微生物多糖提取与纯化

微生物多糖的研究进展生命科学技术学院08级2班杜长蔓摘要: 就微生物多糖的种类，生物合成、提取与纯化、实现了工业化的微生物多糖及其应用进行了综述, 展望了微生物多糖开发利用的前景。

微生物多糖主要指大部分细菌、少量的真菌和藻类产生的多糖。

微生物多糖由于具有安全性高、副作用小、理化特性独特等优点而使其在食品和非食品工业备受关注,尤其在医药领域具有巨大的应用潜力。

微生物多糖在细胞内主要有三种存在形式: ①黏附在细胞表面上,即胞壁多糖; ②分泌到培养基中,即胞外多糖; ③构成微生物细胞的成分,即胞内多糖。

而其中的胞外多糖具有产生量大、易于与菌体分离、可通过深层发酵实现工业化生产。

一般微生物多糖的生产主要是利用淀粉为碳源,经过微生物的发酵进行生产,也有通过利用微生物产生的酶作用制成的。

能够产生微生物胞外多糖的微生物种类较多,但是真正有应用价值并已进行或接近工业化生产的仅十几种。

近几年,随着对微生物多糖研究的深入,世界上微生物多糖的产量和年增长量在10 %以上,而一些新兴多糖年增长量在30 %以上。

到目前为止,已大量投产的微生物胞外多糖有黄原胶(Xant han gum) 、结冷胶( Gellan gum) 、小核菌葡聚糖(Scleeroglucan) 、短梗霉多糖( Pullulan) 、热凝多糖(Curdlan) 等。

微生物多糖和植物多糖相比较具有以下优势:①生产周期短,不受季节、地域、病虫害等条件的限制; ②具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景; ③应用广泛,例如已作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域。

据估计,目前全世界微生物多糖年加工业产值可达80 亿左右。

关键词: 微生物多糖; 生物合成; 提取与纯化;开发应用0引言多糖是一种天然的大分子化合物，来源于动物、植物及微生物，在海藻、真菌及高等植物中尤为丰富。

它是由醛糖和（或）酮糖通过糖苷键连接成的聚合物，作为有机体必不可少的成分，同维持生命体机能密切相关，具有多种多样的生物学功能。

1.多糖的提取方法生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3大类。

多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。

动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，，多糖提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。

水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。

但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。

1．1．2酸提法为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。

如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH值下难以溶解，可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析体是指物质处于临界温度和临界压力以上时的状态，这种流体兼有液体和气体的特点，密度大，粘稠度小，有极高的溶解，渗透到提取材料的基质中，发挥非常有效的萃取功能。

而且这种溶解能力随着压力的升高而增大，提取结束后，再通过减压将其释放出来，具有保持有效成分的活性和无溶剂残留等优点。

由于CO2的超临界条件（TC＝304．6℃，Tp＝7．38MPa）容易达到，常用于超临界萃取的溶剂，在压力为8～40MPa时的超临界CO2足以溶解任何非极性、中极性化合物，在加入改性剂后则可溶解极性化物。

壁内的活性多糖，多糖释放的多少和复合酶的加入量、酶解温度、酶解时间、酶解pH值有直接的关系。

酶解法提取的实质是通过酶解反应强化传质过程。

此法具有条件温和、杂质易除和得率高等优点。

1．3物理强化法1．3．1微波辅助提取法微波萃取是高频电磁波穿透萃取媒质，到达被萃取物料的内部，能迅速转化为热能使细胞内部温度快速上升，细胞内部压力超过细胞壁承受力，细胞破裂，细胞内有效成分流出，在较低的温度下溶解于萃取媒质，通过进一步过滤和分离，获得萃取物料。

1.多糖的提取方法生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。

多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。

动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖。

植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。

1．1溶剂法1．1．1水提醇沉法水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。

多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。

用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置5 h，多糖的质量分数和得率均较高。

影响多糖提取率的因素有：水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。

水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。

但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。

1．1．2酸提法为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。

如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解，可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。

由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高，但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用。

因此酸提法也存在一定的不足之处。

1．1．3碱提法多糖在碱性溶液中稳定，碱有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，缩短提取时间，但提取液中含有其它杂质，使粘度过大，过滤困难，且浸提液有较浓的碱味，溶液颜色呈黄色，这样会影响成品的风味和色泽。

一、实验目的1. 了解多糖的基本概念、性质和分类；2. 掌握多糖提取的基本原理和实验方法；3. 学习利用水提法、醇沉法等方法提取多糖；4. 掌握多糖的纯化、鉴定和含量测定方法。

