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2024年岳麓版选修3生物上册月考试卷11考试试卷考试范围：全部知识点；考试时间：120分钟学校：______ 姓名：______ 班级：______ 考号：______总分栏一、选择题(共6题，共12分)1、下列有关基因工程的叙述，正确的是()A. DNA连接酶只能将由同一种限制性核酸内切酶切割而成的黏性末端连接起来B. 目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变C. 目的基因与质粒结合的过程发生在细胞外D. 常使用的载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等2、下列除哪一项外，其余均为基因工程载体必须具备的条件（）A. 具有标记基因，便于筛选B. 具一至多个酶切位点，以便与目的基因连接C. 是环状DNA分子D. 能在宿主细胞中复制并稳定保存3、科学家在河南华溪蟹中找到了金属硫蛋白基因，并以质粒为载体，采用转基因方法培育出了汞吸收能力极强的转基因烟草。
下列有关该烟草培育的说法正确的是( )A. 金属硫蛋白基因需插入到质粒上，才能转移到受体细胞中B. 为培育出转基因烟草植株，应选择的受体细胞一定是烟草的受精卵C. 同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具有专一性D. 转基因烟草与原烟草相比基因组成发生变化，导致两者出现生殖隔离4、蜘蛛丝（丝蛋白）被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度，可制成防弹背心、降落伞绳等。
蜘蛛丝还可被制成人造韧带和人造肌腱。
科学家研究出集中生产蜘蛛丝的方法——培育转基因蜘蛛羊作为乳腺生物反应器。
下列有关乳腺生物反应器的说法，错误的是（）A. 将蜘蛛丝蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等结合在一起构建成表达载体B. 可通过显微注射技术将表达载体导入羊的受精卵中C. 可用丝蛋白基因探针与该羊口腔上皮细胞mRNA杂交，检测目的基因是否发挥作用D. 上述培育转基因蜘蛛羊的过程涉及到基因工程、动物细胞培养、胚胎移植等技术5、动物细胞培养是动物细胞工程的基础，科研人员将数量相等的动物肝脏肿瘤细胞和肝脏正常细胞分别置于相同培养液中培养。
基因表达载体的构建方法基因表达载体是一种用来携带外源基因并将其表达的工具，它可以被用于基因工程、基因治疗、蛋白质表达等领域。
构建一个高效的基因表达载体对于生物学研究和应用具有重要意义。
下面将介绍基因表达载体的构建方法。
首先，选择合适的表达载体。
常用的表达载体包括质粒、病毒、原核生物和真核生物等。
质粒是最常见的表达载体，它具有稳定性高、易于操作等优点。
而病毒载体则可以实现高效的基因传递和表达。
根据实验需要和研究对象的特点，选择合适的表达载体非常重要。
其次，设计基因的插入序列。
在构建基因表达载体时，需要将目标基因插入到载体中，并确保基因的正确表达。
为了实现这一目标，需要设计合适的引物，并利用PCR技术扩增目标基因。
此外，还需要考虑基因的启动子、终止子、信使RNA等序列的设计，以确保基因在宿主细胞中能够得到正确的表达。
然后，将目标基因插入载体。
一般来说，可以利用限制性内切酶将目标基因和表达载体进行酶切，然后利用DNA连接酶将两者连接起来。
此外，还可以利用基因克隆技术将目标基因插入到表达载体中。
在这一步骤中，需要注意选择合适的酶切位点、连接方式和连接效率，以确保插入的基因能够稳定地存在于载体中。
接着，进行载体的转化和筛选。
将构建好的基因表达载体导入到宿主细胞中，然后利用抗生素筛选、荧光筛选等方法，筛选出带有目标基因的阳性克隆。
这一步骤需要注意转化效率、筛选条件和筛选方法的选择，以确保获得高效的表达载体。
最后，验证基因表达载体的功能。
构建好基因表达载体后，需要进行功能验证，包括基因的表达水平、蛋白质的表达情况、生物学活性等方面。
通过Western blot、荧光显微镜、活性测定等方法，验证基因表达载体的功能和稳定性，为后续的研究和应用奠定基础。
总之，构建基因表达载体是一个复杂而又关键的过程，需要综合考虑载体的选择、基因的设计、插入、转化和验证等多个环节。
只有在每一个环节都做到严谨和细致，才能获得高效、稳定的基因表达载体，为生物学研究和应用提供有力支持。
