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第3章 多肽与蛋白质类药物

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多肽与蛋白质类药物

多肽与蛋白质类药物
A. 许多活性蛋白质、多肽都是由无活性的蛋白质前体，经 过酶的加工剪切转化而来的有共同的来源，相似的结构 ，保留着若干彼此所特有的生物活性。研究活性多肽结 构与功能的关系及活性多肽之间结构的异同与其活性的 关系，将有助于设计和研制新的活性多肽药物。
B. 对蛋白质类药物进行结构修饰
多肽、蛋白质类药物分类
3.3.1 反相高效液相色谱
3.3.1 反相高效液相色谱
分离机理：
①用C4～C8烷基作配基，将配基键合在固定基质上作为固定相 ，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流 动相（流动相极性大于固定相）。
②蛋白质分子中既有亲水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH 等），也有疏水性基团（如苯环、-CH3、-CH2和-CH等）。
理论上，每公顷红花田可生产出1公斤人胰岛素原料药。
3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法
加拿大渥太华大学生物技术研究中心的科研人员也利 用另两种高产作物——烟草和水稻植株生产出了一种 名为“胰岛素样生长因子”(ILGF)的新型降血糖药物 。
据称，ILGF的降糖效果甚至优于常规口服降糖药。 如果ILGF能通过临床试验并成功上市，或将成为前景
3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法
加拿大SembioSys生物工程公司利用北美洲普遍栽培的高 产油料作物——红花作为转基因植物“平台”，成功生 产出“红花子来源人胰岛素”，
该胰岛素顺利通过动物实验与Ⅰ～Ⅱ期临床试验，其药 代动力学与药效学试验结果与美国礼来利用大肠杆菌表 述胰岛素基因生产的重组DNA人胰岛素基本一样。
多肽和蛋白质的物化性质
4. 变性 ➢ 天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下，
其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生 物学活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性， 称之为蛋白质的变性作用(denaturation)。 ➢ 变性蛋白质和天然蛋白质最明显的区别是溶解度降低

重要生物制药制造工艺PPT课件

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2、生产工艺
（1）提取法
（2）发酵法
原料
斜面培养基
麦芽 琼脂 淀粉糖化液
1kg 2.1%
玉米粉
玉米浆
NaNO3 KH2PO4 MgSO4 KCl
FeSO4
种子培养基
2% 2% 0.5% 0.3% 0.1% 0.05% 0.05% 0.001%
发酵培养基
2% 2% 0.5% 0.3% 0.1% 0.05% 0.05% 0.001%
硫酸乙 酰肝素
透明质酸
硫酸角 质素
粘多糖的连接方式
1.在木糖和丝氨酸之间的一个 O-糖苷键 2.在 N-乙酰氨基半乳糖与丝氨酸（或苏氨 酸）羟基之间的一个 O-糖苷键 3.在 N-乙酰氨基葡萄糖和天冬酰胺基之间 的一个 N-氨基糖残基的键
多糖的结构
四级结构 三级结构 二级结构 一级结构
多糖的构效关系
江西大茅制药有限责任 公司
中国中医科学院实验药 厂 沈阳双鼎制药有限公司
保定三九济世生物药业 有限公司
福州海王金象中药制药 有限公司
上海复星朝晖药业有限公司 天津华隆医药保健品有限公 司 湖南兰靖茯苓高科技开发有 限公司
产品类别
中药 化学药品
中药
中药 中药 中药
化学药 化学药 中药 中药
适应症
恶性肿瘤的辅助治疗
1糖类药物 的分类
单糖
低聚糖 糖的衍生物 多糖
葡萄糖、果糖、 氨基葡萄糖、 维生素C等
蔗糖、麦芽糖、 乳糖、乳果糖
6-磷酸葡萄糖、 1,6-二磷酸葡萄糖
磷酸肌醇
香菇多糖、 肝素 等
2、多糖的分类（按照其来源不同来分）
Text1
Text3
多糖在细胞内的存在方式

