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肥料中复硝酚钠的测定高效液相色谱法警告：本标准有可能涉及到有害物质、危险操作和设备的安全。
本标准并未指出所有可能的安全问题。
使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的要求。
1 范围本标准规定了肥料中复硝酚钠的高效液相色谱法。
本标准适用于水溶肥料、复混肥料、掺混肥料、配方肥料中复硝酚钠的检测。
称样量为1.0 g时，方法中复硝酚钠检出限为3 mg/kg。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法3 原理试样中复硝酚钠用甲醇进行超声提取，以甲醇-甲酸溶液为流动相，在选定的工作条件下，用高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器）进行测定，外标法定量。
4 试剂和材料本标准中试验用水应符合GB/T 6682中一级用水的规格。
4.1 甲醇：色谱纯。
4.2 甲酸：分析纯。
4.3 甲酸-水溶液（1+1 000）：移取1.0 mL甲酸（4.2）与1 000 mL水混匀。
4.4 2-硝基苯酚钠标准品：已知质量分数，ω≥98.0 %。
4.5 4-硝基苯酚钠标准品：已知质量分数，ω≥98.0 %。
4.6 5-硝基邻甲氧基苯酚钠标准品：已知质量分数，ω≥98.0 %，2-硝基苯酚钠、4-硝基苯酚钠、5-硝基邻甲氧基苯酚钠信息一览表见附录A中表A.1。
4.7 复硝酚钠标准溶液：称取2-硝基苯酚钠、4-硝基苯酚钠、5-硝基邻甲氧基苯酚钠标准品，用甲醇（4.1）配制成各个标准物质浓度为1 000 mg/L的混合标准溶液，现用现配。
5 仪器与设备5.1 高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器和色谱数据处理机。
5.2 微量注射器：50 μL。
5.3 漩涡混合器。
5.4 高速离心机：最高转速不低于6 000 r/min。
5.5 超声波清洗器。
收稿日期：2022-10-11作者简介：杨丽，女，1996年生，助理工程师。
*通信作者：马义虔，男，1989年生，硕士，中级工程师。
超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中硝基呋喃类代谢物杨丽，王雪蓉，陈大鹏，杨燕红，马义虔*贵州省产品质量检验检测院，贵阳550016摘要[目的]建立超高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS ）测定鱼肉中呋喃它酮（AMOZ ）、呋喃西林（SEM ）、呋喃妥因（AHD ）和呋喃唑酮（AOZ ）4种硝基呋喃代谢物的检测方法。
[方法]试样经2-硝基苯甲醛衍生化，调节pH 值至7.0~7.5，经乙酸乙酯提取，5%甲醇水溶液定容，采用多反应监测（MRM ）模式，电喷雾正离子（ESI +）模式电离，内标法定量。
[结果]硝基呋喃代谢物在0.5~50.0ng/mL 范围内线性关系良好，相关系数>0.996。
方法检出限为0.5μg/kg ，3个添加水平（0.5、1.5、5.0μg/kg ）下的回收率在70%~120%范围内，相对标准偏差RSD 均小于10%。
[结论]该方法具有较好的准确性和稳定性，能够用于鱼肉中硝基呋喃代谢物的检测。
关键词超高效液相色谱-串联质谱法；鱼肉；呋喃它酮；呋喃西林；呋喃妥因；呋喃唑酮YANG Li,WANG Xuerong,CHEN Dapeng,YANG Yanhong,MA Yiqian *Guizhou Institute of Products Quality Inspection &Testing,Guiyang 550016,China[Objectives]To establish a method for the determination of furaltadone （AMOZ ）,nitrofura -zone nitrofurantoin （AHD ）and furazolidone （AOZ ）,four nitrofuran metabolites in aquatic prod -ucts by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS ）.