二、实验原理多糖是一类由单糖分子通过糖苷键连接而成的天然高分子化合物，广泛存在于植物、动物和微生物中。

多糖具有多种生物活性，如免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗病毒等。

本实验主要采用水提法、醇沉法等方法提取多糖，并对其纯化、鉴定和含量进行测定。

三、实验材料1. 实验材料：植物样品（如玉米、小麦、胡萝卜等）；2. 实验试剂：蒸馏水、乙醇、丙酮、苯酚、硫酸、蒽酮、葡萄糖标准品等；3. 实验仪器：组织捣碎机、离心机、分光光度计、磁力搅拌器、容量瓶、移液管、试管等。

四、实验方法1. 植物样品预处理：将植物样品洗净、晾干、磨碎，过筛，得到植物粉末。

2. 水提法提取多糖：（1）称取一定量的植物粉末，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀；（2）在80℃条件下加热提取2小时；（3）冷却后，用离心机分离溶液和沉淀；（4）取上清液，加入乙醇，使多糖沉淀；（5）离心分离，收集沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀，干燥，得到粗多糖。

3. 醇沉法提取多糖：（1）称取一定量的植物粉末，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀；（2）在80℃条件下加热提取2小时；（3）冷却后，用离心机分离溶液和沉淀；（4）取上清液，加入丙酮，使多糖沉淀；（5）离心分离，收集沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀，干燥，得到粗多糖。

4. 纯化多糖：（1）将粗多糖溶解于适量的蒸馏水中；（2）加入适量的苯酚，使多糖与苯酚形成复合物；（3）离心分离，收集沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀，干燥，得到纯多糖。

5. 多糖鉴定：（1）采用苯酚-硫酸法鉴定多糖：取一定量的多糖样品，加入苯酚和硫酸，观察溶液颜色的变化；（2）采用蒽酮法鉴定多糖：取一定量的多糖样品，加入蒽酮，观察溶液颜色的变化。

6. 多糖含量测定：（1）采用硫酸蒽酮法测定多糖含量：取一定量的多糖样品，加入蒽酮，在特定波长下测定吸光度；（2）以葡萄糖标准品为对照，绘制标准曲线，根据样品吸光度计算多糖含量。

1、多糖的提取方法生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。

多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位,决定在提取之前就是否做预处理。

动物多糖与微生物多糖多有脂质包围,一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂,释放多糖。

植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类,在提取前,应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理,目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。

1.1溶剂法1.1.1水提醇沉法水提醇沉法就是提取多糖最常用的一种方法。

多糖就是极性大分子化合物,提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。

用水作溶剂来提取多糖时,可以用热水浸煮提取,也可以用冷水浸提渗滤,然后将提取液浓缩后,在浓缩液中加乙醇,使其最终体积分数达到70 %左右,利用多糖不溶于乙醇的性质,使多糖从提取液中沉淀出来,室温静置 5 h,多糖的质量分数与得率均较高。

影响多糖提取率的因素有:水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。

水提醇沉法提取多糖不需特殊设备,生产工艺成本低,安全,适合工业化大生产,就是一种可取的提取方法。

但由于水的极性大,容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来,从而使提取液存放时腐败变质,为后续的分离带来困难,且该法提取比较耗时,提取率也不高。

1.1.2酸提法为了提高多糖的提取率,在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。

如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解,可用乙酸或盐酸使提取液成酸性,再加乙醇使多糖沉淀析出,也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。

由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出,稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高,但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂,且酸会对容器造成腐蚀,除弱酸外,一般不宜采用。

因此酸提法也存在一定的不足之处。

1.1.3碱提法多糖在碱性溶液中稳定, 碱有利于酸性多糖的浸出,可提高多糖的收率,缩短提取时间,但提取液中含有其它杂质,使粘度过大,过滤困难,且浸提液有较浓的碱味,溶液颜色呈黄色,这样会影响成品的风味与色泽。

验,发现保持小苗周围空气湿润,通气良好且保湿良好的栽培基质和适宜的温度是丽格海棠试管苗移栽成功的关键[7]。

3　小结311　试验结果表明:最佳愈伤组织及分化培养基为:①MS +K T 1.00mg ΠL +NAA0.10mg ΠL ;②MS +6-BA 0.50mg ΠL +2,4-D0.10mg ΠL ;③MS +6-BA 1.00mg ΠL +NAA 0.10mg ΠL ;④MS +6-BA 0.50mg ΠL +NAA 0.10mg ΠL ;继代增殖以同样的培养基为好。

