下载文档原格式
一、稀释引物1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）2、根据OD值加DD水。
3、静置30min（冰上）4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。
5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。
二、跑MIX检测引物（20ul体系）、上引物0.8ul下引物0.8ulMix 10ulDNA（日本晴）1ulDD水7.4ul三跑高保真酶（50ul体系）DNAorCDNA 2ul上引物2ul下引物2ul5*buffer 10uldNTPs 5ulDD水28ulPfu（最后加）1ul四胶回收流程1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。
2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。
3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。
4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。
5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。
7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。
8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。
五、胶回收产物检测（10ul）体系上引物0.4ul下引物0.4ulMix 5ul回收产物1ulDD水 3.2ul六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）胶回收产物 3.5ulBlunt cloning 0.5ul混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃之后转化1、提前5min从-70℃冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻5min。
2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约剩5min左右，打开水浴锅预热到42℃，并拿出SDC 培养基解冻（室温解冻）。
3、水浴锅42℃，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要摇动离心管。
一部分：概念解析二部分：问题解答克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
克隆载体
基因间隔区（intergenic region, IG 区）基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，内含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。
② IG区内只有一个Bsu I 切点。
（2）加入酶切位点，在IG区内加入单一内切酶位点。
M13mp1 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（-肽序列)。
使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。
而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有 kb
考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。
能像
-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力粘粒（cosmid）是带有 cos 序列的质粒。
cos序列是噬菌体 DNA 中将DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。
黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（amp r），cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。
克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。
有的粘粒载体含有两个cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。
质粒载体总结
λ噬菌体载体
表达载体。
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。
)
其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。
由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。
真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。
加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。
是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan）
克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。
但不具备表达元件。
而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。
克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。
1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。
2. 载体的分类
按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。
它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。
（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。
按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.
克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.
问题：
基因工程中有克隆载体和表达载体，克隆载体可以在受体菌中大量复制，表达载体用于表达目的蛋白，那么实际应用中，我们的最终目的是要得到目的蛋白，克隆载体不能完成表达，有何用呢？还是说利用克隆载体实现目的基因的大量复制后，再将其转移到表达载体中实现表达？它是否有何缺陷不能整合克隆载体的功能？构建兼有克隆和表达双重功能的载体有何困难？
1.克隆的目的比较单一，就是将你感兴趣的DNA片段，重组进入载体，然后于宿主细胞中大量繁殖，主要用于各种文库的建立，比如人类基因组计划；同时由于载体所能容纳的目的片段的长度是有限的，而克隆载体没有表达所需的各种片段，所以可以容纳更长的目的片段，即可以克隆足够长的基因，效率更高。
2.重组DNA需要使用限制性内切酶，因此待克隆的目的片段两端必需有其识别位点，现在的T/A克隆载体可以直接克隆PCR产物，省去了两端加装识别位点的设计，PCR效率就更高。
3.表达载体的目的是多样化的，为了实现实际工作中的需要，不同的目的就要设计不同的载体，用表达载体克隆基因不是不可以，实际工作中要考虑更多，因此更复杂。
4.细菌摄取能量的能力是一定的，如果用来合成大量蛋白质，合成核酸就会少。
5.细菌承受的工作负荷也是有限的，给它的工作太多，效率必然低下，这和我们日常生活是一个道理。
原因很简单，不是不能，是完全可以，但是效率会低很多。
所以我们一般的策略是，将目的片段克隆于非常简单的克隆载体上，按照需要再亚克隆于可以满足各种要求的表达载体上。
回答的不是很系统，如有问题可以继续来信讨论，希望对你有所帮助。
1)
2)“T/A克隆载体可以直接克隆PCR产物，省去了两端加装识别位点的设计，PCR效率就
更高。
”是什么意思？
T/A克隆载体是PUC载体的线性化后两端加了T，而Taq酶有在PCR产物后随机加A的特性，所以PCR产物直接可以接入T载体。
而经典的克隆PCR产物需要限制性内切酶切割后接入载体，所以在设计PCR引物时两端要加酶的识别位点，而加装的序列与模板不配对，因此PCR效率会低很多。
3)
4)克隆载体只是为了得到大量的目的基因，而现在多用PCR就可以达到这个目的。
那这
个目的基因的主要用途是什么？只用来测序吗？表达载体应该兼有克隆与表达的功能的吧？
嗯，基本是这个意思。
就测序不克隆也可以进行，克隆到载体的CMS中就在基因两端有了可供你选择的很多限制性酶切位点，方便亚克隆到各种表达载体上。
当然表达载体可以克隆，但是效率低于克隆载体。
一是因为表达载体不能直接克隆PCR产物，必须加装限制性酶切识别序列，上面已经讲过。
二是表达载体的选择相对克隆载体是更加严谨型的质粒，就是每个细菌里的拷贝数较低，能量守恒，细菌摄取能量的能力是一定的，用来合成蛋白质，核酸的合成必然受一定得限制。
5)我要构建一个基因的载体，
1.我可以将目的基因（1.3kb左右）和表达载体分别作酶切后连接吗？这几天将目的基
因做了一个T载体连接，可是不知道下一步怎么利用？
2.设计引物的时候用了sac1和hind111，做pcr的时候可以用pfu酶吗？pfu酶是必
须的吗？
3.我选择的表达载体上sac1和hind111的酶切位点只是相差两个碱基，做双酶切的时
候能切开吗？
1.如果你的目的基因已经在T载体上，当然可以分别酶切后连接，但是要注意方向。
2.如果是T载体连接PCR的引物可以不设计酶切位点。
T载体可以直接连接PCR产物源
于其末端错加的A，所以不能使用高保真的PFU。
但是你的扩增片段较长，如果用一般的TAQ酶，合成中可能会出错，用PFU准确度高，需要设计酶切位点。
如果PCR产物设计了酶切位点就可以直接克隆进需要的载体，不必借助T载体。
文献上有报道，按1：1的比例混合使用PFU和TAQ效果更好。
3.应该能切开，因为设计引物时保护碱基也就2到3个，但是最好稍微距离远一点。
