargine) 诺和诺德公司、 地特胰岛素 (诺和诺德公司、长效 ） 诺和诺德公司 长效Ins）
(2)各种分离纯化方法的使用程序 (2)各种分离纯化方法的使用程序
原则： 原则：相同性质的纯化方法一般不重 复使用。 复使用。纯化方法顺序先后的安排上 要考虑到有利于减少工序，提高效率。 要考虑到有利于减少工序，提高效率。
(3)分离纯化后期的保护性措施 (3)分离纯化后期的保护性措施 (4)对每一步骤方法的优势进行综合评价 (4)对每一步骤方法的优势进行综合评价
（二）蛋白质类药物 1、发展: 发展: 分类： 2、分类：
蛋白质激素、血浆蛋白质、 蛋白质激素、血浆蛋白质、蛋白质类细胞生长调节 因子、粘蛋白、胶原蛋白、碱性蛋白质、蛋白酶抑制剂、 因子、粘蛋白、胶原蛋白、碱性蛋白质、蛋白酶抑制剂、 凝集素
蛋白质激素 垂体蛋白质激素
促性腺激素
胰岛素及其他 蛋白质激素 血浆蛋白质
4、多肽合成的主要步骤
氨基的保护和羧基的活化 羧基的保护和氨基的活化 接肽和去保护基
5、基团保护： 基团保护： 保护基：接肽时起保护作用， 保护基：接肽时起保护作用，接肽后除去 氨基保护剂： 氨基保护剂： 苄氧羰基——强酸脱除 苄氧羰基 强酸脱除 叔丁氧羰基（BOC） 三氟乙酸（ 叔丁氧羰基（BOC）——三氟乙酸（TFA）脱除 三氟乙酸 TFA） 芴甲氧羰基（Fmoc）——碱脱除 9-芴甲氧羰基（Fmoc）——碱脱除 羧基保护剂 无水乙醇或甲醇在盐酸存在下酯化，使羧基接上烷基——常 无水乙醇或甲醇在盐酸存在下酯化，使羧基接上烷基 常 温下氢氧化钠皂化法脱除 其他功能基团的保护剂
1953年 年
1963年 年 1965年 年
2、合成原理：是一个重复添加AA的过程，一般自C端向N端合成。 合成原理：是一个重复添加AA的过程，一般自C端向N端合成。 AA的过程
合成方法： 3、合成方法：
液相合成
→保护氨基、活化羧基的方法 保护氨基、
具体的方法：阶梯伸长法（小肽合成）、片段缩合法（ 具体的方法：阶梯伸长法（小肽合成）、片段缩合法（小肽缩 ）、片段缩合法 合成大肽） 合成大肽）
第二节
多肽与蛋白质类药物
一、概
（一）多肽类药物
1、 发 展
1950s 1960s
述
1970s
1990s
2、多肽类药物的分类 、
多肽激素 多肽类生长因子 含多肽成分的其他生化药物
（1）多肽激素 ）
垂体多肽激素 促皮质素（ACTH）、促黑激素（MSH）、脂肪 促皮质素（ACTH）、促黑激素（MSH）、脂肪 ）、促黑激素 ）、 水解激素（LPH）、催产素（OT）、 ）、催产素 ）、加压素 水解激素（LPH）、催产素（OT）、加压素 AVP） （AVP）等 促甲状腺激素释放激素（TRH）、生长素抑制 促甲状腺激素释放激素（TRH）、生长素抑制 ）、 激素（GRIF）、促性腺激素释放激素（LHRH） ）、促性腺激素释放激素 激素（GRIF）、促性腺激素释放激素（LHRH） 甲状旁腺激素（PTH）、降钙素（CT） 甲状旁腺激素（PTH）、降钙素（CT） ）、降钙素 胰高血糖素 胰解痉多肽 胃泌素、胆囊收缩素－促胰酶素（CCK-PZ）、 胃泌素、胆囊收缩素－促胰酶素（CCK-PZ）、 肠泌素、 活性肽（VIP）、 ）、抑胃素 肠泌素、肠血管 活性肽（VIP）、抑胃素 GIP）、缓激肽、 ）、缓激肽 （GIP）、缓激肽、P物质 胸腺素、胸腺肽、 胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子
多肽的固相合成(Fmoc保护法) (Fmoc保护法 6、多肽的固相合成(Fmoc保护法)
（1978年改进的方法，避免了强酸处理） 1978年改进的方法，避免了强酸处理） 年改进的方法
（三）基因工程法 主要程序： 主要程序：
获得目的基因 → 组建重组质粒 → 构建基因 工程（或细胞） 工程（或细胞）→ 培养工程菌 → 目的蛋白的分 离与纯化 → 除菌过滤 → 半成品检定 → 成品 检定 → 包装