多肽和蛋白质药物口服吸收机制及策略的研究进展

多肽和蛋白质药物口服吸收机制及策略的研究进展

在研究方法上，多肽和蛋白质药物口服吸收机制及策略的分析主要依赖于体 外实验、体内实验和数学模型等手段。体外实验包括对药物理化性质的分析、药 物在模拟胃肠道环境中的稳定性评估等；体内实验包括药代动力学分析、药物分 布和排泄等；数学模型则可以对药物吸收过程中的各种因素进行量化分析，有助 于深入理解吸收机制。
（1）调节细胞功能：多肽类药物可以调节细胞生长、分化、凋亡等过程， 从而达到治疗疾病的目的。
（2）抑制酶活性：一些多肽类药物可以抑制特定酶的活性，从而降低疾病 的发生和发展。
（3）调节免疫反应：多肽类药物可以调节免疫反应，包括细胞免疫和体液 免疫，从而达到治疗免疫相关疾病的目的。
3、多肽类药物的临床应用
在吸收机制分析方面，研究者们已明确了多种吸收途径，如淋巴途径、细胞 旁路途径和跨细胞途径等。这些途径在药物的吸收速度和程度上有着不同的影响。 例如，淋巴途径可以提高药物的生物利用度，而细胞旁路途径则可以迅速地将药 物分布到组织中。对于跨细胞途径，研究者们正在深入探讨其具体机制，以便为 药物设计和优化提供更多指导。
为确保口服蛋白多肽类药物制剂的稳定性，需在制剂制备过程中建立严格的 质量控制体系。一方面，要原料药的选取，保证原料药的质量和稳定性；另一方 面，要采用合适的制剂工艺和稳定剂，以延缓药物在储存和使用过程中的降解。 同时，应重视杂质的排除，防止其对药物疗效和安全性的影响。
临床试验是评价口服蛋白多肽类药物制剂疗效和安全性的关键环节。应遵循 国际通用的GCP（药物临床试验质量管理规范）原则，设立合理的试验方案，明 确评价标准，并采用适当的统计学方法进行分析。在试验过程中，要确保受试者 的权益和安全，同时密切不良反应的发生情况，以便对药物进行全面评估。
多肽类药物可根据其来源、功能和结构进行分类。根据来源，多肽类药物可 分为天然多肽、合成多肽和重组多肽。根据功能，多肽类药物可分为细胞因子抑 制剂、神经递质抑制剂、酶抑制剂等。根据结构，多肽类药物可分为环状多肽、 线状多肽和嵌合多肽。

多肽、蛋白质类药物给药系统

多肽、蛋白质类药物给药系统

多肽、蛋白质类药物给药系统摘要随着重组DNA技术的发展．基因工程肽和蛋白质药物的大规模生产已成现实，这类药物应用于临床的数量越来越多。

与传统的化学合成约物相比，其优点受到了广泛的关注，即与体内正常生理物质十分接近，更易为机体吸收，其药理活性高、针对性强、毒性低。

但由丁多肽、蛋门质类约物(1)分子质量大、稳定性高、易被胃肠道中的的蛋白水解酶降解；(2)生物半衰期短、生物膜渗透性差、生物利用度不高、不易通过生物屏障等，故其给药系统的研究一直足约剂学领域的一个热点。

许多学者曾尝试对肽类、蛋白质类约物进衍化学修饰、制成前体药物、应用吸收促进剂、使用酶抑制刺、采用离子电渗法皮肤给药以及设计各种给药系统解决上述问题．此炎药物一般注射给药，基本剂型足注射剂和冻粉针剂，常需频繁注射，患者顺从性差，且加重了患者的身体、心理和经济负担。

近年来，脂质体、微球、纳米粒等制剂新技术发展迅述歼逐渐完善，国内外学者将其广泛应用于多肽、蛋白质炎约物给约系统(drug deiivery system，DDS)的研究中，为此炎药物的临床应用铺平了道路。

