抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶测定实验方法抗氧化酶是一类酶系统，它能够抵御氧自由基的伤害，维持细胞内环境的稳定。

常见的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(Cat)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等。

测定抗氧化酶活性能够评估抗氧化能力，进而为疾病的诊断和治疗提供参考。

以下是抗氧化酶测定的实验方法。

实验材料：1.磷酸盐缓冲液：Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH7-8)。

2.高速冰箱和离心机。

3. 0.1 mol/L L-酪氨酸盐酸缓冲液：将L-酪氨酸溶解于0.1 mol/L的盐酸溶液中，并加入0.5% (w/v) 卵白饼干碎片。

4.超氧化物解毒酶(SOD)标准品：如肝脏SOD标准品。

5.乙醇、乙醚、碘仿、硝酸等有机试剂。

6.2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-（二苯嘧啶)-2H-四唑(INT)。

实验步骤：1.组织预处理：取所需组织样品，酶解和离心得到提取液(组织块破碎并添加合适的缓冲液)，离心清除杂质得到上清液。

2. 蛋白质含量检测：根据Bradford法或Lowry法，测定上清液中蛋白质的含量。

3. 测定SOD活性：将上清液加入0.1 mol/L L-酪氨酸盐酸缓冲液，再加入0.5%的乙醇溶液，保护酪氨酸被SOD氧化，使其在酶作用下发生自动降解。

离心，取上清液。

在为反应液中加入INT（2.5 mmol/L），使之在SOD作用下发生氧化还原，反应生成紫色的一价酮衍生物。

在滤紙上滴加提取液，通过比色计测定OD值。

4. 测定Cat活性：将提取液加入3%的过氧化氢溶液并充分混合。

加入乙醚和碘仿的混合物，并离心。

提取水相层和乙醚层。

用硝酸溶液判断乙醚层中是否存在过氧化氢。

通过测定乙醚层吸收光谱的变化来测定Cat 活性。

5. 测定Gpx活性：加入适量的提取液到预先调配的反应体系中。

反应开始后，每2分钟测定OD值，记录10分钟之间的OD变化。

绘制OD值和反应时间的曲线，计算反应速率。

6.数据处理：根据测得的OD值和各反应时间点得到的反应速率，计算出抗氧化酶系数和活性。

棉花叶片和根系中SOD、POD、CAT、MDA的测定研究表明逆境胁迫可使植物体内活性氧的产生和消除平衡失调，造成植物体内大量的自由基累计，进而膜脂结构的损伤和加速植物的衰老进程。

测定植物体内膜脂过氧化产物MDA的含量及植物体内抗氧化酶SOD、POD的活性高低，可在一定程度上反映逆境对植物的损害程度合作植物的衰老进程。

关于干旱、渍水、盐害和高温等逆境胁迫对作物候期衰老的影响的研究已有不少报道，但是在不同根土空间对作物衰老方面的研究尚不多见。

张永清等研究表明高粱在不同根土空间下，根土空间缩写降低了SOD、POD的含量，而对于不同配置及水分条件下棉花根系及地上部生理活性的研究较少因此探讨不同根系空间条件下对棉花根系生理特性、棉花后期衰老的影响。

测定部位：地上部：倒四叶地下部：上层（0-20cm）中层（20-40cm）下层（40-80 cm）根样一磷酸缓冲液的配制：A液：0.2M的KH2PO4溶液称取分析纯KH2PO427.216克，用蒸馏水定容至1000毫升。

B液：0.2M的K2HPO4溶液称取分析纯K2HPO4•3H2O45.644克，用蒸馏水定容至1000毫升。

或（A液：0.2M的NaH2PO4溶液称取分析纯NaH2PO4•2H2O 31.21克，用蒸馏水定容至1000毫升。

B液：0.2M的Na2HPO4溶液称取分析纯Na2HPO4•12H2O 71.64克，用蒸馏水定容至1000毫升。

）二、酶液的制备：称取0.5g放入研钵中，加5毫升PH=7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，冷冻离心20分钟（10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于0~40C下保存待用。

SOD（超氧化物歧化酶）的测定：1.SOD反应液的配制：母液的配制：（1）0.05M 磷酸缓冲液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;(2) 130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met 用磷酸缓冲液定容至100ml；（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；(4) 100μM EDTA-Na2: 取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，避光保存；(5) 20μM FD (核黄素): 0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）L磷酸缓冲液(PBS，：A母液：L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量）71.7g；B母液：L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

L PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）甲硫氨酸溶液：取 Met用磷酸缓冲液（）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）氮蓝四唑(NBT)溶液：取 NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

酶液制备：取（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液，磷酸缓冲液，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。

（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。

SOD，POD,CAT测定方法抗氧化酶活性的测定：（2.5g样）0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285gNaH2PO4·2H2O, 定容到4L。

（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。

取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L 磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。

1超氧化物歧化酶（SOD）的测定：NBT(400ml)混合反应液:392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。

（另配）100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。

2过氧化物酶（POD）的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975gNaH2PO4·2H2O,定容到1000ml。

0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。

0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。

2ml 0.3%H2O2溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)+ 0.02ml？？（原来为0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处OD降低速度。

SOD酶活性测定方法SOD酶是一种重要的抗氧化酶，在许多生命体中都有着非常重要的作用。

SOD酶能够对细胞内的超氧自由基进行清除，保护细胞免受氧化应激的损害。

因此，SOD酶活性的测定是很多研究人员关注的焦点。

本文将介绍SOD酶活性测定的方法。

SOD酶活性测定的原理主要是通过测定样品中SOD酶对脱氧核糖酸（XOD）和尼群胺试剂产生的还原性物质的分解作用，来计算出SOD酶的活性。

测定方法分为以下几个步骤：第一步，SOD酶通过去除XOD产生的超氧自由基，阻止其与尼群胺试剂生成的有色产物，使产物浓度降低。

第二步，根据剩余的尼群胺的吸光度，来计算SOD酶活性。

（1）样品处理在SOD酶活性测定中，样品的预处理是非常关键的一步。

需要先收集待测样品，然后用磷酸盐缓冲液进行稀释。

在处理样品时，需要避免样品受到氧化应激的影响。

（2）制备反应体系制备反应体系时，需要将缓冲液、XOD和尼群胺试剂混合均匀，制成成分均匀的混合试剂。

（3）干预试验可以分别加入干预物处理组和对照组。

在干预试验组中添加抑制SOD酶活性的干预物，如受体拮抗剂、抗氧剂、树脂酶等，观察加入干预物前后尼群胺吸光度的变化。

（4）添加待测样品和对照组将先前处理好的待测样品和对照组加入准备好的反应体系中。

将混合样品放入莫耳隔水器中，设定温度为37℃，反应30分钟左右。

（6）吸光度测定在反应结束后，对每个样品分别进行吸光度测定，以获取尼群胺吸光度。

比较不同样品的吸光度，用相应的计算公式进行计算，得出SOD酶活性值。

3. 结论通过以上步骤，可以测定出待测样品中SOD酶的活性。

建议在进行实验时，需按照实验操作规程严谨操作，做好内、外参照品的对比，能最大程度保证数据真实准确，为后续的实验提供有力的支持。

抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。

其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。

测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。

本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。

1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。

常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。

-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。

-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。

2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。

常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。

-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。

-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。

3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。

常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。

-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。

4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。

常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。

抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类能够帮助生物体减轻或消除自由基对细胞和组织的损伤的酶。

其中三个主要的抗氧化酶分别是超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)。

测定这些抗氧化酶的活性可以帮助我们了解细胞和组织内抗氧化能力的变化，从而评估对抗氧化应激的能力。

以下是常用的测定这些抗氧化酶活性的方法。

1.NBT法：超氧化物歧化酶能够催化过氧化脱氢麦角酮（NBT）被还原成紫色水溶性产物，通过测定产物的吸光度来确定SOD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的NBT缓冲液。

（2）开始反应：置于适当的温度和时间下。

（3）停止反应：加入硝酸，停止NBT的还原反应。

（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。

2.氰化硝酸法：该方法是通过抑制SOD对自由基的清除作用，使过氧化物离子被产生，进而通过测定过氧化物离子的吸光度来间接测定SOD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的氰化钾和亚硝酸钠。

（2）开始反应：加入适量的氧化剂，使之和SOD反应生成过氧化物。

（3）测定吸光度：使用分光光度计测量过氧化物离子产生的相对吸光度。

1.亚硫酸盐法：过氧化物酶能够催化亚硫酸盐氧化成差二价铁离子，通过差二价铁离子与硫酸铵生成蓝色络合物来测定POD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的亚硫酸铵和硫酸。

（2）开始反应：加入适量的H2O2，使之和POD反应生成差二价铁离子。

（3）停止反应：加入硫酸铵，停止POD对H2O2的催化作用。

（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。

2.过氧化氢法：过氧化物酶能够催化过氧化氢分解成氧气和水，通过测定生成的O2的相对浓度来测定POD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的过氧化氢。