1.水稻HD3外源基因花粉逃逸能力2.接种AM真菌对黄芪生长及有效成分的影响3.丛枝真菌对食叶草生长发育影响4.红心火龙果全息蛋白质组提取方法优化5.拟南芥ANNAT4基因植物表达载体的构建6.四环素浓度对大豆植株生长的影响7.拟南芥GSNOR1基因的克隆及其序列分析8.应用植物凋落物分解评估溪流生态系统健康研究进展9.AMF复合菌剂对水稻育苗影响10.香蕉果皮发酵富钾液肥方法优化11.一株马铃薯晚疫病拮抗菌C1-17发酵条件优化12.甜菜M14品系愈伤组织的诱导研究13.氯氟吡啶酯对稻田土壤真菌多样性的影响14.城市厨余垃圾生产高品质园艺用土研究进展15.拟南芥IPUT1基因植物表达载体的构建16.一株类芽孢杆菌菌株对烟草生长表型的影响17.一株马铃薯晚疫病拮抗菌发酵条件优化18.大城市厨余垃圾资源化处理研究进展19.转基因抗虫水稻对土壤细菌的影响20.烯禾啶对肇东苜蓿生长的影响21.外源苯甲酸对紫苏种子发芽和幼苗生长的影响22.拟南芥GSNOR1基因植物表达载体的构建23.干旱胁迫下甜菜M14品系表型分析24.不同海拔梯度小叶章种群土壤真菌群落结构和多样性25.拟南芥IPUT1基因的克隆及其序列分析26.Cd胁迫下丛枝菌根真菌与印度梨形孢对土壤酶活的影响27.印度梨形孢产功能酶的初步研究28.不同果肉颜色火龙果全息蛋白质组提取技术优化29.水稻HD2外源基因对土壤微生物的水平转移30.拟南芥ANNAT4基因原核表达载体的构建31.鸡胚原代细胞培养生长曲线模型研究32.拟南芥SMXL1基因的克隆及其序列分析33.水稻食味品质遗传研究进展34.氮沉降对红松人工林土壤碳降解相关酶活性的影响35.北方水稻耐盐碱QTL定位分析36.植物激素对汉麻愈伤组织诱导的影响研究37.BvM14-RIN4基因真核表达载体的构建以及互作蛋白预测38.印度梨形孢提高植物抗逆能力的研究进展39.稻花香2号与龙粳31香味基因的差异性分析40.不同pH条件下耐酸真菌产功能酶初步研究41.龙粳31香味基因OsBadh2的定点敲除42.拟南芥BIN2基因的克隆及其序列分析43.拟南芥IPUT1基因原核表达载体的构建44.甜菜M14品系转录因子WOX8转录激活活性分析45.好氧反硝化细菌的筛选分离鉴定及其脱氮性能研究46.丛枝菌根真菌对大豆植株Cd转运和累积的影响47.汉麻愈伤组织的诱导和分化研究48.一个玉米蛋白酶抑制剂基因克隆与生物信息学分析49.利用花药培养技术创建稻花香2号与空育131杂交衍生的双单倍体群体50.产L-肉碱的菌种筛选及发酵条件的优化51.利用测序定位分析亚麻抗白粉病基因52.不同激素对甜菜愈伤组织诱导的影响53.益生菌发酵果蔬汁营养成分及功能特性的研究进展54.不同温度、时间、IPTG和菌种浓度对丁肝抗原蛋白表达量的影响55.重组鸡EED基因在大肠杆菌中高效表达的基因优化设计56.甜菜BvEXP-A10-like基因的克隆及分析57.拟南芥SMXL1基因原核表达载体的构建58.水稻产量相关性状遗传研究进展59.一株贝莱斯芽孢杆菌X3-2抑菌功能研究60.模拟氮沉降对土壤氨基糖影响的研究进展61.AMF提高植物抗铅胁迫的研究进展62.精喹禾灵对肇东苜蓿生长的影响63.重组人铁蛋白在大肠杆菌中高效表达的基因优化设计64.利用定点改变技术修饰空育131中的NPT1基因65.高产蛋白紫苏品种选育66.拟南芥BIN2基因植物表达载体的构建67.一株马铃薯晚疫病拮抗菌X3-2发酵条件优化68.不同海拔小叶章种群土壤酶活性69.红松人工林土壤碳氮转化酶对氮沉降的响应70.镉胁迫下异形根孢囊霉对汉麻抗逆性酶活性的影响71.甜菜原生质体制备工艺的优化72.甜菜根腐病源菌分离鉴定73.不同海拔梯度小叶章种群土壤理化性质74.一株马铃薯晚疫病拮抗枯草芽孢杆菌分离鉴定75.高寒地区厨余垃圾生产EM肥菌群变化分析76.沙棘真菌分离鉴定77.耐酸微生物抗重金属毒性的研究进展78.吡氟酰草胺对不同土壤微生物群落结构影响79.不同浓度TiO2对甜菜M14品系幼苗生长的影响80.甜菜愈伤组织诱导的激素筛选研究81.玉米芯腐熟剂--开创复合菌剂新未来（创新创业成果）82.氮沉降背景下森林土壤微生物多样性的研究进展83.玉米自交系Mo17蛋白酶抑制剂基因原核表达载体构建84.玉米丝氨酸蛋白酶抑制剂原核表达载体构建85.定向改良水稻第8染色体香味基因的TALEN载体的构建86.枯草芽孢杆菌分离鉴定87.半纤维素酶高产菌株的筛选88.利用测序分析亚麻自然群体的遗传结构89.长白山不同海拔梯度土壤理化性质的变化90.甜菜M14品系叶片愈伤组织的诱导91.一株耐锰真菌的分子鉴定及对重金属耐受能力的初步研究92.