包涵体蛋白复性的几种方法

包涵体表达的蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。

一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。

[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。

研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。

原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。

包涵体的复性总结关于包涵体的复性是一个令人头疼的问题,已经成为生物制药的瓶颈,包涵体的复性前期准备工作尤为重要,关于包涵体的处理一般包括这么几步:菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化,实验内容比较庞杂、繁琐。

一、菌体的裂解菌体的破碎方法很多:高速组织捣碎、玻璃匀浆器匀浆、超声波处理法、反复冻融法、化学处理法。

无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,不同的菌体蛋白需要加入不同的抑制剂:二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力,但不是全部,而且应该在破碎的同时多加几次;另外,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使用这些条件时都要适合于目的物质的提取。

在实验室研究多采用超声波处理法和匀浆器匀浆法。

二、包涵体的洗涤通常的洗涤方法一般是难以洗干净的,包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒DNA和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂,如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强,在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜。

根据不同的菌体选用与之相应的洗涤液,比如:2 M尿素+50mm Tris-HCl+0.2 mM NaCl +1%Triton x-100+2mmEDTA PH8.0,再用缓冲洗涤一次。

此外,刚处理完的包含体好溶解,冷冻后难溶解,且溶解时间和比例都会加大。

三、包涵体的溶解强的变性剂如尿素、盐酸胍,是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展,SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等去垢剂,可以破坏蛋白内的疏水键,也可溶解一些包涵体蛋白质。

如何对包涵体蛋白进行表达与复性包涵体即在某些生长条件下，在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

表达量越高越容易形成包涵体。

原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

关于包涵体的复性一直是生物制药的瓶颈，包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化。

一、包涵体蛋白的表达在平板上挑取单菌落，接种于含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的5 ml LB培养基中，37 ℃过夜培养，然后转接到100 ml LB 培养基中，37 ℃培养至A600 为0.4~0.6时，加入IPTG 至终浓度为0.5mmol/L 诱导3.5 h。

8000 r/min 离心5 min 收集菌体，加入10 ml 50 mmol/LTris-HCl，冰浴下超声波破碎后12000 r/min离心30 min收集沉淀。

二、包涵体的洗涤在包涵体中加入包涵体洗涤液：50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50 mmol/LNaCl，w=0．5％TritonX-100，pH 8．0；，37℃振荡洗涤1～2 h，然后8 000 r/min 离心15 min，收集沉淀。

三、包涵体的溶解洗涤后的包涵体加入适量的(包涵体溶解液)：6 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，10 mmol/L β-ME，pH 8．0(注：β-ME用时现加)，于磁力搅拌器上搅拌过夜，1000 r/min离心30 min，取上清即得包涵体溶解液。

四、包涵体的复性包涵体的复性目前常用的主要有两种方式：1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释；2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂。

1.包涵体的稀释复性设定不同的复性条件：蛋白质量浓度、尿素浓度、温度、氧化还原条件、加入Ttiton X-100与环糊精的量、复性时间等，使变性溶解的包涵体稀释复性，复性一定时间后取样测酶活性。

包涵体的变性及复性1、用1×Binding Buffer作裂解液，超声波破碎后，获得的包涵体；2、包涵体用含0.3%SKL（十二烷基肌氨酸钠）的1×Binding Buffer溶解，室温静置至完全溶解；3、充分溶解后，，加入用1×Binding Buffer配制的0.2%PEG2000和0.1mM GSSG：1mM GSH，0.1mM Arg，5-10% Glycerol），最后用1×Binding Buffer稀释蛋白至原菌液体积，调整pH（具体值视蛋白情况定，避开pI），装入透析袋中；4、用20倍体积的1×Binding Buffer进行4℃透析复性，每2h换一次，6次换液后，离心收集蛋白液；5、按可溶性蛋白纯化，注意保持低温环境，防止蛋白降解。

