基因克隆主要载体系统

基因克隆技术的基本步骤随着科技的不断发展，基因克隆技术越来越成为生命科学研究的重要手段。

在生命科学、医学等领域，基因克隆技术的应用十分广泛。

本文将介绍基因克隆技术的基本步骤。

一、选择载体DNA在基因克隆中，载体DNA是将外源DNA（待克隆DNA）转化进细胞的基础。

目前主要的载体DNA是质粒，其一般大小在1至20 kb之间。

质粒的选择应遵循以下几个原则：1. 合适的选体标识。

大多数载体都有一些明显的特征，例如特定的抗生素抗性或颜色，因此选择能够用于筛选的选体标识是基本原则之一。

2. 合适的克隆位点。

载体DNA上应具有克隆位点，以便将待克隆DNA插入到其中。

3. 可重复复制。

质粒必须带有在细胞内自我复制所必需的序列。

二、切割DNA通过限制性内切酶切割将待克隆DNA和载体DNA裂解成短的DNA片段。

这些片段在电泳时可以按照大小区分开，以便以后的克隆工作。

三、将外源DNA插入载体DNA外源DNA和载体DNA的连接需要使用DNA连接酶，如DNA ligase。

方法是将两个DNA片段的末端和连接起来形成一个完整的DNA分子。

连接成功后，形成了一个混合DNA。

由于载体的复制和传递，待克隆DNA也可以被大量复制。

四、将混合DNA转化进宿主细胞将混合DNA转化进宿主细胞是整个克隆过程中至关重要的一步，因为宿主细胞受到质粒的干扰，催化质粒遗传信息的传递与表达。

大多数质粒都需要在易感受性细胞中才能存在并复制。

宿主细胞的选择是非常重要的，有些宿主细胞对外源DNA的吸收和扩增效率非常高，充分利用每一个获得的外源DNA分子。

五、筛选克隆基因最后一步是克隆基因的筛选，筛选克隆基因需要具有合适的筛选方法。

常用的筛选方法是使用抗生素抗性，因为载体上通常带有抗生素基因，能够筛选那些携带载体克隆块的细胞。

克隆基因的筛选方法不止于抗生素抗性，还可以根据不同的克隆目标进行选择。

例如，当克隆目标是蛋白质时，可以使用融合蛋白法克隆兴趣的编码DNA，并利用其蛋白质结构的特点分离出融合蛋白。

基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col 质粒。

①F质粒又叫F因子或性质粒( sex plasmid )。

它们能够使寄主染色体上的基因和F 质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。

②R质粒通称抗药性因子。

它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。

③Col 质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。

它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。

大肠杆菌是一类可以使不带有Col 质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。

第一节质粒的一般生物学特性、质粒DNA细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。

绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子 (图4-1) 。

质粒 DNA 分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状， 但在一定的条件下又 可逆地整合到寄主染色体上， 随着染色体的复制而复制， 并通过细胞分裂传递到 后代。

环形双链的质粒 DNA 分子具有三种不同的构型 ： 1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形 DNA （cccDNA ），这样的 DNA 通常呈现超螺旋的 SC 构型 ；2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现 有一至数个缺口时，称之为开环 DNA （ocDNA ），此即 OC 构型 ；3．若质粒 DNA 经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线 性分子（ IDNA ），通称 L 构型（见图 4-2 ）。

在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒 DNA ，尽管分子量相同，仍具 有不同的电泳迁移就绪。

其中走在最前沿的是 SC DNA ，其后依次是 L DNA 和OCDNA（图4-3 ）。

凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator ）、选择性记和克隆位点。

简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。

常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。

根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。

质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。

2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。

病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。

3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。

人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。

4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。

原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。

克隆载体是指在基因工程中用来携带和复制目标基因的一类DNA分子。

它具有以下基本结构：
1.起始子：克隆载体中通常包含一个起始子，用于启动基因表达。

起始子通常是一段特定的DNA序列，可以与细胞的转录因子相互作用，从而使目标基因开始转录。

2.复制起点与选择标记：克隆载体中含有复制起点，该起点可以被细胞内的DNA 复制酶识别并复制。

此外，常会在载体中引入选择标记，如抗生素抗性基因，用来筛选带有载体的细胞。

3.多克隆位点：多克隆位点是载体中用来接受目标基因的特定位置。

常见的多克隆位点包括限制性内切酶切割位点、连接酶切割位点等。

通过在多克隆位点插入目标基因，可以实现基因的克隆和表达。

4.报告基因：有时候，克隆载体中还会引入报告基因，用于检测目标基因的表达情况。

报告基因通常是一种易于观察或测量的基因，如荧光蛋白基因，它可以发出特定颜色的荧光。

总的来说，克隆载体的基本结构是由起始子、复制起点与选择标记、多克隆位点和报告基因等组成。

通过这些结构的设计和组装，可以方便地进行目标基因的插入、复制和表达。

简述基因克隆主要过程基因克隆是指将一个特定的基因从一个细胞或生物体中复制并插入到另一个细胞或生物体中的过程。

这项技术的发展为生物学和医学研究提供了重要的工具，也给基因治疗和转基因技术等领域带来了巨大的希望。

下面将以简述的形式介绍基因克隆的主要过程。

基因克隆的主要过程可以分为以下几个步骤：1. 提取DNA：首先，需要从源细胞或组织中提取目标基因的DNA。

这可以通过破碎细胞壁和细胞膜来释放DNA分子。

常用的提取方法包括化学法、机械法和酶法等。

2. 制备载体：接下来，需要准备一个载体来携带目标基因。

载体可以是环状的质粒DNA或病毒基因组。

质粒是一种小型DNA分子，它可以在细胞内自主复制，并且可以被插入到其他细胞中。

病毒基因组则是利用病毒的自身复制机制来传递基因。

3. 限制性内切酶切割：为了将目标基因插入到载体中，需要使用限制性内切酶来切割DNA。

限制性内切酶是一种能够识别特定DNA 序列并切割它们的酶。

通过选择适当的限制性内切酶，可以将目标基因和载体的DNA分子切割为互补的粘性末端。

4. 连接目标基因和载体：将目标基因和载体的DNA分子连接起来，可以使用DNA连接酶。

这种酶可以将目标基因和载体的DNA分子的末端粘性连接在一起，形成一个完整的复合DNA分子。

5. 转化或转染：将连接好的复合DNA分子引入到目标细胞中。

转化可以通过热激冲击、电穿孔或化学方法等多种方式实现。

转染则是将复合DNA分子包装成特定的脂质体或使用病毒作为载体，将其引入到细胞内。

6. 筛选和鉴定：在转化或转染后，需要对细胞进行筛选和鉴定，以确认是否成功插入了目标基因。

常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选和PCR扩增等。

通过筛选和鉴定，可以确定哪些细胞成功地表达了目标基因。

7. 扩增和表达：成功鉴定出含有目标基因的细胞后，可以将这些细胞进行扩增和培养。

这样可以获得大量表达目标基因的细胞，并进一步研究其功能和应用。

总结起来，基因克隆的主要过程包括提取DNA、制备载体、限制性内切酶切割、连接目标基因和载体、转化或转染、筛选和鉴定，以及最终的扩增和表达。