水稻HD1外源基因花粉逃逸能力93.AMF复合菌剂对水稻育苗影响94.香蕉果皮发酵富钾液肥方法优化95.一株马铃薯晚疫病拮抗菌C1-17发酵条件优化96.甜菜M14品系愈伤组织的诱导研究97.氯氟吡啶酯对稻田土壤真菌多样性的影响98.城市厨余垃圾生产高品质园艺用土研究进展99.拟南芥IPUT1基因植物表达载体的构建100.一株类芽孢杆菌菌株对烟草生长表型的影响101.一株马铃薯晚疫病拮抗菌发酵条件优化102.大城市厨余垃圾资源化处理研究进展103.转基因抗虫水稻对土壤细菌的影响104.烯禾啶对肇东苜蓿生长的影响105.外源苯甲酸对紫苏种子发芽和幼苗生长的影响106.拟南芥GSNOR1基因植物表达载体的构建107.干旱胁迫下甜菜M14品系表型分析108.不同海拔梯度小叶章种群土壤真菌群落结构和多样性109.拟南芥IPUT1基因的克隆及其序列分析110.Cd胁迫下丛枝菌根真菌与印度梨形孢对土壤酶活的影响111.印度梨形孢产功能酶的初步研究112.不同果肉颜色火龙果全息蛋白质组提取技术优化113.水稻HD2外源基因对土壤微生物的水平转移114.拟南芥ANNAT4基因原核表达载体的构建115.鸡胚原代细胞培养生长曲线模型研究116.拟南芥SMXL1基因的克隆及其序列分析117.水稻食味品质遗传研究进展118.氮沉降对红松人工林土壤碳降解相关酶活性的影响119.北方水稻耐盐碱QTL定位分析120.植物激素对汉麻愈伤组织诱导的影响研究121.利用花药培养技术创建稻花香2号与空育131杂交衍生的双单倍体群体122.产L-肉碱的菌种筛选及发酵条件的优化123.利用测序定位分析亚麻抗白粉病基因124.不同激素对甜菜愈伤组织诱导的影响125.益生菌发酵果蔬汁营养成分及功能特性的研究进展126.不同温度、时间、IPTG和菌种浓度对丁肝抗原蛋白表达量的影响127.重组鸡EED基因在大肠杆菌中高效表达的基因优化设计128.甜菜BvEXP-A10-like基因的克隆及分析129.拟南芥SMXL1基因原核表达载体的构建130.水稻产量相关性状遗传研究进展131.一株贝莱斯芽孢杆菌X3-2抑菌功能研究132.模拟氮沉降对土壤氨基糖影响的研究进展133.AMF提高植物抗铅胁迫的研究进展134.精喹禾灵对肇东苜蓿生长的影响135.重组人铁蛋白在大肠杆菌中高效表达的基因优化设计136.利用定点改变技术修饰空育131中的NPT1基因137.一株马铃薯晚疫病拮抗枯草芽孢杆菌分离鉴定138.高寒地区厨余垃圾生产EM肥菌群变化分析139.沙棘真菌分离鉴定140.耐酸微生物抗重金属毒性的研究进展141.吡氟酰草胺对不同土壤微生物群落结构影响142.不同浓度TiO2对甜菜M14品系幼苗生长的影响143.甜菜愈伤组织诱导的激素筛选研究144.玉米芯腐熟剂--开创复合菌剂新未来（创新创业成果）145.氮沉降背景下森林土壤微生物多样性的研究进展146.玉米自交系Mo17蛋白酶抑制剂基因原核表达载体构建147.玉米丝氨酸蛋白酶抑制剂原核表达载体构建148.定向改良水稻第8染色体香味基因的TALEN载体的构建149.枯草芽孢杆菌分离鉴定150.半纤维素酶高产菌株的筛选151.利用测序分析亚麻自然群体的遗传结构152.长白山不同海拔梯度土壤理化性质的变化153.甜菜M14品系叶片愈伤组织的诱导154.一株耐锰真菌的分子鉴定及对重金属耐受能力的初步研究155.水稻HD1外源基因花粉逃逸能力156.水稻HD3外源基因花粉逃逸能力157.拟南芥ANNAT4基因的克隆及其序列分析158.分子标记在水稻遗传育种中的应用159.云南樟叶精油微波法提取及抑制活性研究160.黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区不同森林类型土壤微生物功能多样性分析161.水稻HD4外源基因对土壤微生物的水平转移162.甜菜GRAS转录因子全基因组家族鉴定及生物信息学分析163.利用分离群体定位分析亚麻抗白粉病基因164.异丙甲草胺对肇东苜蓿生长的影响165.农业对源头溪流底栖动物群落结构与功能的影响166.烯草酮对肇东苜蓿生长的影响167.世界三大黑土区利用和保护措施的论述168.模拟氮沉降对三江平原小叶章湿地土壤微生物碳代谢的影响169.接种AM真菌对黄芪生长及有效成分的影响170.丛枝真菌对食叶草生长发育影响171.红心火龙果全息蛋白质组提取方法优化172.拟南芥ANNAT4基因植物表达载体的构建173.四环素浓度对大豆植株生长的影响174.拟南芥GSNOR1基因的克隆及其序列分析175.应用植物凋落物分解评估溪流生态系统健康研究进展176.