生根培养以在1Π2MS +NAA0.50mg ΠL 和1Π2MS +I BA 0.10mg ΠL 培养基上的效果最好[10]。

312　从试验中注意到,在四个花色品种中易成苗的依次为粉色品种、橙色品种、黄色品种红色品种,对此需进一步研究[10]。

313　将不同外植体分别接种于不同的培养基上,培养1w 后,茎尖外植体首先明显膨大,长出愈伤组织块;3w 后,叶片外植体绝大多数都长出了愈伤组织块。

愈伤组织继续长大,呈黄绿色,颗粒状,较疏松.观察发现3种不同外植体都能被诱导出愈伤组织,只是茎尖最容易脱分化,叶柄次之。

这2种外植体脱分化诱导率均为100%;叶片的诱导率也达到88.3%。

这表明叶片组织分化强度和叶柄与茎尖组织的分化程度差别不大,这与远凌威等人的报道略有不同,需要进一步研究。

参考文献:[1]达克东,张松,姜璐琰,等.丽格海棠离体叶片培养不定芽发生和微繁研究[J ]1山东农业大学学报(自然科学版),2002,33(1):93-951[2]王利琳,庞基良,胡江琴.丽格海棠的离体快繁[J ]1生物技术,2001,11(5):46-481[3]林德钦,李梅,张文珠.富丽华贵的丽格海棠[J ]1厦门华侨亚热带植物引种园,2001,621[4]杜启兰,宋仪农.丽格海棠的微体快速繁殖[J ]1山东林业科技,2002,(5):16-171[5]田代科,管开云,郭瑞贤,等.变色秋海棠的繁殖栽培[J ]1广西植物,2001,21(4):375-3801[6]周鑫,韩建军.丽格海棠的组织培养[J ]1中国林副特产,2001,2(1):471[7]石贵玉,邓欢爱,周巧劲.高压静电场对蟆叶秋海棠愈伤组织生长的效应[J ]1广西科学,1999,6(4):296-2981[8]李景秀,管开云,孔繁才1长翅秋海棠的叶片培养和快速繁殖[J ]1植物生理学通讯,2000,36(5):439-4401[9]王发林,赵秀梅,刘芬.丽格海棠的叶片离体培养技术[J ]1甘肃农业科技,2001,(5):46-471[10]远凌威,袁正仿,张苏锋.丽格海棠的组织培养与快速繁殖研究[J ]1信阳师范学院学报(自然科学版),2002,15(2):219-2211黑木耳多糖的提取与纯化孔祥辉1,2,张介驰2,戴肖东2,李景鹏13(11东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;21黑龙江省科学院应用微生物研究所,黑龙江哈尔滨150010)摘要:黑木耳干子实体经复合酶解结合热水浸提法提取,超过滤,鞣酸法去蛋白,DE AE -52和Sephacryl S -400分子筛柱层析纯化得到精多糖(AAP1)。

作者简介：朱晓霞（１９８２－），女（汉），硕士研究生，从事天然生物大分子研究。

糖类物质是地球上数量最多的一类有机化合物，是生命物质的组成成分之一。

糖类物质广泛地存在于生物界，特别是植物界。

糖类物质按干重计占植物的８３％～９０％，占细菌的１０％～３０％，动物的小于２％。

大量药理及临床研究证实：多糖有调节免疫、抗癌、抗肥胖、控制血糖、降胆固醇、降血脂等生理功能，可广泛应用于医药、保健品及功能食品，作为绿色生物医药产品具有广阔的市场前景。

目前多糖产品开发相当热门，也卓有成效。

多糖的生理功能与其纯度和化学结构有着重要的关系，多糖的提取纯化是其研究的基础。

因此科学高效地从动植物及微生物中提取、纯化其中的多糖成分是目前的核心问题。

本文对多糖制备常用提取与纯化方法，特别是一些新技术的应用进展进行了综述。

１多糖的提取纯化１．１常规方法提取１．１．１原料预处理提取前，必须破坏或抑制共存的水解酶，可采用丙酮、乙醚、乙醇等低极性溶剂，以破坏水解酶并分离脂溶性杂质。

１．１．２浸提一般采用不同温度的水或稀碱溶液提取。

浸提参数中，温度是影响多糖提取的主要因素，另外浸提固液比、浸提时间均影响提取率，可根据需要选取最佳工艺参数。

１．１．３过滤或离心分离提取液有的可以直接过滤，有的因提取液较黏稠不易过滤，往往用离心法除去不溶物。

１．１．４有机溶剂沉淀提取所得的滤液或上清液浓缩，加２～５倍量的有机溶剂，得粗多糖沉淀。

常用有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇及丙酮。

现有很多植物多糖的提取研究都是采取的常规水提法：大麦［１］中活性多糖提取、大枣［２］多糖提取、老头草［３］中多糖的含量测定、乌龙茶［４］多糖提取等。

朱晓霞，罗学刚（西南科技大学材料科学与工程学院，四川绵阳６２１０１０）多糖提取与纯化技术应用进展摘要：多糖由于它们独特的功能和低毒性，在保健食品和药品发展方面具有广阔的应用前景。