注意：透析液中的添加剂的浓度要在实验中摸索，每种蛋白的要求可能不同。

复性过程的添加剂：1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。

一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。

2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。

3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。

有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。

不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。

4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。

5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%-30%。

包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。

通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。

包涵体蛋白复性方法1稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。

目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。

2透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。

3超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。

4柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。

其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子筛填料，柱较长（40cm-100cm不等）。

相比稀释和透析两种方法，色谱柱复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右）5高蛋白质浓度下的复性：通常有两种方法，一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性；二是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。

此外，吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用蛋白质的复性。

如果均失败只有换载体。

包涵体复性
结合液80mm 300mm
Tris: 0.4 0.1 0.1
咪唑：0.1 0.4 1.5
氯化钠： 2 0.5 0.5
尿素：9.6g 2.4g 2.4g
水：补足至20mL 补足至5mL 补足至5mL
1.菌体用裂解液重悬，加入溶菌酶，冰上30min或者时间更长一点。

2.破碎，离心，收集沉淀。

加入包涵体溶解液，10min左右包涵体会溶解。

在冰上进行，可放在摇床上。

3.处理镍柱，放出酒精，水洗2遍，结合液3ml平衡2遍。

4.将包涵体蛋白加入柱子中，结合1小时左右。

5.结合液冲洗柱子。

6.80mm 洗脱蛋白
7.300mm洗脱蛋白，收集2ml洗脱蛋白。

8.准备2个超滤管，分别加入1ml洗脱蛋白液，再加入不含尿素的PBS （可加入EDTA等），离心。

再次加入PBS，离心，收集大约2ml的液体分装保存。

实用标准文案包涵体复性方法：一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。

（即回收高，易分离，浓度高，易放大，耗时少。

）1. 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。

透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性（不可逆变性），易造成膜污染；稀释法（直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制）处理量太大，不利于工业放大。

2. 凝胶过滤层析复性凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。

与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。

凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。

复性过程始终发生在溶液中。

蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。

在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除（？？）虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。

脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。

包涵体表达的蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。

一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。

[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。

研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。

原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。

IFN-α重组蛋白包涵体溶解和蛋白纯化复性一、表达产物处理1、表达菌液8000rpm 4℃离心10min2、菌体沉淀按10:1（菌重5g，加50ml）裂解缓冲液，冰上超声至清亮（250W，超声5s，间歇5s，功率35%）3、取样取100ul 超声菌液并离心，标记超声上清，超声沉淀4、12000g 4℃离心15min，上清备用，标记超声上清5、超声沉淀用含2M 尿素的裂解缓冲液，以20:1 比例重悬，继续超声5min6、12000g 4℃离心20min7、超声沉淀用含1% Triton X-100 的裂解缓冲液重悬，4℃放置10min8、12000g 4℃离心15min，获得包涵体9、获得包涵体用Binding Bufer 重悬，4℃放置过夜二、包涵体的纯化1、放置过夜包涵体4℃高速离心，收集上清备用2、取样取离心上清，标记柱前3、使用Ni-NTA 基质进行纯化，用Binding Buffer 平衡Ni 柱，柱子平衡后低流速上样，整个上样过程使样品处于冰上，上样后用3~5 个柱体积的Wash Buffer 进行漂洗，最后用Elution Buffer 洗脱4、取样取柱后，标记柱后三、包涵体复性1、透析袋处理方法：把透析袋剪成适当长度（10~20cm）小段，在大体积的2% （W/V）NaHCO 3 和1mM EDTA (PH8.0)中将透析袋煮沸10min。

用蒸馏水彻底清洗透析袋。

放在1mM EDTA(PH8.0)中将之煮沸10min。

冷却后存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。

从此时起取用透析袋时必须戴手套保持清洁，用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净2、复性采用梯度透析法，纯化后包涵体用含4M 尿素的透析缓冲液稀释蛋白浓度至约100ug/ml，从4M、2M、2M、0.5M 依次降低透析液中尿素浓度，每个浓度均4℃透析，4~6h 换新鲜透析液一次，高速离心去除沉淀。