高产蛋白紫苏品种选育177.拟南芥BIN2基因植物表达载体的构建178.一株马铃薯晚疫病拮抗菌X3-2发酵条件优化179.水稻基因gfr分子检测体系及其应用180.不同海拔小叶章种群土壤酶活性181.红松人工林土壤碳氮转化酶对氮沉降的响应182.镉胁迫下异形根孢囊霉对汉麻抗逆性酶活性的影响183.甜菜原生质体制备工艺的优化184.甜菜根腐病源菌分离鉴定185.不同海拔梯度小叶章种群土壤理化性质186.拟南芥ANNAT4基因的克隆及其序列分析187.分子标记在水稻遗传育种中的应用188.云南樟叶精油微波法提取及抑制活性研究189.黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区不同森林类型土壤微生物功能多样性分析190.水稻HD4外源基因对土壤微生物的水平转移191.甜菜GRAS转录因子全基因组家族鉴定及生物信息学分析192.利用分离群体定位分析亚麻抗白粉病基因193.异丙甲草胺对肇东苜蓿生长的影响194.农业对源头溪流底栖动物群落结构与功能的影响195.烯草酮对肇东苜蓿生长的影响196.世界三大黑土区利用和保护措施的论述197.模拟氮沉降对三江平原小叶章湿地土壤微生物碳代谢的影响198.BvM14-RIN4基因真核表达载体的构建以及互作蛋白预测199.印度梨形孢提高植物抗逆能力的研究进展200.稻花香2号与龙粳31香味基因的差异性分析201.不同pH条件下耐酸真菌产功能酶初步研究202.龙粳31香味基因OsBadh2的定点敲除203.拟南芥BIN2基因的克隆及其序列分析204.拟南芥IPUT1基因原核表达载体的构建205.甜菜M14品系转录因子WOX8转录激活活性分析206.好氧反硝化细菌的筛选分离鉴定及其脱氮性能研究207.丛枝菌根真菌对大豆植株Cd转运和累积的影响208.汉麻愈伤组织的诱导和分化研究209.一个玉米蛋白酶抑制剂基因克隆与生物信息学分析。
牛生长激素BGH基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-N1-BGH的构建韦光辉;徐廷生;雷雪芹;索剑飞【摘要】采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从11月龄的牛脑垂体组织中扩增出BGH基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-BGH重组质粒.通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,结果表明,成功构建了pEGFP-N1-BGH真核表达载体.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2010(000)001【总页数】3页(P113-115)【关键词】牛生长激素基因;克隆;真核表达载体pEGFP-N1;载体构建【作者】韦光辉;徐廷生;雷雪芹;索剑飞【作者单位】河南科技大学,动物科技学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学,动物科技学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学,动物科技学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学,动物科技学院,河南,洛阳,471003【正文语种】中文【中图分类】S823P;Q782牛生长激素基因(BGH)是由牛脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一类单链多肽类激素,广泛存在于各种脊椎动物中[1]。
BGH由191个氨基酸组成,分子量为22kD。
其主要作用是调节机体物质代谢过程,促进葡萄糖吸收,碳水化合物和脂肪分解、核酸与蛋白质合成,进而提高饲料转化率[2]。
1982年,Palmilter等[3]成功将大鼠生长激素基因转入小鼠受精卵的雄原核中,获得了超级小鼠,个体比对照组增大了1倍。
这些成就使许多研究者认识到转基因技术在个体改造、品种改良方面具有巨大的应用潜力。
之后,对各种动物及以人生长激素基因的转移就成了动物基因工程领域的热点课题。
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)来源于海洋生物水母,其基因可以在异源组织中表达并产生荧光,表达时不需抗体、辅助因子、酶底物等其他成分,不影响宿主细胞,因而可以鉴定、跟踪、分选表达GFP的活细胞,成为目前国内外生物化学和细胞生物学中最广泛应用的报告基因之一[4,5]。
pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的表达徐婧;侯赋园;王德彬;李竣;胡鑫;杨光忠【摘要】目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入 HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型. 方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH. 并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR 检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与GenBank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(037)003【总页数】4页(P28-31)【关键词】黑色素聚焦激素;绿色荧光蛋白;pEGFP-C1;转染;HEK293【作者】徐婧;侯赋园;王德彬;李竣;胡鑫;杨光忠【作者单位】中南民族大学药学院,武汉430074;中南民族大学药学院,武汉430074;中南民族大学药学院,武汉430074;中南民族大学药学院,武汉430074;中南民族大学药学院,武汉430074;中南民族大学药学院,武汉430074【正文语种】中文【中图分类】Q786黑色素聚集激素(MCH)最初于1983年从大马哈鱼(Oncorhynchus keta)垂体分离获得，因通过黑色素细胞中的黑色素聚集来调节硬骨鱼类的皮肤颜色而得名[1].MCH参与机体多种生理功能的调节，包括摄食调节、下丘脑-垂体-肾上腺轴、能量平衡、生殖和感官感知等[2]，其中最受关注的是其在调节摄食和能量代谢中的作用[3].在大鼠与小鼠脑室内短期或长期注射MCH，均会引起摄食增加，进而导致肥胖[4]，MCH过表达的转基因小鼠可表现为进食增多，最终导致肥胖[5]；敲除MCH基因的小鼠中MCH基因水平的降低可以导致进食减少和代谢增强，进而导致小鼠体重减轻、体型瘦小[6].这些研究结果表明：MCH在哺乳动物中可能发挥着增强食欲、降低代谢的作用.本文通过构建MCH基因的绿色荧光蛋白表达载体，并使其在HEK293细胞系中稳定表达，为探讨MCH在能量代谢中的作用及机制提供细胞模型.1 材料与方法1.1 材料和仪器胎牛血清(杭州四季青)，高糖DMEM培养基(Gibco-BRL)，DNA Marker(广州东胜)，DNA凝胶回收试剂盒(Axygen)，限制性内切酶(TAKARA)，引物合成、DNA测序(武汉擎科)，脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen)，质粒提取试剂盒(Axygen)，大肠杆菌DH5α和HEK293(本室保存).冷冻离心机(Eppendorf 5417R台式，德国)，高压双稳电泳仪(DYY-4C型，北京六一)，水平电泳槽(DYCP-31D型，北京六一)，自动凝胶图像分析仪(JS380，上海培清)，核酸蛋白紫外测定仪(GenenQuant Ⅱ,ciences).1.2 pEGFP-C1的大量获取按标准方法将pEGFP-C1质粒转化入DH5α中，将菌液涂布于LB固体培养基(含50 μg/mL卡那霉素).挑出阳性菌落扩大培养于37 ℃含50 μg/mL卡那霉素的LB 液体培养基中，130 r/min转速.收集细菌，提取质粒.经Nhe I单酶切，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定.1.3 MCH基因编码区的克隆从脑组织中提取总RNA，将RNA逆转录为cDNA[7].参照Genbank中MCH基因的全长序列，设计引物：上游引物5′-GATCAGATCTGAACCACTGAAGAAACACTCG-3′(引入BgI Ⅱ酶切位点，下划线部分)，下游引物5′-GATCCTGCAGCAACACTGGATTACAGAAAA-3′(引入Pst I 酶切位点，下划线部分).PCR反应体系为：0.25 μL TaKaRa Ex Taq(5 U/ μL)，5 μL 10×Ex Taq Buffer(Mg2+ Plus)，4 μL dNTP Mixture(各2.5 mM)，2 μL模板cDNA，上下引物各1 μL(10 μM)，加双蒸水至50 μL.