硫酸盐还原菌鉴定和检测方法的研究进展王明义1,2,梁小兵13,郑娅萍2,赵由之1,魏中青1(1.中国科学院地球化学研究所环境地球化学国家重点实验室,贵州贵阳 550002;2.贵阳医学院生物化学与分子生物学教研室,贵州贵阳 550001)摘 要 硫酸盐还原菌有着重要的生态、经济和环境意义。
系统地论述了硫酸盐还原菌鉴定和检测常用手段,如硫酸盐还原菌分离纯化培养方法、检测遗传标记的分子生物学方法和生物特征化合物方法。
这些技术的发展,不断扩展了硫酸盐还原菌的研究领域和深度并使对硫酸盐还原菌在分子水平的研究成为可能。
关键词 硫酸盐还原菌;分离纯化;遗传标记;生物特征化合物中图分类号 Q93-31 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2005)06-0081-04Advanced in Identif ication of Sulfate2R educing B acteria andIts Detection MethodWAN G Ming2yi1,2,L IAN G Xi2bing1,ZHEN G YA2ping2,ZHAO Y ou2zhi1,WEI Zhong2qing1(1.State Key L ab.of Envi ron.Geochem.Inst.of Geochem.Chi nese Acad.of Sci.Guiyang,Guiz hou550002;2.Teach,&Res.Sect.of Biochem.&Molec.Biol.Guiyang Med.Coll.Guiyang,Guiz hou550001)Abstract Sulfate2reducing bacteria(SRB)play an important role in ecology,economy,and environment.Identifi2 cation of the bacteria and common detection methods were introduced,includin g the isolation,purification of the bacteria,the molecular biological methods based on the genetic markers and detecting methods of biologically charac2 teristic compounds.With the development of these technologies,it is possible to expand the research field and pro2 fundity of SRB and their research at molecular level.K eyw ords sulfate2reducing bacteria(SRB);isolation and purification;genetic markers;biologically characteristic compounds 硫酸盐还原菌(sulfate2reducing bacteria, SRB)是一大类严格厌氧菌,其利用硫酸盐作为有机物异化时的电子受体,并在代谢活动中产生高浓度H2S。
硫酸盐还原菌有着重要的生态、经济和环境意义。
研究表明硫酸盐还原菌参与有机物厌氧降解和低硫酸盐环境中碳的厌氧矿物化,其产生的H2S除了对很多微生物和其他生物有毒害作用,也可以作为一些硫代谢细菌的电子供体;同时由于硫酸盐还原菌产生的H2S、代谢过程中引起油和气体酸化以及细菌和FeS对孔隙的堵塞等原因可造成钢铁、金属等材料的腐蚀,引起工程设施受损[1,2]。
硫酸盐还原菌在倍受关注的甲基汞生物富集过程中起着重要作用,亦参与环境甲苯和二甲苯降解以及可溶性铀和不溶性铀转化[3～5]。
作为自然界中一类生物,硫酸盐还原菌是硫化物转化、物质循环和能量流动中不可缺少的参与者和发动者。
随着环境中硫酸盐还原菌研究的深入,要求建立准确可靠的硫酸盐还原菌鉴定和微生物群落结构中硫酸盐还原菌量化分析的方法。
本文围绕着对硫酸盐还原菌类群鉴定和量化分析方法作一综述。
收稿日期:2005-03-25 作者简介:王明义 男,主管检验师,硕士研究生。
研究方向为微生物分子生物学。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(40473050) 3通讯作者18微生物学杂志 2005年11月第25卷第6期 JOURNAL OF MICROBIOLOGY Nov.2005Vol.25No.61 硫酸盐还原菌分离纯化培养方法 硫酸盐还原菌分离纯化方法应用较多[6,7],多采用选择性培养基进行厌氧培养,常用的培养基为RP238肉汤。
硫酸盐还原菌大部分为中温性细菌,最适温度为30℃,但部分嗜热菌要求55℃生长,培养时应根据菌株的温度型选择培养温度。
硫酸盐还原菌在p H5～9.5的范围内生存,最适p H值为7.0～7.8。
取自高盐环境样品在进行硫酸盐还原菌培养时,还应加入2.5%的NaCl。
硫酸盐还原菌厌氧培养时所用培养基的氧化还原电位(Eh)要求在-100mV以下,通常添加巯基乙醇或抗坏血酸作为还原剂以获得较低的氧化还原电位。
同时培养基中加入的亚铁盐可以与硫酸盐还原菌代谢过程中产生的H2S形成FeS黑色沉淀,在固体培养基上可形成黑色菌落或菌落周围形成黑色沉淀环,液体培养基则表现为黑色混浊或沉淀成长。
硫酸盐还原菌分离纯化培养可以得到纯化菌株,有利于对菌株进一步分析。