本文就多肽、蛋白质类约物的给药系统及新技术进行综述。

主要介绍注射给药系统和非注射给约系统，及其下属几个分支。

重点介绍非注射给药系统。

关键字给药系统注射非注射l 新型注射给药系统1.1 控释微球制剂为了达到多肽、蛋白质类药物控制释放，可将其制成生物可降解的微球制剂。

目前已经实际应用的生物可降解材料主要有淀粉、明胶、葡糖糖、清蛋白、聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PIGA)、聚邻酯、聚内酯和聚酐等；其中PLGA最为常用，改变乳酸乙醇酸的比例或相对分子质量，可得到不同降解时间的微球。

PLGA 微球相对于常规注射剂具有如下优点：(1)释药周期长，避免频繁给药；(2)使用安全；(3)药理作用增强；(4)避免发生明显的不良反应；(5)生物利用度显著提高。

1.2 脉冲式给药系统普通注射剂(疫苗、类毒素)一般至少接种3次，才能确保免疫效果，血药浓度波动大，且不能保证在疾病发作时相应的血药浓度。

13-2多肽与蛋白质类药物

13-2多肽与蛋白质类药物

下丘脑激素
甲状腺激素 胰岛激素 胃肠道激素
胸腺激素
表皮生长因子（EGF），转移因子（TF）， ），转移因子 （2）多肽类细胞生 表皮生长因子（EGF），转移因子（TF）， 心钠素（ANP）等。 长调节因子 心钠素（ANP） 骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、 （3）含有多肽成分 骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、 的其它生化药物 脑氨肽、蜂毒、蛇毒、胚胎素 胚胎素、 助应素、 脑氨肽、蜂毒、蛇毒 胚胎素、 助应素、 神经营养素、胎盘提取物、 提取物、 神经营养素、胎盘提取物、花粉 提取物、 脾水解物、肝水解物、心脏激素等。 脾水解物、肝水解物、心脏激素等。
二、多肽与蛋白质类药物的制造方法
蛋白质与多肽类药物的提取分离与纯化法 多肽与蛋白质的化学合成法 基因工程法
（ 一） 蛋白质药物
原料选择
发 酵 沉 淀
变性 复性
生物 组织 破碎 提取
上清液
蛋白质纯化 纯度 活性鉴定
合格 不合格
精品
1、原料选择
2、提取
3、分离纯化
纯化 根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。 根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。
1963年 固相合成（1963年R.B.Merrifield 创立，并因此获1984年获诺贝尔化学奖） 创立，并因此获1984年获诺贝尔化学奖） 1984年获诺贝尔化学奖
→将氨基酸的C-末端固定在不溶性树脂上，然后将此树脂 将氨基酸的C 末端固定在不溶性树脂上， 上几次缩合氨基酸，延长肽链，合成蛋白质。 上几次缩合氨基酸，延长肽链，合成蛋白质。
例如：人胰岛素（Insulin） 例如：人胰岛素
B30 A8 ;A10 ;B30 B28 ;B29 B28 A21 ;B31 ;B32 B30去除；B29修饰

多肽与蛋白质类药物-氨基酸多肽蛋白质

多肽与蛋白质类药物-氨基酸多肽蛋白质

二.多肽与蛋白质类药物的制造方法


3.分离纯化
多肽及蛋白质的分离纯化是将提取液中的目的蛋 白质与其他非蛋白质杂质及各种不同蛋白质分离 开来的过程. 常用的分离纯化方法有: (1) 根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质 在等电点时蛋白质性质比较稳定,其物理性质如 导电性,溶解度,黏度,渗透压等皆最小,因此可利用 蛋白质等电点时溶解度最小的性质来制备蛋白质.
不十分清楚，从活性肽或细胞生长调节因子的角度去研究 它们的物质基础和作用机制，预计可获得成效
主要多肽类药物
1．多肽激素 ① 垂体多肽激素： 促皮质素(ACTH),促黑激素(MSH),催产素(OT) ② 下丘脑激素： 促甲状腺激素释放激素（TRH），生长素抑制激素（GRIF） ③ 甲状腺激素： 甲状旁腺激素（PTH），降钙素（CT）。 ④ 胰岛激素： 胰高血糖素γ，胰解痉多肽γ。 ⑤胃肠胃道激素： 胃泌素，胆囊收缩素一促胰激素（CCK-PZ）,缓激肽 ⑥ 胸腺激素： 胸腺素、胸腺肽, 胸腺血清因子
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（一）蛋白类药物的分类