反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35 cycles；72 ℃ 5 min.反应产物于1.2 %琼脂糖凝胶电泳鉴定，割胶回收PCR产物.1.4 pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建将pEGFP-C1双酶切，双酶切反应为：5 μL 质粒，2 μL 10×H Buffer，Pst I与BgI Ⅱ各1 μL，11 μL双蒸水.于37 ℃反应1 h后1.2 %电泳鉴定后割胶回收.取pEGFP-C1及MCH双酶切产物，加入1 μL T4 DNA ligase，1 μL 10×T4 DNA ligase buffer，加水至10 μL，于22 ℃反应4 h，按1.2将重组质粒转入DH5α菌株.挑取阳性菌落做菌落PCR，扩大培养含MCH片段的菌群.提取质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定产物大小，并送重组质粒测序鉴定.1.5 pEGFP-C1-MCH重组质粒的转染转染前24 h，将HEK293细胞铺板于六孔板中，使用DMEM完全培养基，于37 ℃、5% CO2饱和湿度中培养.待其汇合度为70% ～ 80%时，吸弃原培养液，PBS洗3次，加入1.5 mL无血清无抗生素DMEM培养基.分别取适量重组质粒pEGFP-C1-MCH及5 μL Lipofectamine 2000稀释于50 μL无抗生素无血清的DMEM培养基，轻轻摇晃混匀，5 min后静置20 min.逐滴加入六孔板中，混匀，转染6 h后更换完全培养基[8].1.6 转染后倒置荧光显微镜观察细胞转染24, 48, 72 h后于荧光倒置显微镜在488 nm波长紫外光激发下观察荧光蛋白表达情况.1.7 重组质粒在转染细胞中的表达检测pEGFP-C1-MCH转染细胞24 h后，消化收集细胞，利用半定量RT-PCR技术检测该质粒在HEK293细胞中的表达.先利用Trizol试剂提取细胞总RNA，再使用RNA逆转录试剂盒以2 μg细胞总RNA为模板合成cDNA第一条链，再各取2μL cDNA 作为模板DNA用PCR技术分析MCH基因表达情况，以β-actin基因作为内参. MCH 的上游引物为5′-GATCAGATCTGAACCACTGAAGAAACACTCG-3′，下游引物为5′-GATCCTGCAGCAACACTGGATTACAGAAAA-3′，β-actin的上游引物为5′-GGGTATGGAGTCTTGCG G-3′，下游引物为5′- TTTCATTGTGCTGGGGG-3′，扩增条件均为94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35 cycles；72 ℃ 5 min.2 结果与分析2.1 pEGFP-C1-MCH重组载体的酶切鉴定大量制备的载体及MCH片段分别经BgI Ⅱ，Pst I双酶切及电泳检测后，产物大小正确，分别为4.7 kb和477 bp(见图1).将载体片段和目的片段连接、转化，挑取阳性克隆，提取质粒DNA后，重组质粒分别经单酶切(BgI Ⅱ)，双酶切(BgI Ⅱ与Pst I)检测，产物大小分别约为5.2，4.7 kb，与原载体及插入片段大小匹配.由于插入片段过小，在重组质粒双酶切产物电泳图中未能显示477 bp的条带(见图2).1) 1 kb Marker; 2)载体片段4.7 kb; 3) 目的片段477 bp图1 制备载体和目的片段DNA的制备Fig.1 Preparation of the vector and target DNA1)阳性克隆的BgI Ⅱ酶切; 2) 阳性克隆BgI Ⅱ+Pst I双酶切; 3) 1 kb Marker图2 阳性克隆酶切鉴定Fig.2 Identification of the positive clone2.2 重组载体的测序鉴定挑取有插入片段的阳性克隆测序.双向测序结果表明：重组克隆中插入了相应的MCH基因目的片段.经Blast序列比对显示，插入片段大小、方向正确，证明目的片段MCH基因正确地插入了pEGFP-C1质粒.2.3 pEGFP-C1-MCH质粒在HEK293细胞中的表达重组质粒pEGFP-C1-MCH质粒DNA转入HEK293细胞后，将转染细胞置于倒置荧光显微镜下观察，在48 h 可观察到部分细胞表达EGFP；72 h后，表达的EGFP的细胞数量逐渐增多，细胞中有较强的荧光蛋白表达(见图3)，EGFP均匀分布在胞质中.