但该法只能选择性地培养出硫酸盐还原菌某些类群,且分离培养后菌株的生理特性易发生改变等,有时并不能说明样品的真实情况。
选择适宜的培养基、正确的样品预处理和严格的厌氧实验条件是硫酸盐还原菌分离纯化培养获得成功的关键。
2 建立于检测硫酸盐还原菌遗传标记基础上的分子生物学方法 建立于检测硫酸盐还原菌遗传标记基础上的分子生物学方法主要有PCR、PCR2RFL P和原位杂交,常用的遗传标记主要有硫酸盐还原菌16S rRNA基因特征序列和硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶(dissimilatory sulfite reductase,dsr)基因。
2.1 PCR(polymerase chain reaction) PCR(polymerase chain reaction)技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,其目的是将微量DNA大量扩增。
PCR方法被广泛应用于硫酸盐还原菌的鉴定和检测中,所用引物多是依据硫酸盐还原菌6个主要类群的16S rRNA基因特征性序列而设计的,也有利用PCR对硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶基因分析的报道[8,9],Michael Wagner等对多种属于真细菌和一种属于古细菌的硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶基因进行PCR扩增,对扩增产物进行碱基序列分析,并进一步推导出亚硫酸盐异化酶氨基酸序列进行比较,结果表明硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶氨基酸序列有高度相似性(49%～89%),从而推断出属于真细菌和古细菌的硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶可能起源于同一个保守的酶。
PCR敏感性高、实验方法较为成熟,近几年被广泛应用。
但如何解决环境样品核酸提取和PCR对混合DNA样品中某些模板的优先扩增[10]等问题是成功应用PCR于硫酸盐还原菌鉴定和检测的关键。
2.2 PCR2RFLP(polymerase chain reaction re2 striction fragment length polymorphisms) RFL P即限制性片段长度多态性,是根据限制性核酸内切酶具有识别并切割目的DNA特殊碱基序列的特性,利用特定限制性核酸内切酶对目的DNA进行消化。
由于目的DNA碱基的突变或种属之间的差异可能会使酶切位点增加或减少,从而使酶切片断的数量和大小发生改变,可以在一定程度上反映出目的DNA分子的序列信息。
得出的限制性酶谱亦可以与标准菌株比较,进行微生物的鉴定。
RFL P常和PCR合用,利用RFL P对PCR产物进行消化,即所谓的PCR2 RFL P。
常选用硫酸盐还原菌SRB385基因片段和dsr AB基因片段进行PCR2RFL P,来进行硫酸盐还原菌特定基因的多态性分析或类群鉴定。
SRB385基因是δ群变形杆菌纲的微生物(包含大多数硫酸盐还原菌)16Sr RNA基因385～402bp 保守核酸序列,依据该基因建立的分子生物学方法所检测的微生物常特指硫酸盐还原菌所有类群。
dsr AB基因编码硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶,同一类群的硫酸盐还原菌中相当保守,在不同类群中却有较大差别,可以作为硫酸盐还原菌的分类与进化的指标。
Xueduan Liu[11]等利用PCR2RFL P分析了东太平洋海洋沉积物中的硫酸盐还原菌dsr AB基因多态性,表明该基因的分子多态性即硫酸盐还原菌类群多态性与海洋的深度、碳源生物利用度密切相关。
28 微 生 物 学 杂 志 25卷PCR2RFL P有很高的分辨率,结果的重复性和准确性也较高;不足之处是操作步骤繁琐,有较高的技术要求。
2.3 核酸分子杂交(hybridization) 核酸分子杂交技术是利用特异性探针对微生物的核酸序列进行检测,从而分析微生物群落结构、分布模式、丰度和特定微生物类群。
杂交所用的探针多采用依赖16S rRNA序列设计的寡核酸探针,杂交方式通常有菌落杂交、斑点印迹杂交和原位杂交,以斑点印迹杂交和原位杂交较为常用。
斑点印迹杂交(dot blot hybridization)通常是提取并点样于滤膜上的微生物16S rRNA与标记探针杂交,从而进行定性和定量分析。
定量斑点印迹杂交检测过程中常应用2种以上寡核苷酸探针,分别是测定所有微生物的通用寡核苷酸探针和特定微生物的特异性寡核苷酸探针。
样品杂交后信号强度与定量培养物制备的检测标准曲线进行比较,可以将测定信号转化为细胞数。
该法已被应用于硫酸盐还原菌定量检测中[12]。
定量斑点印迹杂交所用的探针常以放射性核素进行标记,具有较高的敏感性;同时16S rRNA是细胞内的可测产物,其含量可以代表特定微生物群体的生理活性。
但不同种的微生物体内含有不同数目的核糖体(103～104),甚至是同一菌株在不同的生长阶段其核糖体含量也不相同,使该方法在运用中存在一定的问题[13,14]。
目前应用较多的核酸杂交技术是原位杂交技术(in situ hybridization),这里的原位杂交技术是指不改变细胞形态和微生物小环境进行的杂交。
利用rRNA序列探针进行原位杂交,最早的标记物是核素[15],该方法需要较长时间的曝光和环境的污染。
