高效液相色谱分析技术—方法开发陈桂良共70页文档

高效液相色谱法教学课件【全】
31、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月 扬明辉 ，冬岭 秀孤松 。 35、丈夫志四海，我愿不知老。
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联
ห้องสมุดไป่ตู้

检测限
• 非仪器分析目视法(用已知浓度的被测 物，试验出能被可靠地检测出的最低 浓度或量);信噪比法(用于能显示基线 噪音的分析方法，即把已知低浓度试 样测出的信号与空白样品测出的信号 进行比较，算出能被可靠地检测出的 最低浓度或量。一般以信噪比为3∶1 或2∶1时相应浓度或注入仪器的量确 定检测限)。
• 对于①法的要求是：除检测限和精密 度指标不必要求外，对准确度、选择
性、线性与范围、定量限、耐用性等 均应有所要求；
• 对于②法的要求是：只对检测限、选 择性和耐用性三项指标有所要求，其 余均无需要求。
• 用于溶出度测定的方法及药物释 放度测定的方法，只有精密度和 耐用性有所要求，其余项目可不 作要求。
其他影响因素
• 实验条件如避光，pH值或流动相组 份比，温度，衍生化反应时间，进 样温度等要进行论证评估。
灵敏度
• 检测限和定量限，在仪器设置在最 高灵敏度时可检出注入样品的最小 量。最小检出量通常是指分析样品 量产生的响应大于噪声的2~3倍，灵 敏度可用检出限度或定量限度来表 示，检出限度或定量限度越小，该 方法灵敏度越高。
药品质量标准分析方法验证的目的
• 证明采用的方法适合于相应检测要 求。在起草药品质量标准时，分析 方法需经验证；在药物生产方法变 更、制剂的组分变更、原分析方法 进行修订时，则质量标准分析方法 也需进行验证。方法验证过程和结 果均应记载在药品标准起草或修订 说明中。
需验证的分析项目
• 鉴别试验，杂质定量或限度检查， 原料药或制剂中有效成分含量测定， 以及制剂中其他成分(如降解产物、 防腐剂等)的测定。药品溶出度、释 放度等功能检查中，其溶出量等测 试方法也应作必要验证。
色谱条件与系统适用性试验
• 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 以0.01mol/ml十二烷基硫酸钠溶液 （用磷酸调节pH值至2.5）-乙腈 （60：40）为流动相；检测波长为 254nm。理论板数按醋酸可的松峰计 算应不低于2500，醋酸可的松峰与 盐酸四环素峰的分离度应不小于3.0。

10.000
疏水性的比较
8.000
C8 phase
6.000
300Å C18 phase
4.000
k butylbenzene
2.000
0.000
Synergi Hydro-RP
Luna C18(2)
Synergi Luna C8(2) Luna C5 Luna Phe- Jupiter C18 Synergi
App ID 14436
Luna™ Phenyl-Hexyl
Green Tea(绿茶)
Column: Luna™ 5u Phenyl-Hexyl Dimensions: 250x 4.6mm Mobile Phase A:0.2% Acetic acid in Water/Acetonitrile (91:9) B:Water/Acetonitrile (20:80) Gradient: 100%A to t=25min, (68:32) t=25min t t=35min, hold 100%B for 10 min. Flow Rate: 1ml/min Temperature: 350C
2. Lidocaine, LogP = 2.44 3. Noscapine, LogP = 1.97
CH3 N O
OH O
O
Synergi Fusion-RP Avg symm: 0.91
10
12
14
m in
Synergi Max-RP Avg symm: 0.77
10
12
14
m in
Luna C18(2) Avg symm: 0.82
Luna™ C8(2) & C5
• 减少疏水性化合物的保留时间 •减少分析的时间

流动相
不同极性 不同极性 有机溶剂 有机溶剂 和水 吸附与解 吸 溶解与挥 发
不同pH值 有机溶剂 的缓冲溶 或一定pH 液 值的缓冲 溶液 可逆性的 离子交换 多孔凝胶 的渗透或 过滤
分离原理
色谱柱和色谱模式
• • • • • 3.1正相色谱（normal phase chromatography） 3.2 反相色谱（reverse phase chromatography） 3.3离子对色谱（ion-pair chromatography） 3.4 离子交换和离子色谱（ion-exchange and ion chromatography） 3.5 疏 水 作 用 色 谱 （ hydrophobic interaction chromatography） 3.6 亲和色谱（affinity chromatography） 3.7 排阻色谱（Size Exclusion Chromatography， SEC） 3.8凝胶渗透色谱（GPC）
其他
• 理论板数、相邻峰的分离度、多次进样 的相对标准偏差百分数以及拖尾因子 （色谱峰形偏离对称高斯峰的程度）作 为系统适用性参数。
系统适应性试验
• N=5.54*(tR/W1/2)2 =5.54*(1.065*60*tR/A/H)2 • R=2(t2-t1)/(W1+W2) (>1.5) • T=T/2d (Ch.P 0.95~1.05; USP <2.5) • RSD<2.0% • K=(t-tm)/tm
薄层色谱法（TLC） 平板色谱法 纸色谱法
高效毛细管电泳法（HPCE）
色谱学发展历史
1906年，Tweet发现色谱分离现象。 1941年，Martin和Synge发明了利用物质 在两种不相混溶的溶剂中因分配系数的不 同而达到分离的“分配色谱法”，1952年 获Nobel奖。同时提出以气体为流动相。