6．碱性蛋白质
硫酸鱼精蛋白，存在于鱼类成熟的精子中，强碱
性。

7．蛋白酶抑制剂 胰蛋白酶抑制剂，亦称抑肽酶。

8．植物凝集素 PHA、ConA。
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（二）蛋白类药物作用方式

已从生化药物对机体各系统和细胞生长的调节 扩展到被动免疫、替代疗法、抗凝血剂以及蛋 白酶的抑制物等多种领域
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（三）应用基因工程技术制备重要的 蛋白类药物

已实现产品工业化的有几十种，并正从微生物 和动物细胞的表达转向基因动植物的表达。
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（四）蛋白质工程技术的应用

多肽与蛋白质类药物 ppt课件

疾病发病机理的揭示, 对体内各种酶, 辅酶, 生长代谢调 节因子的深入认识, 可以针对性开展多肽和蛋白质类药物 的研发。
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多肽和蛋白质类药物研发技术与方向
1) 化学合成方法
2) 改造生物活性多肽及现有多肽药物
3) 提高活性多肽及现有多肽药物档次
4) 针对具生物活性的多肽天然产物研发
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三、多肽及蛋白质类药物的生产方法
（3）胰岛素及其它激素 生长素释放抑制因子，是一种人 脑激素，治疗肢端肥大症， 50万个羊脑提取5mg. 工程菌：7.5L培养液可得到5mg.
肢端肥大症
2.血浆蛋白质
白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血纤蛋白等
3.蛋白质类细胞生长调节因子 干扰素α、 β、 γ（IDN）,白细胞介素（1~16）（IL）神经生 长因子等
IFN：干扰素 IL：白细胞介素 hGH：生长激素 FDGF：成纤维细胞衍化生长因子
CSF：克隆刺激因子 EPO：红细胞生成素
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二、多肽和蛋白质类药物特点
1) 基本原料简单易得 多肽和蛋白质类药物主要以20种天然氨基酸为基本结构
单元依序连接而得,代谢物氨基酸为人体生长的基本营养成分, 可通过农产品发酵而制备。
t-PA(tissue-plasminogen activator)译成中文为组织纤溶 酶原激活剂，人体内自然存在，同时也是临床上用于急性心 肌梗死的一种生物蛋白药物，有18个半胱氨酸，9对二硫键
1953年，人类用化学合成法合成了有生物活性的多
肽----催产素。
（2）天然动植物及重组动植物提取法
通过生化工程技术，从天然动植物中分离纯化。由 于天然动植物中的有效成分含量过低，杂质太多，引起人 们对重组动植物的重视。
重组动植物只通过基因工程技术手段，将药物基因 或能对药物基因起调节作用的基因转导入动植物细胞，以 提高动植物合成药用成分的能力，再经过生化分离，制得 生物制品。