[Methods]The samples were derivatized by 2-nitrobenzaldehyde,and the pH value was adjusted to 7.0-7.5.The samples were extracted by ethyl acetate,and 5%methanol in aqueous solution was fixed volume.The samples were detected by selective multiple reaction monitoring （MRM ）mode,ionized by electrospraypositive ion （ESI +）mode,and quantified by internal standard method.[Results]The nitrofuran metabolitehad a good linear relationship in the range of 0.5-50.0ng/mL,and the correlation coefficients （）betterthan 0.996,and the detection limit of this method was 0.5μg/kg.The recoveries rates were in the rangeof 70%-120%at the three supplemental levels （0.5,1.5and 5.0μg/kg ）,and the relative standard devi -时间/min A 05.00.8095.02.0095.02.01 5.03.00 5.0B95.05.05.095.095.0ation （RSD ）was less than 10%.[Conclusions]The results show that this method has good accuracy andbe used for the determination of nitrofuran metabolites in fish.UPLC-MS/MS;fish;furaltadone;nitrofurazone;nitrofurantoin;furazolidone硝基呋喃类药物是通过在呋喃核的5位引入硝基和2位引入其他基团而人工合成的抗菌药，主要有呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因[1]。
水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定—高效液相色谱法1 范围本标准规定了水产品中呋喃唑酮的代谢物3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、呋喃它酮的代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、呋喃西林德代谢物氨基脲（SEM）和呋喃妥因德代谢物1-氨基-2-内酰脲（AHD）残留量的的高效液相色谱测定方法。
本标准适用于水产品中呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物和呋喃妥因代谢物残留量的测定。
2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理试样中残留的硝基呋喃类代谢物用硝基呋喃类代谢物快速检测前处理试剂盒提供的试剂提取，经衍生化试剂衍生、经乙酸乙酯反萃、净化后用紫外检测器进行检测，外标法定量。
4 试剂和材料本标准所用试剂应无干扰峰。
除另有特别说明外，所用试剂均为分析纯；试验用水应符合GB/T 6682一级水的要求。
4.1 乙腈:色谱纯。
4.2 乙腈水溶液：乙腈+水=30+70（v/v）4.3 甲醇:色谱纯。
4.4 乙酸乙酯：色谱纯4.5 异丙醇：色谱纯。
4.6 庚烷磺酸钠：HPLC级。
4.7 异辛烷：色谱纯。
4.8 乙酸：色谱纯。
4.9 标准品: 氨基脲（SEM）、3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、1-氨基-乙内酰脲（AHD）：≧99%。
4.10 标准贮备溶液:准确称量各AMOZ、AHD 、AOZ、SEM各10 mg，用甲醇分别定容于100 mL容量瓶中，配制成100 µg/mL的标准贮备液。
4.11 混合标准工作溶液：使用前，取4.10标准贮备溶液用甲醇稀释成所需浓度。
