多糖的分离纯化及性质表征PPT课件

多糖的提取和纯化Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT多糖的提取和纯化→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥首先除去表面脂肪。

原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。

温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。

得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。

也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。

然后浓缩，再加入2－5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。

然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。

将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）。

干燥后可得粉末状的粗多糖。

微波辅助提取法：其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中[14]。

由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。

而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清[15]。

聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（％）。

超声辅助法：其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取[16]。

实验四、植物活性多糖的分离、纯化与鉴定第一部分多糖的提取、纯化【实验目的】1、了解多糖提取和纯化的一般方法。

2、学习多糖的定量测定方法。

【实验原理】多糖类物质是除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生物大分子。

早在60年代，人们就发现多糖复杂的生物活性和功能。

多糖是普遍存在于自然植物界中的由许多相同或不同的单糖以a •或B •糖昔键所组成的化合物，其分子量一般为数万甚至数百万，是构成生命活动四大基本物质之一，与维持生命功能密切相关。

大部分植物多糖不溶于冷水，在热水中呈粘液状，遇乙醇能沉淀。

多糖具有抗氧化性、抗病毒性、反互补特性[1],大量药理及临床研究表明，多糖类化合物是一种免疫调节剂，它具有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖作用，能激活免疫受体，提高机体的免疫功能，在用于癌症的辅助治疗中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等优点[2] o本实验采用常规法（即水溶醇沉法）从植物组织中提取出水溶性粗多糖，对提取得到的多糖进行分离纯化，除去色素及小分子杂质，并采用Sevage法除蛋白。

用蔥酮比色法测定多糖的含量。

多糖的纯化，就是将存在于粗多糖中的杂质去除而获得单一的多糖组分。

一般是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级。

常用的去除多糖中蛋白质的方法有：Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中Sevag方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿：戊醇或丁醇，以4： 1比例混合，加到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去。

本实验釆用Sevag法（氯仿：正丁醇=4： 1混合摇匀）进行脱蛋白,用DEAE •纤维素层析柱进行纯化，然后合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干，得多糖组分。

多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解，产生单糖，并迅速脱水生成醛糖衍生物，在这种强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物，该衍生物在波长490 nm处和一定浓度范围内，吸光度与糖浓度呈线性关系，釆用比色法对多糖含量进行测定。

一、多糖的分离和纯化多糖是极性极大的大分子化合物，提取时一般先将原料脱脂、脱色，然后用水、盐或稀碱水在不同温度下提取。

提取物浓缩后加沉淀剂(乙醇、丙酮等)离心沉淀，沉淀部分可反复多次离心沉淀，以除去部分水溶性色素等杂质。

1．除蛋白用水或稀碱提取的多糖常含有蛋白质，常用的除蛋白质的方法有Sevag 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法等。

前两种多用于微生物多糖，后者多用于植物多糖。

Sevag 法是经典的除蛋白质方法，复杂、费时，且样品损失较大。

冯建林等比较了Sevag 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、硫酸铵法及木瓜蛋白酶复合酶法除蛋白的效果，从蛋白残留量和多糖的得率两方面评价．认为三氯乙酸法最好，但三氯乙酸仍不能完全除去蛋白，建议三氯乙酸法和Sevag 法结合使用。

2．脱色多糖中常含有一些色素(游离色素或结合色素)，根据其不同性质采取不同的去除方法。

常用的脱色方法有离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法(纤维素、硅藻土、高岭土、活性炭等)。

D EA E一纤维素是目前最常用的脱色方法，通过离子交换柱不仅达到脱色目的，而且可以进行多糖的分离。

H2 O2：是一种氧化脱色剂，浓度不宜过高，宜在低温下进行，否则引起多糖的降解。

对于同时含有游离蛋白质和色素的多糖，可通过生成金属络合物的方法同时除去蛋白和色素，即加入费林试剂生成不溶性络合物，经分离后用阴离子交换树脂分解络合物。

吸附脱色法也常用，如通过活性炭、高岭土、硅藻土柱达到脱色的目的。

3．多糖的分级采用一般方法提取的多糖，通常是多糖的混合物，即是多分散性的，其不均一性表现在化学组成、聚合度、分子形状等的不同。

分级可以达到纯化的目的，可按分子大小和形状分级(如分级沉淀、超滤、分子筛、层析等)，也可按分子所带基团的性质分级(如按电荷性质分级的电泳、离子交换层析等)。

(1)分级沉淀利用分子大小和溶解度不同进行分离，常用的有两种方法，即有机溶剂沉淀法和季铵盐或硫酸铵法。

多糖的分离纯化及分析(总3页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--多糖的分离纯化及分析一、多糖的提取方法（一）溶剂提取法1、水提法水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法.多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂.用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70%左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置5h，多糖的质量分数和得率均较高.2、酸碱提法有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。

有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。

与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。

3、超临界流体萃取法超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术.（二）生物酶提取法酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。

此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。

（三）超声提取法超声波是一种高频率的机械波，其主要原理是利用超声波产生的“空化作用”对细胞膜的破坏，有利用植物有效成分的释放，而且超声波能形成强大的冲击波或高速射流，有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率，有助于溶质的扩散。

超声波提取与传统的提取方法相比，有提取效率高、时间短、耗能低等优点。

（四）微波提取微波是频率介于300MHz和300GHz之间的非电离电磁波，微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。