蛋白质与多肽类药物的研究及应用

蛋白质与多肽类药物 的研究及应用
昆明医科大学基础医学院 生物化学与分子生物学系 武静
目前市场上的主流药物
小分子化合物药物
优点：相对分子量小，易透过细胞膜，物化性
质明确，稳定及热不敏感，无抗原性，直接化学 合成，价格低廉，口服给药等 缺点：副作用大，易引起抗，耐药性等
生物药物 疫苗 小分子
多肽和蛋白质
• 进入 20 世纪 90 年代，随着 PCR 技术、抗体库 技术和转基因技术的发展，治疗性单抗最终实
现全人源化，使抗体最终可应用于临床治疗 。
全人抗体
基于噬菌体可把抗体片段，再经体外加工可形成有功 能的完全人抗体。 全人抗体成功的例子：Humira：abbott 公司（雅 培）抗TNF 全人单抗，用于治疗关节炎。
人－鼠嵌合抗体
用人IgG 的恒定区取代小鼠IgG 的恒定区，保留鼠 单抗的可变区序列，形成一个人 - 鼠杂合的抗体。 其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性， 却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另 外，它还具有人抗体的效应功能，如补体固定、抗 体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）等。 嵌 合 抗 体 成 功 的 例 子 ： Rituxan ： Idec pharmaceutical/Genentech 的小鼠抗CD20 抗体， 含人IgG1 恒定区，用于治疗B 淋巴瘤。它的抗淋巴 瘤作用主要可能来自于补体作用、ADCC 和诱导肿 瘤细胞凋亡。
免疫球蛋白水解片段
Fab Fab
木瓜蛋白酶 Fc
木瓜蛋白酶
胃蛋白酶 胃蛋白酶
F(ab’)2
pFc’
单链抗体scFv
• 通过基因工程设计，只编码抗体的重链可变区以 及轻（VH+VL），通过一段多肽连接，形成单链 抗体的可变区（scFv）。连接肽将VH 的C 端与VL 的N 端连接，反之也可以。它保留了抗体与抗原 的特异性，可以使用大肠杆菌表达。穿透力强但 往往亲和力下降。分子量~25KD。 • 现在FDA 没有批准一个单链抗体（scFv）上市， 但是有10 多个项目在临床试验。 例如： Pexelizumab, 为 Alexion Pharmaceutical 公 司研制，在2004 年进入临床I 期，正在临床III 期， 主要用于治疗冠状动脉疾病。

第1篇 第3-4章 人体、动物来源生物药物生产


白蛋白制备的工艺路线
工艺特点：
络合(利凡诺沉淀)：血浆在搅拌下用NaHCO3调节pH至 8.6，加入等体积的2％利凡诺溶液，充分搅拌后静置 2-4h，分离上清与络合物沉淀。
解离：在沉淀中加灭菌蒸馏水。用0.5mol/L HCl调节 pH至弱酸性，加NaCl至0.15％-0.2％搅拌下进行解 离。
性失活，易从血液循环中清除，单独作为药物 载体时缓释时间较短。
PEG修饰人血清白蛋白 PEG(聚乙二醇)与蛋白质有良好的相容
性， PEG修饰后可以增加蛋白质的稳定 性，延长血浆半衰期，降低免疫原性和 抗原性，降低毒副作用和提高膜的渗透 性（Francesco et al, 2005）。
PEG的末端羟基活性很差，在温和的环境中很难与蛋 白质进行偶联，需要使用活化剂，可以使用的活化剂 有：氰尿酰胺、羧基二咪唑、环已基碳二亚胺、N-羟 基琥珀亚胺、2,4,5-三氯苯基氯甲酸酯（Roberts et al, 2002）
加热去杂蛋白：充分解离后，65℃恒温1h，离心分离 出上清液。
热处理(60℃，10h)：灭活病毒。
检验：冻干品为白色硫松物体。白蛋白含量占95％以上， 水分＜1％，水溶后pH为6.6—7.2，硫酸铵＜0.01％， 细菌学和热原质检测合格。
外源白蛋白的不足之处： 白蛋白在人体内降解速度较快，稳定性差，易变
⑸蛋白酶抑制物类
在蛋白酶抑制物中，α1抗胰蛋白酶(α- 1 AT)含量最高，它能保护机体正常细胞不 受蛋白酶的破坏和损伤，能协助控制感染 和炎症，维持机体内环境的稳定。
许多蛋白酶抑制物在体内的分工协作，维持 了机体内环境的稳定。
⒊ 人体液细胞中的活性物质
人体液细胞包括：红细胞、白 细胞、淋少含白细胞的压积红细胞 冰冻贮藏红细胞