高效液相色谱法检测饲料中7种硝基呋喃类药物张会彩;李军;闫晓东;刘静;王建平【摘要】@@ 硝基呋喃类药物是一类化学合成的广谱抗菌药物,因具有高效抗菌作用和促生长作用曾广泛应用于畜牧和水产养殖业中,但此类药物及其代谢物具有潜在的致癌和诱导突变作用.其中的呋喃唑酮(FZD)、呋喃西林(NFZ)、呋喃妥因(NFT)和呋喃它酮(FTD)在世界多数国家中被禁止用于食品动物养殖,硝呋索尔(NFS)于2002年被欧盟禁用,呋喃苯烯酸钠(NFSS)于2002年被中国禁用.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2011(047)005【总页数】3页(P72-74)【作者】张会彩;李军;闫晓东;刘静;王建平【作者单位】河北农业大学动物科技学院,河北保定071000;河北农业大学动物科技学院,河北保定071000;河北农业大学动物科技学院,河北保定071000;河北农业大学动物科技学院,河北保定071000;河北农业大学动物科技学院,河北保定071000【正文语种】中文【中图分类】S859.79+9.1硝基呋喃类药物是一类化学合成的广谱抗菌药物,因具有高效抗菌作用和促生长作用曾广泛应用于畜牧和水产养殖业中,但此类药物及其代谢物具有潜在的致癌和诱导突变作用。
其中的呋喃唑酮(FZD)、呋喃西林(NFZ)、呋喃妥因(NFT)和呋喃它酮(FTD)在世界多数国家中被禁止用于食品动物养殖,硝呋索尔(NFS)于2002年被欧盟禁用,呋喃苯烯酸钠(NFSS)于2002年被中国禁用。
由于没有资料表明硝呋酚酰肼(NFX)也具有相似毒性,因此,还没有国家发布对该药的禁令。
但由于此类药物具有高效廉价的特点,在畜牧和水产养殖过程中可能仍存在非法使用的情况,因此,监控硝基呋喃类药物的非法使用至关重要。
由于硝基呋喃类药物在动物体内代谢迅速,其代谢物以组织结合蛋白的形式持续存在,因此,许多报道的方法,如液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[1-3]和/或酶联免疫检测法(ELISA)[4-6]都主要针对呋喃代谢物。
气相色谱法检测鱼和虾中复硝酚钠残留量摘要：绿色饮食越来越成为社会普遍关注的问题，尤其是水产品的养殖过程中，一些商家为谋求经济利益，使用药物添加剂来促进鱼虾在短时期内快速生长，这给人们的健康带来严重威胁。
本文结合实验研究，论述了气相色谱法在检测鱼和虾中复硝酚钠残留量过程中的应用效果，以期能够为相关的实践提供些许理论参考。
关键词：气相色谱法复硝酚钠检测步骤效果复硝酚钠属于一种药物添加剂，具有促进生物生长的作用，在鱼虾养殖业中应用较多，实验室研究显示该种药物不具有强烈毒性，但是长期使用含有复硝酚钠的水产品，也会导致体内毒素不断积累，严重危害公众身体健康，为此，要建立一种科学有效的检测方式，判断其含量是否超标，气相色谱法比传统方式更具优势，具有使用价值。
一、气相色谱法检测复硝酚钠的具体步骤本次实验中使用型号为Agilent7890A气象色谱仪，并配有检测器、高速离心机、超声波清洗仪、旋转蒸发仪等设备，选取检测药物包括硝基酚钠标准品、2-甲氧基-5-硝基苯酚钠标准品、邻硝基酚钠标准品、乙酸乙酯、酸性氧化铝等，试验用品准备妥当后先取5克样品，调和均匀后放入50毫升的离心管内，再滴入约15毫升的乙酸乙酯，采用漩涡转动方式混合1分钟后，以每分钟4000转的速度离心运动10分钟，将上层的清液提取出来，装入离心管内，将乙酸乙酯滴入残渣中再次提取清液，并取5毫升乙酸乙酯进行淋洗。
随后在乙酸乙酯中添加4毫升规格为0.1mol/L的碳酸钾溶液，旋转1分钟混合均匀后取每分钟4000转离心运转10分钟，并将碳酸钾层放置50毫升的离心管内，再取4毫升碳酸钾溶液进行二次提取。
将标准溶液进行衍生化是极为关键的一步，先按照试验标准取一部分溶液，放置在比色管内，再添加6～8毫升的碳酸钾溶液，采用试样衍生化的方式重复操作过程，并将碳酸钾层转移到规格为25毫升的比色管中使用。
气相色谱柱使用型号为DB-1701毛细管柱，试样的进入温度为250℃，检测器的温度为300℃，刚开始测试温度控制在120℃，当持续15分钟后可升到180℃，接着延续20分钟后，温度可再升至250℃，并将此温度延续5分钟；采用氮气作为载体气体以及尾吹气，气体流动的速度每分钟控制在1.5毫升，进样时不必实施分流，吹扫与放空每分钟保持60毫升。