文 家 。汉 族 ，东 晋 浔阳 柴桑 人 （今 江西 九江 ） 。曾 做过 几 年小 官， 后辞 官 回家 ，从 此 隐居 ，田 园生 活 是陶 渊明 诗 的主 要题 材， 相 关作 品有 《饮 酒 》 、 《 归 园 田 居 》 、 《 桃花 源 记 》 、 《 五 柳先 生 传 》 、 《 归 去来 兮 辞 》 等 。
高效液相色谱法教学课件【全】
6
、
露
凝
无
游
氛
，
天
高
风
景
澈
。
7、翩翩新 来燕，双双入我庐 ，先巢故尚在，相 将还旧居。
8
、
吁
嗟
身
后
名
，
于
我
若
浮
烟
。
9、 陶渊 明（ 约 365年 —427年 ），字 元亮， （又 一说名 潜，字 渊明 ）号五 柳先生 ，私 谥“靖 节”， 东晋 末期南 朝宋初 期诗 人、文 学家、 辞赋 家、散
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
Байду номын сангаас
1
0
、
倚
南
窗
以
寄
傲
，
审
容
膝
之
易
安
。
谢谢！

分析乙苯及二甲苯三个异构体的样品，用归一化法定量结果如下，计 算各组分百分含量。
组分 峰面积A 重量校正因子
乙苯 120 0.97
对二甲苯 75 1.00
间二甲苯 140 0.96
邻二甲苯 105 0.98
（乙苯21.15％；对二甲苯17.50％；间二甲苯31.35％；领二甲苯24.00％）
高效液相色谱定量分析方法 ——内标法
高效液相色谱定量分析方法
目录
01 面积归一化法
02 外标法
03 内标法
高效液相色谱定量分析方法
什么是定量分析方法
实质是搞清楚样品里各组分含量有多少的问题 。
高效液相色谱法：能将组分分离后再分析含量 。
高效液相色谱定量分析方法—案例
怎样测出食品中的添加剂是符合标准的呢？
高效液相色谱定量分析方法—案例
高效液相色谱定性分析方法
目录
01 高效液相色谱法定性分析原理
02 高效液相色谱法定性分析方法
高效液相色谱定性分析方法
天麻为天麻片的主药，怎么鉴别 天麻片里是否真正含有天麻呢？
功效 祛风除湿 舒筋通络 活血止痛
医学用途 治疗肢体拘挛 治疗手足麻木 治疗腰腿酸痛
高效液相色谱定性分析方法 01.定性分析原理
高效液相色谱定性分析方法
课后思考
复方感冒片里主要有伪麻黄碱、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、右美沙芬这四种成份，请你结合
前面所学知识，说一说如何采用高效液相色谱法定性鉴别这四种成份呢？ 如下图所示，这个样品中是否含有这四种有效成份呢？
高效液相色谱法概念
高效液相色谱法概述
一、高效液相色谱法简介
液相色谱分析是在经典的液体柱色 谱基础上，引入了气相色谱的理论；

器等。
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成

第四章高效液相色谱分析法高效液相色谱（HPLC）是一种现代化的色谱技术，该技术利用高压将溶液推入柱中，然后在固定相上进行分离。

HPLC技术广泛应用于化学、生化、生物医药、环境等领域的分析与研究。

HPLC的分析原理是利用样品中所含化合物与柱填料固定相之间的体积作用力及化学作用力来进行分离。

在HPLC系统中，样品经过样品进样器注入进样回路中，通过高压泵将样品溶液送入柱中，柱中填充有固定相，样品中的成分在固定相表面上进行吸附与解吸，其中一些化合物会更容易与固定相相互作用，因此分离出来。

分离后的化合物通过检测器进行检测和定量。

HPLC技术具有高效、灵敏、精确、稳定等特点。

相比传统色谱技术，HPLC具有较高的分离效率和灵敏度。

其中，分离效率是指单位时间内分离出的化合物的数量，而灵敏度是指仪器能够检测到的最低浓度。

通过调节柱填料、流动相组成和流速，可以实现对复杂样品的高效分离和定量分析。

HPLC技术有多种模式，包括正相色谱法、反相色谱法、离子交换色谱法、分子筛色谱法等。

其中，反相色谱法是最常用的一种模式。

反相色谱法是指固定相是非极性的，而流动相是极性溶剂的情况下进行的色谱分离。

通过调整流动相的溶剂极性和流速，可以实现对不同极性化合物的分离。

除了分离功能外，HPLC还可以与其他技术联用，如质谱、荧光、紫外-可见光谱等。

这种联用技术结合了不同的分析方法，可以提高分析的特异性和灵敏度。

例如，将质谱与HPLC联用可以对化合物的结构进行确认和鉴定，而将荧光和HPLC联用可以对化合物进行特异性的定量分析。

HPLC技术在各个领域有着广泛的应用。

在化学领域，HPLC可以用来分离和分析复杂化合物，如天然产物的提取和纯化，药物的分析和鉴定等。

在生物医药领域，HPLC可以用来分析药物的含量、纯度和杂质，以及药物代谢产物和血液中的生理活性物质。

在环境领域，HPLC可以用来检测水体、土壤和空气中的有害物质，如重金属、有机污染物和农药残留等。

用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了 气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9107Pa）；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而 成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出 物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分 离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高 效或现代液相色谱法。
2019/11/12
C. 梯度洗脱装置
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的 溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强 度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果， 缩短分析时间的目的。
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整 混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色 谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升 温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的 极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度 程序）来达到。
灵敏度低、对温度 敏感、不能用于梯度洗 脱；
偏转式、反射式和 干涉型三种；
2019/11/12
d. 荧光检测器
（fluorescence detector）
高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类 化合物等有响应；
2019/11/12
第三节 液-固色谱法
2019/11/12
一、HPLC与经典LC区别
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段 1．经典LC：仅做为一种分离手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测