蛋白质、多肽类药物质量控制


可能导致产品质量存在差异，需要加强批次间一致性的控制。
03
稳定性差
蛋白质、多肽类药物容易受到温度、湿度、光照等因素的影响，导致其
稳定性较差，需要加强存储和使用过程中的保护措施。
未来发展方向
加强创新研究
加强国际合作与交流
通过加强创新研究，开发更加精准、 高效的质量控制技术和方法，提高蛋 白质、多肽类药物的质量控制水平。
可以揭示蛋白质的三维结构，对于理解蛋白质功能和药物设计具有重要意义。
纯度测定
总结词
纯度测定是评估蛋白质、多肽类药物质量的重要指标，主要通过色谱技术、电泳技术和质谱技术等方法进行。
详细描述
纯度测定是评估蛋白质、多肽类药物中目标成分的纯度和杂质的含量。色谱技术如凝胶电泳、高效液相色谱等可 以根据分子大小、电荷和疏水性等性质将目标成分与杂质分离。电泳技术则根据蛋白质、多肽的电荷和大小进行 分离。质谱技术可以用于鉴定和定量目标成分和杂质，具有高灵敏度和高分辨率的特点。
蛋白质、多肽类药物 质量控制
目录
CONTENTS
• 蛋白质、多肽类药物概述 • 蛋白质、多肽类药物质量控制标准 • 蛋白质、多肽类药物质量控制方法 • 蛋白质、多肽类药物质量控制现状与挑
战 • 新技术与新方法在蛋白质、多肽类药物概述
定义与分类
定义
蛋白质和多肽类药物是指通过基 因工程技术或化学合成方法制备 的，具有特定生物学活性的大分 子药物。
04 蛋白质、多肽类药物质量 控制现状与挑战
质量控制现状
蛋白质、多肽类药物质量控制标准不断完善
随着蛋白质、多肽类药物的广泛应用，各国药典和国际组织不断完善相关质量控制标准， 以确保药物的安全性和有效性。
质量控制技术不断进步
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1、流动相的组成
有A液和B液两种。 A液：疏水性浓盐水溶液，并含有缓冲液作用的盐以稳定pH值。常用

的A液为1.0～3.0mol/L(NH4)2SO4加0.01～0.05mol/L磷酸盐缓冲液；
B液：稀的缓冲液，浓度与A液中的缓冲作用的盐的浓度相等。常用的
B液为0 .01～0.05mol/L磷酸盐缓冲液。
Influence of Particle Size on the Separation effect
30µ m 5µ m 15µ m
应 用
最大优点：分离度最高；
最大缺点：容易使蛋白质变性失活。
例子：人的胶原蛋白I型α1和α2键的色谱分离
3.3.2 疏水相互作用色谱
概念：用适度疏水性的配基作固定相，以盐水体 系作流动相，用疏水作用来分离生物大分子化 合物的液相色谱法，叫疏水相互作用色谱(Hyd


3.1 多肽和蛋白质药物基本知识

基本概念 多肽类药物是以多肽激素和多肽细胞生长因子为主的
一大类内源性活性成分。
蛋白质药物包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节 因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白、蛋白酶抑 制剂等，其作用方式从对机体各系统和细胞生长的调 节，扩展到被动免疫、替代疗法和抗凝血等。
色谱条件
①固定相：常用C4～ C8链烃作为配基（键合在固体基质上）为 填料。孔径25～50 nm。 ②流动相： 水溶性有机溶剂（B液） （甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃） 洗脱能力增大 ＋水（A液） ＋强酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸 ）
加酸作用： ∵－SiOH == －SiO- ＋ H+
• 蛋白质易与—SiO- 结合很难洗脱，加酸抑制上述平衡向右离解。

3.1 多肽和蛋白质药物基本知识
细胞生长调节因子——在体内和体外对效
应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的
一类物质。
许多生长因子在靶细胞上有特异性受体，
仅微量就有较强的生理活性。
生物技术在该类中的应用