高效液相色谱—串联质谱法同时测定水产品硝基呋喃类代谢物残留硝基呋喃类代谢物属于一种人工合成的广谱抗菌药物，它主要包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮等.硝基呋喃类由于具有杀菌性而被广泛应用于畜禽和水产等动物传染病预防与治疗[13].该类药物半衰期短，在动物体内代谢速度快，与蛋白结合的代谢物产生稳定的残留，形成的代谢产物3氨基2噁唑烷酮（AOZ）、3氨基5吗咻代甲基2噁唑烷酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）、1氨基乙内酰脲（AHD）均可使动物发生癌变和基因突变，人类长期使用可对其健康产生危害[46]. 欧盟在1995年已全面禁止呋喃类抗菌药物作为生长剂和杀菌剂用在饲料中，我国也于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类药物的公告.由于硝基呋喃在动物体内代谢速度快，不容易在动物组织中被检测到，通过14C标记表明[7]，硝基呋喃代谢物在动物体内以蛋白结合物的形式存在，在体内能残留数周，这些结合残留物可通过在适当的酸性条件下释放出来，以达到检测硝基呋喃残留的目的[8].由于液相色谱串联质谱方法灵敏度高，前处理方法简单快速，可同时用于产品的检测和确证，农业部颁布了相关的标准采用液质法应用于食品当中硝基呋喃类代谢物的残留检测[910].该方法操作简单，成本较低，回收率满足要求，但是由于水产品成分比较复杂，基质中含有大量的脂肪、蛋白质等杂质，前处理过程中没有采取进一步的净化，流动相溶解后会有乳化现象产生，容易产生基质效应，而且会对仪器造成污染影响结果的准确性，导致假阳性的情况出现.本文建立了水产品中硝基呋喃类代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，通过在前处理过程中采取固相萃取柱进行净化，减少样品带来的基质效应，提高了色谱分析的功效，简单快速，灵敏度高，而且节约成本，能够实现药物残留的快速检测，可以满足水产品质检以及相关基础研究的要求.1实验部分1.1仪器与试剂Thermo TSQ Quantum液相色谱高分辨串联四级杆质谱联用仪（配用电喷雾离子ESI源）；旋转蒸发仪（瑞士布奇公司）；高速冷冻离心机（日本日立公司）；超声波清洗器（昆山超声波仪器厂）；精密电子天平（梅特勒—托利多称重设备系统XX公司）；微型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）.标准储备液的配置：分别称取硝基呋喃类标准品各10.0 mg，用甲醇溶解后转移至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配置成100 mg/L的标准储备液，在-18℃下避光保存.使用时将上述标准储备液混合，用甲醇稀释成0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L不同浓度的标准工作液.内标储备液及使用液的配置：分别称取10.0 mg各内标标准品，用甲醇溶解并定容，配成100 mg/L的标准储备液，在-18 ℃下避光保存.准确吸取各内标储备液，用甲醇逐级稀释配成0.01 mg/L的混合内标使用液，在-18 ℃下避光保存.1.2色谱质谱条件采用电喷雾离子源（ESI）；喷雾电压：41 kV；离子传输毛细管温度：350 ℃；碰撞气氩气压力：0.1 Pa；鞘气流量：40 arb；辅助气流量：30 arb；扫描模式：多反应监测（SRM）；硝基呋喃类代谢物的母离子、子离子和碰撞能量见表2.1.3样品前处理称取2 g样品至于50 mL离心管中（精确至0.01 g），加入200 μL 0.01 mg/L的混合内标溶液，再加入5 mL 0.2 mol/L 盐酸溶液和0.2 mL 0.5 mol/L 2硝基苯甲醛溶液，在漩涡混合仪上充分混合1 min.置于恒温水浴振荡器中（37 ℃）避光振荡16 h，取出离心管冷至室温，加入5 mL 1.0 mol/L磷酸氢二钾溶液，调节pH至7.0～7.5，加入8 mL正己烷漩涡混匀后放入离心机离心10 min（6 000 r/min），分层后取下层水相待过柱，固相萃取柱（HLB，3 mL，60 mg）依次用3 mL甲醇，6 mL水活化，取备用液过柱，采用在大气压力下自然过柱.过完样品后，加入3 mL水淋洗并抽干.用4 mL乙酸乙酯分2次洗脱，洗脱液于40 ℃氮气吹干后，加入1.0 mL流动相溶解残渣，再加入2.0 mL正己烷放入离心机离心5 min（5 000 r/min），取下层液体过0.22 μm滤膜，滤液供液相色谱质联用仪测定.2结果与讨论2.1前处理条件的选择及优化考察了甲醇与2 mmol/L的乙酸铵溶液不同体积比例（5∶95、10∶90、15∶85、20∶80）的混合液作为流动相时对目标物分析的影响，综合考虑目标物的响应值和出峰的时间、峰形的尖锐性，本文选择2 mmol/L的乙酸铵溶液：甲醇（V∶V=80∶20）为本实验的最佳流动相.