蛋白质在溶剂系统中分配不同进行纯化： （7）蛋白质在溶剂系统中分配不同进行纯化： 逆流分流技术（萃取法） 逆流分流技术（萃取法） 蛋白质的选择性吸附的性质进行纯化： （8）蛋白质的选择性吸附的性质进行纯化： 吸附法 （9）蛋白质的其他特殊性质进行纯化 如温度、酸碱、金属离子、络合剂、 如温度、酸碱、金属离子、络合剂、蛋白质沉淀 剂、SOD酶、pH值 SOD酶 pH值
2、生产工艺
捣碎、提取 生理盐水 胸腺 绞碎→ 胸腺碎块 [ ] → 提取液（组分1 ） 加热去杂蛋白]， 15 − [ 80℃、 min → 上清液（组分 2） [ → 丙酮粉（组分3） 沉淀]丙酮，10℃ 分段盐析 ] p [ H 7.0 0→ 上清液（组分4） 磷酸盐缓冲液、硫酸铵、饱和度 .25 分段盐析 ]硫酸铵，饱和度 0. 超滤 ]10 mmol / LTris HCl缓冲溶液 [ 50 → 盐析物 [ − → 超滤液 脱盐、干燥 、S [ ]ephadexG− 25→ 胸腺素（组分5）
3D Structure of Insulin
胰岛素二聚体（ 胰岛素二聚体（dimer） ）
胰岛素六聚体（ 胰岛素六聚体（hexamer ）
三、重要的多肽与蛋白质类药物的制造
（一）多肽类药物 胸腺素（thymocin) 胸腺素
结构与性质 工艺过程 控制要点
1、结构与性质
胸腺素组分5是由80℃热稳定的40～50种多肽组成的混合物， 胸腺素组分5是由80℃热稳定的40～50种多肽组成的混合物，分子 80℃热稳定的40 种多肽组成的混合物 量在1000 15000之间 pI为3.5～9.5。 1000～ 之间， 量在1000～15000之间，pI为3.5～9.5。
等电点的变化：蛋白质结合了较多的正电荷，pI↑， 等电点的变化：蛋白质结合了较多的正电荷，pI↑， 蛋白质结合了较多的负电荷， 蛋白质结合了较多的负电荷，pI↓， pH值至pI的两侧除杂蛋白 值至pI 调pH值至pI的两侧除杂蛋白
(2)蛋白质分子形状和大小其 蛋白质分子形状和大小的不同进行纯化 方法有 凝胶过滤法 超滤法 离心法 透析法 蛋白质的溶解度不同进行纯化，其方法有： （3）蛋白质的溶解度不同进行纯化，其方法有： 盐溶与盐析法 结晶法 低温有机溶剂沉淀法
生长素（GH），催乳激素（PRL），促甲状 生长素（GH），催乳激素（PRL），促甲状 ），催乳激素 ）， 腺素（TSH），促黄体生成激素（LH）， ），促黄体生成激素 ），促 腺素（TSH），促黄体生成激素（LH），促 卵泡激素（FSH）。 卵泡激素（FSH）。 人绒毛膜促性腺激素（HCG）， ），绝经尿促性 人绒毛膜促性腺激素（HCG），绝经尿促性 腺激素（HMG）， ），血清性促性腺激素 腺激素（HMG），血清性促性腺激素 SGH）。 （SGH）。 胰岛素，胰抗脂肝素，松弛素，尿抑胃素。 胰岛素，胰抗脂肝素，松弛素，尿抑胃素。 白蛋白，纤维蛋白溶酶原， 白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血浆纤维结合 蛋白（FN） 免疫丙种球蛋白， 蛋白（FN）,免疫丙种球蛋白，抗淋巴细胞 免疫球蛋白，Veil’ 病免疫球蛋白， 免疫球蛋白，Veil’s病免疫球蛋白，抗－ 免疫球蛋白， HBs免疫球蛋白 免疫球蛋白， D免疫球蛋白，抗－HBs免疫球蛋白，抗血 友病球蛋白，纤维蛋白原，抗凝血酶Ⅲ 友病球蛋白，纤维蛋白原，抗凝血酶Ⅲ， 凝血因子Ⅷ 凝血因子Ⅸ 凝血因子Ⅷ，凝血因子Ⅸ。
每一个分离纯化步骤方法的好坏， 每一个分离纯化步骤方法的好坏，除了从分 辨本领和重现性二方面考虑外， 辨本领和重现性二方面考虑外，还注意方法本身 的回收率的高低。 的回收率的高低。
5、纯化方法选择指南
（二）多肽与蛋白质的化学合成
1、发展
• Du.Vigneaud等合成催产素 等合成催产素 等合成 • （oxytocin,OXT ，9AA单链肽） 单链肽） 单链肽 • 合成促肾上腺皮质激素 • （ACTH，39AA单链肽） ， 单链肽） 单链肽 • 中国科学家合成了胰岛素 • （Insulin，51AA双链肽） ， 双链肽） 双链肽