基因工程技术制造------胰岛素、干扰素、白介素、生 长素、EPO等实现了工业化，发展方向为转基因动植物
一般在常温或低于常温下操作。HIC中蛋白质的保留对温度较敏感。
①在HIபைடு நூலகம்体系中蛋白质处在活性状态， T↑使蛋白质的团状结构伸展，暴
露出更多的疏水基团，疏水作用增强，保留值增大。
（其他色谱，T↑保留增大）
② T↑传质加快，使保留减小。（对所有色谱均适用）
总之，在疏水色谱中，①比②大，∴ T↑，保留增大。
疏水作用色谱的应用
例如：基因重组人干扰素r是一种基因工程
产品，其粗品是7mol/L盐酸胍溶液。

干扰素在盐酸胍溶液中处于可逆性失活 状态。因盐浓度太高无法直接上其他柱 ，除去盐酸胍后干扰素又容易析出来。

若使用疏水作用色谱柱，将此样品直接 进样，既脱除了盐酸胍，又达到了复性 的效果。而且一步分离后，干扰素纯度 可达到90%。 IFN-r粗品的HIC分离

蛋白质分子扩散速度慢，不易透过半透膜，粘度大， 在分离提纯蛋白质过程中，可利用蛋白质的这一性质
除去小分子杂质——透析(dialysis)。
多肽和蛋白质的物化性质
4. 变性

天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下， 其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生 物学活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性， 称之为蛋白质的变性作用(denaturation)。

“疏溶剂化理论”：蛋白质与配基的结合是由于溶质分子
有一个减少其与水接触的非极性表面的倾向，它们在盐水
溶液中，两个非极性的表面趋向于避开水相而互相接触。 溶质和疏水配基的结合是伴随着它们非极性表面暴露在水 中的面积的多少而进行的。

蛋白质在盐水体系中，有一倾向产生：避开水相而吸附在 固定相上。∵生物物质界面自由能比水低，与表面自由能 低的固定相产生亲合力
分离机理：
①用C4～C8烷基作配基，将配基键合在固定基质上作为固定相 ，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流 动相（流动相极性大于固定相）。 ②蛋白质分子中既有亲水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH 等），也有疏水性基团（如苯环、-CH3、-CH2和-CH等）。
3.3.1 反相高效液相色谱
分离原理

在不同的介质中裂隙的伸展和收 缩程度不同，从而使疏水基团暴
OH OCH2CH3
露的多少也不同。

疏水色谱是利用盐水体系中样品
蛋 白 质
CH3
Ph
NH2 Ph COOH
组分的疏水基团和固定相的疏水
配基之间疏水作用力的不同而达
OH
到分离的目的。
蛋白质疏水基团分布示意图
配基和蛋白质分子之间的吸附推动力和样品组分的洗 脱机理 （即：溶质在色谱中的保留行为）：
• 减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。
色谱条件
③ 温度：常温 ④ 检测：用紫外检测器，检测波长280nm 和220nm。

280nm检测中含有含苯环的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的 蛋白质，一般蛋白质都含有苯环，所以280nm检测是普遍 使用的波长。

220nm主要检测肽键；所以所有蛋白质普遍适用。
色谱条件
⑤ 洗脱方式：梯度洗脱——逐渐增加洗脱强度。

蛋白质的分离一般就需要用梯度洗脱，否则有些蛋白质已 达到突跃会很快被洗脱下来，有些蛋白质还远离突跃区， 实际上无法被洗脱。

而有机小分子的反相色谱中未发现此种突跃现象。实际工
作中梯度洗脱时间约为20～60min，B液的变化速度约为每
分钟5%～15%。
1. 酸碱性 多肽是小分子，化学性质与氨基酸类似，含有 20个以上氨基酸残基的多肽与蛋白质没有明显 界限； 蛋白质是呈两性解离的电解质，通常在等电点 时，蛋白质的溶解度最小，不稳定，易于从溶 液中沉淀析出。 各种蛋白质分子都有自己的等电点。