（2）开始反应：加入过氧化物酶，使之和过氧化氢反应。

抗氧化酶测定实验方法抗氧化酶是一类能够抵御细胞对氧自由基的毒性的酶。

抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。

这些酶在细胞内能够将有害的氧自由基转化为无害的化合物，从而起到保护细胞免受氧自由基反应的毒性作用。

因此，测定抗氧化酶的活性能够反映细胞对氧自由基的抵御能力，对研究氧化应激、疾病发生机制等具有重要意义。

以下是一种常用的抗氧化酶测定方法的详细步骤：实验材料和试剂：1.组织样本或细胞培养物2.生理盐水（PBS）3. 超氧化物歧化酶(Abfrontier, LF-MA0011, 200U/mg, 冻干粉)4. 过氧化氢酶(Sigma, P2927, ≥2,000,000 units/mg protein, 溶于水)5. 谷胱甘肽过氧化物酶(Sigma, G5911, ≥300 units/mg protein,冻干粉)6. 过硫酸铵（Sigma, A9294）7.磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.1M)8.丙酮9. 硫酸(Sigma, 1.84 M)10. 精氨酸(Sigma, A8094)11. 苯胂(Sigma, A8731)12. 硝基蓝色素(Sigma, N-5511)14. 高锰酸钾(Sigma, S2547)16. 硝基咪唑(NBT，Solarbio, S8190)17. EDTA二钠(Sigma, E6635)18. BSA(Sigma, A7906)19. 氯化三联氨(Sigma, A2251)20. Tris缓冲液(pH 8.0，0.1M)21. 高吉人(ABClonal, HRP-6002，5,000 IU/mg, 冻干粉)23.氯仿24.醋酸乙酯26.乙酸钠28. 脑磷脂(纯度≥98%，Shenggong, 1003J)30.SDS-试剂盒步骤：1.制备样本：将组织样本或细胞培养物均匀取样，使用PBS洗涤并平均分配到多个离心管中。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

A液：0.2 mol/L Na2HPO4-12 H2O 71.64g定容至1000mlB液：0.2 mol/L NaH2PO4-2H2O 31.2g定容至1000ml1、超氧化物歧化酶SOD活性测定0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)取A液228.75ml，B液21.25ml定容至1000mL。

130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：称取1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100mL750u mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100mL，用前配避光100u mol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000mL。

用前配置，避光保存。

20u mol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，用前配置，避光2、过氧化物酶POD活性测定愈创木酚、30%过氧化氢、100m mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）：分别取贮备液A：0.2 mol/L Na2HPO46.15mL溶液与贮备液B ：0.2 mol/L NaH2PO4溶液43.85mL充分混匀定容至100mL。

20m mol/L KH2PO4：称取0.681g KH2PO4定容至250mL.3、过氧化氢酶CAT活性测定0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液,取A液91.5ml，B液8.5ml,充分混合。

0.1mol/LH2O2以30%的过氧化氢配制：30%的过氧化氢密度为1.1g/立方厘米,分子量为34.01,据理推算:(30*1.1g/34.01)mol/100ml=9.7mol/L30% PEG6000配置方法如下：称取300gPEG，溶于一定量的水中，最后定容之1000ml，即为所需的30%PEG的溶液。

植物组织中丙二醛（MDA）含量的测定一、原理植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。

MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。

因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。

丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。

二酮)，其最大吸收波长在532nm。

但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。

植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。

低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0．5umol·L-1。

二、方法直线回归法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度值为零。

不同浓度的蔗糖(0—25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的吸光度值。

UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为：Y532＝-0．00198十0．088D450 (44—1)D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。

其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。

测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。

本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。

1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。

常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。

羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。

2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。

酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。

常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。

离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。

上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。

蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。

叶绿体得提取一、试剂配置1、PBS提取液:每L水依次加入MES(195、2×0、05=9、76g)、山梨糖醇(0、33×182、2=60、126g)、NaCl(0、010×58、5=0、585g)、MgCl(0、002×95=0、19g)、EDTA(292、25×0、002=0、5845g)、KH2PO4(200×0、0005=0、1g);使用时加入ASA-Na(198、1×0、002=0、3962g);2、悬浮液:将PBS提取液中得MES换为238、3×0、05=11、915g得HEPES(238、3×0、05=11、915g);3、80%Percol:80ml原液+20ml水;40%Percol:40ml原液+60ml水;实际配制:PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml(3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml);80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml、(3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml)二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS(50mM MES PH6、1,含0、33M山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0、5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,4层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎)3、滤液2000g 3min,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2-3min左右完成;4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物;5、用1ml悬浮液(50mM HEPES pH 7、6,含0、33 mM山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0、5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。

叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl （0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。

叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl （0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。

实验一植物抗氧化酶活性的测定植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等。

它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。

所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。

一、超氧化物岐化酶活性测定超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（）的酶，它催化下列反应：2反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。

已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。

【原理】本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。

后者在560nm处有最大吸收，而SOD可清除从而抑制了甲的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

一个酶活性单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。

【仪器与用具】高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管数支；黑色硬纸套。

【试剂】1．50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。

2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。

3．130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml。

4．750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取61.33m g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，现配先用，避光保存。

5．100μmol/L EDTA-Na2溶液：取37.21m g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。

6．20μmol/L核黄素溶液：取7.53m g核黄素定容至1000ml避光保存。

抗氧化酶（ SOD、 POD、 CAT ）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD ）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1） 0.05mol/L 磷酸缓冲液 (PBS ， pH7.8) ：A母液： 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 : 取 Na2HPO4·12H2O（分子量 358.14） 71.7g；B母液： 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO4·2H2O（分子量 156.01） 31.2g。

分别用蒸馏水定容到 1000ml 。

0.05mol/L PBS （ pH7.8 ）的配制：分别取 A 母液 (Na2HPO 4) 228.75ml ，B 母液 (NaH 2PO4) 21.25ml ，用蒸馏水定容至1000ml 。

加入 10gPVP （聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000： 267～ 268。

（2） 130mmol/L 甲硫氨酸溶液：取 1.399g Met 用磷酸缓冲液（ pH7.8 ）定容至 100ml 。

网上说定容到 100ML 我也不懂。

拜托（ 3）100μ mol/L EDTA-Na 2溶液：取 0.03721g EDTA - Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml ；（4） 100μM核黄素溶液：取 0.0075g 核黄素用蒸馏水定容至 100ml ，避光保存，随用随配，并稀释 10 倍（ 5）750μ mol/L 氮蓝四唑（ NBT ）溶液：称取 0.06133g NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml 。

取 5ml 于 10000r/min 下离心10min ，上清液即为SOD 粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。

抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法抗氧化酶SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）和CAT（过氧化氢酶）是植物体内重要的抗氧化酶，在植物的抗逆境应对中起着重要的作用。

因此，对这些抗氧化酶的活性进行测定和分析是研究植物生理生化过程的重要方面之一测定抗氧化酶活性的方法一般分为两类：直接法和间接法。

直接法是通过测定一些特定底物的降解速率来反映酶的活性；间接法是通过测定酶催化底物形成的产物的生成速率来间接反映酶的活性。

下面将分别介绍抗氧化酶SOD、POD和CAT活性的测定方法。

1.SOD活性测定方法：SOD活性测定方法主要分为NBT法和EPX法两种。

（1）NBT法：这是一种直接法，其基本原理是SOD将还原型的NBT 还原成穆尔蓝染色形成具有最大吸收峰值的NBT离子。

实验步骤如下：a.首先准备SOD底物溶液，其组成为：50mM磷酸缓冲液（pH7.8）+13mML-甲硫氨酸+75μM硝基蓝硝酸盐（NBT）。

b.将样品加入上述的SOD底物溶液中，混匀。

c.加入适量的酶抑制剂，使停止酶的活性，并将其放在冰上。

d.使上述反应在37℃下进行10分钟。

e.加入已经冷却的硝酸亚铁和磷酸以停止反应，并将其放在冰上10分钟。

f. 测定变色液的吸收光谱在560 nm波长处的吸光度。

（2）EPX法：这也是一种直接法，其基本原理是SOD将乙酸型形成的4-无水乙烯甲基-3-硝基噻吩染色。

实验步骤如下：a. 首先在试管中加入1 ml乙酸型测定液。

b.分别加入适量的SOD样品。

c.在30分钟内使试管中乙酸型完全消除。

d. 测定出试管中产生的4-乙烯基-3-硝基-5-硝基噻吩的吸收光谱在260 nm波长处的吸光度。

2.POD活性测定方法：POD活性测定方法可分为直接法和间接法。

（1）直接法：这种方法基于过氧化反应的特点，利用dianisidine 与过氧化氢在催化剂POD作用下形成有色产物的现象来测定POD的活性。

实验步骤如下：a.在试管中加入0.1M磷酸盐缓冲液（pH6.0）。