提取和纯化是制备多糖的关键。

目前用的提取方法有：常规水提法、超声波、微波辅助提取、超临界流体萃取；分离纯化技术有：色谱、膜分离。

一、实验目的1. 掌握多糖提取分离的基本原理和方法。

2. 熟悉实验操作步骤，提高实验技能。

3. 通过实验，了解不同多糖的提取分离效果。

二、实验原理多糖是一类天然高分子化合物，广泛存在于植物、动物和微生物中。

多糖具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等。

本实验采用水提醇沉法提取分离多糖，利用多糖在水中的溶解度与醇溶液中的溶解度差异，实现多糖的分离纯化。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：香菇粉末、蒸馏水、95%乙醇、NaOH、HCl、无水硫酸钠、苯酚、硫酸等。

2. 实验仪器：电热恒温水浴锅、电子天平、离心机、超声波清洗器、旋转蒸发仪、层析缸、薄层层析板、显色剂等。

四、实验步骤1. 香菇多糖提取（1）称取4g香菇粉末，加入200mL蒸馏水，加热至80℃，保持2h。

（2）冷却至室温，加入适量的95%乙醇，静置过夜。

（3）离心分离，取上清液。

（4）将上清液加入适量的无水硫酸钠，静置过夜。

（5）离心分离，取沉淀。

2. 香菇多糖分离纯化（1）将沉淀溶解于适量蒸馏水中，加入适量的NaOH溶液，调节pH至7.0。

（2）加入适量的HCl溶液，调节pH至4.5。

（3）静置过夜，离心分离，取沉淀。

（4）将沉淀溶解于适量蒸馏水中，加入适量的95%乙醇，静置过夜。

（5）离心分离，取沉淀。

（6）将沉淀溶解于适量蒸馏水中，加入适量的苯酚，显色后进行薄层层析。

3. 香菇多糖鉴定（1）根据薄层层析结果，鉴定香菇多糖的纯度。

（2）根据苯酚-硫酸法测定香菇多糖的浓度。

五、实验结果与分析1. 香菇多糖提取实验中，香菇多糖的提取率为8.50%，表明水提醇沉法能够有效提取香菇中的多糖。

2. 香菇多糖分离纯化通过调节pH和醇沉，成功分离纯化了香菇多糖，纯度达到90%以上。

3. 香菇多糖鉴定根据薄层层析结果，香菇多糖主要成分为β-葡聚糖。

苯酚-硫酸法测定香菇多糖的浓度为1.20mg/mL。

六、实验结论1. 本实验采用水提醇沉法成功提取分离了香菇多糖，提取率为8.50%，纯度达到90%以上。

微生物多糖提取方法：1、分步沉淀法多糖的结构和分子量不同，其性大小不同，在有机溶剂（如醇或酮）中的溶解度不同，根据这一原理，可以依此增加醇浓度，从而将多糖按分子量从大到小的沉淀出来。

但是分沉淀法一般得不到均一性多糖。

仍需要借助柱层析法等进一步纯化，方可得到均一性的多糖。

2、柱层析法要获得均一性的多糖，一般是先经过阴离子交换柱进行粗步纯化，然后再用凝胶柱进一步纯化。

有些多糖也采用大孔树脂柱进行纯化。

下面对这三种柱层析法进行详细介绍。

3、阴离子交换法一般使用阴离子交换柱对真菌、藻类和高等植物的多糖进行初步分离。

阴离子交换色谱常用的介质有DEAE-纤维素、DEAE-琼脂糖凝胶、DEAE-葡萄糖凝胶。

常用的有DEAE-52和DEAE-Sepharose。

例如用DEAE-52柱对大杯香菇等菌类、玉米等植物、桑黄等藻类粗多糖进行分离纯化。

使用DEAE-52填料进行多糖的初步分离纯化，该柱子一般直径偏大，其中以2.6cm多，操作过程中流动相的流速也较快，流速一般在0.7-2ml/min之间，以1ml/min多，至于柱子的长度，选择范围较广，从25-100cm不等。

DEAE-Sepharose柱也常被用在对菌类、植物和藻类粗多糖的初步分离纯化中，在选择层析柱的直径、流速和长度的方面与DEAE-52相似。

DEAE-52或DEAE-Sepharose柱的流动相都是纯水和不同浓度的NaCl溶液。

4、凝胶色谱法凝胶色谱法根据被分离组分尺寸大小与凝胶的孔径关系实现分离，类似于分子筛的作用。

常用的凝胶有葡聚糖凝胶（SephadexG）、SephadexLH-20、聚丙烯酸凝胶ToyopearlHW等。

多糖的进一步分离往往会选择用各种凝胶进行分离纯化。

选择使用哪一种凝胶对多糖进行纯化的标准是多糖的分子量，不同种类和型号的凝胶能够分离多糖类型和分子量范围不同。

凝胶柱的柱子规格常具有长而细的特点，直径以1.6cm偏多。

无论什么类型的凝胶柱，流动相多为蒸馏水或者一定浓度的NaCl溶液。