图3 EGFP在转染pEGFP-C1-MCH的HEK293细胞中的表达Fig.3 EGFP expression in HEK293 cells transfected by pEGFP-C1-MCH2.4 RT-PCR鉴定重组细胞中MCH的表达RT-PCR检测重组细胞中MCH基因的表达水平，结果显示：pEGFP-C1-MCH转染HEK293细胞24 h后，MCH基因在重组细胞中稳定表达(见图4).1)DL 2000 Marker; 2)pEGFP-C1的β-actin mRNA; 3) pEGFP-C1 的MCH mRNA;4)阴性对照; 5)pEGFP-C1-MCH的β-actin mRNA; 6)pEGFP-C1-MCH 的MCH mRNA.图4 重组细胞中MCH mRNA的表达水平Fig.4 mRNA expression level of MCH gene in recombinant cells3 讨论生物的物质和能量代谢是维持机体生命活动的重要基础，能量代谢是人体代谢的最基本形式，下丘脑在维持机体能量稳态中发挥着重要作用.在下丘脑中有许多刺激或抑制进食的下丘脑肽，如Leptin，Kisspeptin等.最近研究发现，下丘脑肽MCH在调节能量代谢的过程中扮演着重要角色.人类中的神经肽MCH由19个氨基酸组成，在脊椎动物的进化中高度保守，从大马哈鱼(Oncorhynchus tschawytscha)[9]、银鲑(O. kisutsh) [10]、罗非鱼(Oreochromis mossambicus) [11]、金鱼(Carassius auratus)[12]等中分离得到的MCH由17个氨基酸组成，其中两个Cys位点间形成的分子内二硫键使MCH 呈环状结构.MCH前体蛋白(proMCH)基因由3个外显子组成，编码生成165个氨基酸的多肽.proMCH在人和啮齿类中除经剪切生成MCH外，还生成另外两种生理功能不明的多肽：含有13个氨基酸NEI和含有19个氨基酸的NGE [13].MCH 主要分布于下丘脑侧面和未定带区域，发挥着许多生理功能：包括调节硬骨鱼类皮肤的颜色；调节下丘脑-垂体-肾上腺轴；刺激大鼠神经垂体分泌催产素等.最近研究发现MCH在调节体重方面发挥着重要的作用：转基因小鼠中过表达MCH将抵抗胰岛素且患有肥胖症；在脑室内注射MCH的大鼠进食过多，最终引发肥胖；基因工程肥胖鼠(ob/ob)以及禁食小鼠下丘脑中的MCH表达水平增高；MCH水平降低的小鼠食量减少，代谢率增高，最终导致体重减轻和脂肪含量下降[14].为了研究整个MCH的功能，本研究克隆了MCH前体蛋白基因.pEGFP-C1载体具有容易转染真核细胞，对目的蛋白的生物学功能和宿主细胞的生长无影响等特点，其中的报告基因绿色荧光蛋白有利于示踪和检测所克隆的目的基因，并且荧光蛋白稳定表达.该载体全长4.7 kb，其中含有的CMV启动子和SV 40 polyA加尾信号具有高效的转录调控作用，多克隆位点有利于外源基因的插入，抗性基因可用于克隆或真核表达时的筛选.本研究将MCH基因克隆入pEGFP-C1载体，经酶切和测序鉴定，克隆的MCH质粒序列和预期相符，真核表达载体pEGFP-C1-MCH克隆成功.通过脂质体2000介导真核表达载体pEGFP-C1-MCH转染HEK293细胞，获得了高表达MCH的细胞株，该细胞株形态与生长速度与野生型HEK293细胞无差别，倒置荧光显微镜下观察以及RT-PCR结果显示，EGFP-MCH融合蛋白在细胞中稳定表达.该细胞模型的成功构建为后续研究MCH基因在能量代谢方面的功能创建了一个较好的细胞平台.参考文献【相关文献】[1] Kawauchi H,Kawazoe I,Tsubokawa M,et al.Characteri-zation of melanin-concentrating hormone in chum salmon pituitaries [J]. 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2024年人民版选修3生物下册月考试卷755考试试卷考试范围：全部知识点；考试时间：120分钟学校：______ 姓名：______ 班级：______ 考号：______总分栏题号一二三四五六总分得分评卷人得分一、选择题(共6题，共12分)1、在离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，下列哪一项条件是不需要的A. 消毒灭菌B. 适宜的温度C. 充足的光照D. 适宜的养料和激素2、将小鼠骨髓瘤细胞与一种浆细胞融合，融合的细胞经培养产生单克隆抗体，下列相关叙述错误的是（）A. 浆细胞只有与骨髓瘤细胞融合后才能产生抗体B. 浆细胞与骨髓瘤细胞融合常在聚乙二醇或灭活的病毒诱导下完成C. 获取浆细胞前，要给小鼠注射相应的抗原D. 如果细胞为两两融合，则培养液中一共可以收集到3种不同的融合细胞3、运用转基因技术，将奶牛细胞中编码凝乳酶的基因转移到大肠杆菌细胞中，达到大规模生产凝乳酶的目的。