由于水产品成分比较复杂，基质中含有大量的脂肪、蛋白质、碳水化合物以及色素等杂质.本文比较了在调节pH后加入8 mL正己烷离心和加入流动相后再加入2 mL正己烷离心2种不同的净化方式，这2种方式去脂的效果均不错，溶液也较澄清，但是第二种净化方式，回收率较低，在60%以下，第一种净化方式的回收率满足试验要求.2.2固相萃取实验固相萃取是一种色谱分离的前处理方法，主要依靠固相萃取柱来进行净化，不同的基质选择不同材料的固相萃取柱，填料的类型决定了吸附能力的大小以及回收率的高低，本文比较了4种不同的固相萃取柱（C18 500 mg/3 mL，HLB 60 mg/3 mL，MCX 150 mg/6 mL，AluminaN 60 mg/ 3 mL）对硝基呋喃类代谢物的净化效果，其回收率的结果见图1，本实验选用HLB柱作为硝基呋喃类代谢物的固相萃取柱，回收率均满足要求.固相萃取过程中的洗脱液一般选择甲醇、乙腈或者乙酸乙酯，本实验采用乙酸乙酯作为洗脱液，得到良好的洗脱效果.洗脱方式主要考察了一次4 mL、4 mL分2次以及9 mL分3次的3种洗脱方式，从实验结果（表3）来看，当用4 mL乙酸乙酯溶液进行洗脱时，目标物洗脱不完全，还有部分目标物在组合SPE 柱上没有被洗脱下来；当用分2次洗脱时（2×2.0 mL），目标物被完全洗脱，回收率良好；当用洗脱液分3次洗脱时（3×3.0 mL），回收率与2次洗脱淋洗时差不多，因此本实验选择操作简单、节约试剂的2×2.0 mL分2次洗脱的方式.2.3色谱条件的选择及优化流动相的pH值会影响目标物在色谱柱中的分离.本实验考虑采用挥发性电解质乙酸铵来做为流动相，同时加入0.1%甲酸控制流动相pH值，采用合适的梯度洗脱程序，不但很好地实现了各种目标物的分离，并且得到了比较理想的色谱峰，峰形尖锐且对称性好，增大了分子离子峰的峰强度.在8 min内，各种硝基呋喃类代谢物均得到了较好的分离.色谱图见图2.2.4质谱条件的选择及优化根据硝基呋喃类代谢物的结构特征，采用ESI正离子电离模式，以流动注射泵连续进样对1.0 mg/L的标液进行Q1全扫描，扫描范围为200～400 m/z之间，得到每种组份的分子离子，分别向其分子离子施以碰撞能量形成子离子，接着进行子离子全扫描，找出丰度最强的碎片离子为定量离子，丰度次强的碎片离子为定性离子.同时优化锥孔电压、碰撞能量、鞘气与辅助气流量等质谱条件，使母离子和子离子组成的特征离子的丰度和比例达到最佳.得到1.2中最佳质谱条件.2.5线性范围和灵敏度配置0.5、1.0、5.0、20.0、50.0 μg/L的系列标准工作溶液，采用内标法定量，以待测物的质量浓度X（μg/L）为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值Y为纵坐标制作标准曲线，得到硝基呋喃类代谢物的回归方程和相关系数（见表2）.由表2可知，硝基呋喃类代谢物在0.5～50.0 μg/L在范围内其标准曲线的线性关系良好，相关性系数R2在0.997以上.在方法规定的取样质量条件下，在阴性样品中添加2种混合标准溶液（添加水平为0.25 μg/kg）经测定信噪比（S/N）均大于3，表明这4种物质的检测下限（LOD）为0.25 μg/kg，在阴性样品中添加2种混合标准溶液（添加水平为0.5 μg/kg）经测定信噪比（S/N）均大于10，表明其定量下限（LOQ）可为0.5 μg/kg.2.6回收率与精密度向草鱼、中华鳖和对虾阴性样品中分别添加5、20、100 ng/g 3个水平的添加实验，每个添加水平进行3次实验，每次平行测定6次，按1.2节所述条件进行加标回收率实验，所得结果为回收率为68.6%～106.2%，相对标准偏差为1.2%～10.3%，符合国内外有关标准和法规的要求，结果见表4.3小结通过对前处理条件、色谱条件以及质谱条件的优化，建立了水产品中硝基呋喃类代谢物残留的检测方法.结果表明，该方法在0.5～50.0 μg/L范围内，硝基呋喃类代谢物检测下限（LOD）为0.25 μg/kg，其定量下限（LOQ）可为0.5 μg/kg；在3个不同的添加水平下，其回收率为68.6%～106.2%，相对标准偏差为12%～10.3%.本方法前处理步骤简单、回收率稳定、精密度好，满足我国以及欧盟等国家的限量要求，可以作为水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，并可为该类药物在水产品中的消除规律及毒理评价提供灵敏、准确的分析手段，对水产品中硝基呋喃类代谢物的溯源和卫生监督提供了技术支撑.。