多肽和蛋白质的物化性质
2. 离子结合

蛋白质存在两性，其表面带有一定量的电荷，
rophobic Interaction Chromatography,HIC)或
疏水作用色谱。
分离原理

在HIC中：固定相表面有疏水性基团，（如-CH2，CH3 ，-ph等）。

蛋白质分子是一个外部有亲水层包围，内部有疏水核的 具有四级结构的复杂体系。

蛋白质表面亲水性很强，但也有一些疏水性的基团，同 时团状的蛋白质还存在疏水基团较多的裂隙。

加拿大渥太华大学生物技术研究中心的科研人员也利
用另两种高产作物——烟草和水稻植株生产出了一种
名为“胰岛素样生长因子”(ILGF)的新型降血糖药物
。

据称，ILGF的降糖效果甚至优于常规口服降糖药。
如果ILGF能通过临床试验并成功上市，或将成为前景
可期的国际医药市场畅销产品。
3.3 多肽和蛋白质药物的分离
产油料作物——红花作为转基因植物“平台”，成功生
产出“红花子来源人胰岛素”，

该胰岛素顺利通过动物实验与Ⅰ～Ⅱ期临床试验，其药 代动力学与药效学试验结果与美国礼来利用大肠杆菌表 述胰岛素基因生产的重组DNA人胰岛素基本一样。

理论上，每公顷红花田可生产出1公斤人胰岛素原料药。
3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法
硬基质：主要是大孔径硅胶。 配基：是一些含氮和氧原子的中等疏水性基团； or是丁基、苯基这些疏水基团键合在一个亲水性表面。
色谱条件
主要有： a. 具有中等疏水性表面的填料；
b. 盐析性盐的水溶液为流动相；
c. 紫外检测器检测，检测波长220或280nm； d. 流动相pH值接近中性； e. 由高盐浓度到低盐浓度的梯度洗脱，梯度时间20～60 min； f. 常温或4℃下操作。
按来源分
生化药物——来源于动植物有机体 基因工程药物——来源于基因工程菌表达生产的 药物

习惯分法
多肽生化药物、细胞生长因子、抗体药物、抗菌 肽、酶类药物
生化药物
多肽类激素、多肽抗生素：消化道多肽、下丘脑 多肽、脑多肽、激肽等；动、植物蛋白。
酶类与辅酶类药物：蛋白水解酶类、凝血酶及抗 栓酶，辅酶Q10等。
蛋白质、多肽提取分离常用的方法：


沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、结晶等） 超滤法 膜分离法 离心分离法 凝胶过滤法 离子交换层析 疏水相互作用色谱 亲和层析等
基因工程药物分离与纯化的流程
3.3.1 反相高效液相色谱
3.3.1 反相高效液相色谱
3.3.1 反相高效液相色谱
Chapter 3 多肽与蛋白质类药物

1953年人工合成了第一个有生物活性的多肽——催产素 以后，20世纪50年代都集中于脑垂体所分泌的各种多 肽激素的研究。 60年代，研究的重点转移到控制脑垂体激素分泌的各种 多肽激素的研究。 70年代，神经肽的研究进入高潮。生物胚层的发育渊源 关系表明，很多脑活性肽也存在于肠胃组织中，从而推 动了肠胃激素研究的进展。
盐有两类。 盐析性盐：使蛋白质的构象稳定，会促进蛋白质自身间的疏水作用而

析出，or促进蛋白质与配基之间的疏水作用而保留在柱上。不失活， 溶解度减小。常用： (NH4)2SO4
盐溶性盐：提高蛋白质的水溶性，同时会使蛋白质变性。如硫氰酸盐
、盐酸胍等会。
1、流动相的组成
2、流动相的pH值：一般地pH 4～8 ；常选 pH 7左右。 3、温度

利用基因工程技术构建工程菌（细胞）进行生产 利用原核生物或简单的真核生物如酵母菌作为工 程菌（活细胞），通过将含有编码某蛋白或多肽的碱 基序列插入一段DNA载体（如质粒）中，并在工程菌
（或细胞）中表达，从而得到相应的多肽或蛋白质。