下图表示用作运载体的质粒和目的基因所在DNA片段。
下列操作与实验目的不符的是。
A. 用限制酶BamHⅠ、PstⅠ和DNA连接酶构建基因的表达载体B. 用含氨苄青霉素的培养基筛选出的即为导入目的基因的细菌C. 可用PCR技术大量扩增目的基因D. 用Ca2+处理大肠杆菌使其易于转化4、下列叙述正确共几项（）①限制性内切酶的特点是识别特定的核苷酸序列和具有特定的酶切位点。
②上海医学遗传研究所成功培育出第一头携带白蛋白的转基因牛；可以想象这头牛发生了基因突变。
③根据mRNA的信息推出并获取目的基因的方法是用DNA探针测出目的基因。
④转基因抗虫棉的生产过程中不需要用到的工具是噬菌体。
⑤可以作目的基因“分子运输车”的是天然质粒。
⑥在基因操作的基本步骤中；不进行碱基互补配对的是将目的基因导入受体细胞。
⑦培育成抗除草剂的作物新品种；导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。
⑧基因工程常用细菌等原核生物作受体细胞的原因包括繁殖速度快、遗传物质相对较少、多为单细胞，操作简便A. 三B. 四C. 五D. 六5、为增加玉米抗旱性，研究者构建含有某微生物抗旱基因E的重组质粒，采用农杆菌转化法转入玉米幼胚组织细胞中，用E蛋白的抗体进行抗原-抗体杂交检测后，经进一步鉴定，筛选出抗旱的转基因玉米。
2024年浙教版选修3生物下册阶段测试试卷140考试试卷考试范围：全部知识点；考试时间：120分钟学校：______ 姓名：______ 班级：______ 考号：______总分栏题号一二三四五总分得分评卷人得分一、选择题(共6题，共12分)1、下列叙述符合基因工程概念的是（）A. B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因B. 将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C. 用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D. 自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上2、下列关于基因工程应用的叙述，正确的是（）A. 基因治疗就是把缺陷基因诱变成正常基因B. 基因诊断的基本原理是DNA分子杂交C. 一种基因探针能检测水体中的各种病毒D. 原核基因不能用来进行真核生物的遗传改良3、下列有关基因工程技术的原理或实质的叙述，不合理的是（）A. 基因诊断的基本原理是DNA分子杂交B. 基因治疗的原理是将正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能C. DNA 探针技术的原理是探针与样品中变性处理的 DNA 单链配对杂交D. 构建基因表达载体的实质是基因突变4、下列关于“试管牛”培养流程的叙述，错误的是（）A. 在③之前要对代孕母牛进行超数排卵处理B. 为了提高胚胎的利用率可以在过程③之前进行胚胎分割处理C. 大量的研究已经证明，过程③基本不会发生免疫排斥反应D. 移入受体的供体胚胎的遗传特性，在孕育过程中不受任何影响5、下列关于哺乳动物胚胎工程和细胞工程的叙述，正确的是（）A. 为获得更多的胚胎，往往采用激素注射促进雄鼠同期发情B. 将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞C. 细胞培养和早期胚胎培养的培养液中通常添加血清等物质D. 体外受精是指获得能量的精子和成熟的卵细胞在相应溶液中受精6、下列哪项不是人工授精和体外受精的区别（）A. 人工授精能更有效地发挥公畜的优良特性B. 体外受精能更有效地发挥母畜的繁殖潜能C. 人工授精和体外受精的本质不同D. 人工授精与体外受精中精卵结合分别在母畜体内和体外评卷人得分二、多选题(共8题，共16分)7、人绒毛膜促性腺激素（ HCG）是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白；制备抗HCG单克隆抗体可用于早孕的诊断。