最后用PBS(PH7.2) 4℃透析过夜。

包涵体蛋白的纯化和复性包涵体蛋白的纯化和复性1．菌体的收集和破碎用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min。

沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。

【备注】超声破菌缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶）重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。

破碎后的匀浆，4℃、 12000 rpm离心15 min。

分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。

2．包涵体的处理洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。

重复一次。

再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃ 12000 rpm离心15 min，弃去上清液。

【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。

溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。

12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。

【备注】包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton）3．目的蛋白的纯化亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。

谷胱甘肽S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。

包涵体复性
透析袋处理：
1、2%碳酸氢钠和1mmoL/L EDTA（pH8.0）中煮10min；
2、用蒸馏水彻底洗净；
3、放在1mmoL/L EDTA（pH8.0）中煮沸10min；
4、放在4℃，浸在ddH2O。

试剂配制
0.5M CAPS：称取CAPS 5.53g，溶于ddH2O，定容50mL；
30%十二烷基肌酸纳：称取3g十二烷基肌酸纳，溶于ddH2O，定容10mL；
0.5M Tris-HCl（pH8.5）：称取6.05g Tris，溶于ddH2O，盐酸滴定至pH8.5，定容100mL；
1M DTT：称取DTT
包涵体溶解液：0.5mL CAPS + 166uL 30%十二烷基肌酸纳+ 5uL DTT + 4.3mL ddH2O，共5mL；
包涵体透析液1：12mL 0.5M Tris-HCl（pH8.5）+ 30uL DTT，加水至300mL。

包涵体透析液2：12mL 0.5M Tris-HCl（pH8.5），加水至300mL。

1、将bufferE洗脱的蛋白加入干净的透析袋里，4℃PBS透析过夜，期间换两次PBS，待蛋白包涵体析出；
2、吹打包涵体蛋白，收集在15mL或50mL离心管中，6000r/min离心5min。

3、加入5mL的包涵体溶解液，转移到干净透析袋里，在包涵体透析液1 4℃透析6-7小时。

4、换包涵体透析液2透析6-7小时。

5、把透析袋拿出来，放一干净板上，下面放干燥的PEG20000，吸收透析袋里面的水，达到浓缩的效果。

6、洗净透析袋表面，打开透析袋，回收蛋白。

洗干净用过的透析袋，放进酒精里浸泡。

包涵体复性方法：一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。

（即回收高，易分离，浓度高，易放大，耗时少。

）1. 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。

透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性（不可逆变性），易造成膜污染；稀释法（直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制）处理量太大，不利于工业放大。

2. 凝胶过滤层析复性凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。

与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。

凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。

复性过程始终发生在溶液中。

蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。

在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除（？？）虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。

脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M 盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。

包涵体复性方法：一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。

（即回收高，易分离，浓度高，易放大，耗时少。

）1. 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。

透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性（不可逆变性），易造成膜污染；稀释法（直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制）处理量太大，不利于工业放大。

2. 凝胶过滤层析复性凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。

与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。

凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。

复性过程始终发生在溶液中。

蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。

在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除（？？）虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。

脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M 盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。

包涵体（inclusion body）表达的蛋白的复性-2复性是指蛋白质在失去二级和三级结构后，通过各种机制重新折叠为功能性的状态的过程。

在细胞内，复性是由许多复合物和辅助蛋白质调控和协助完成的。

本文将重点讨论包涵体（inclusion body）中蛋白质的复性过程。

包涵体是在细胞内堆积的不溶性蛋白质聚集体。

它们通常形成在细胞内或细胞质中，并且往往是由于蛋白质的过度表达、表达错误、氨基酸残基突变等异常因素导致。

包涵体通常具有高度结构乱序和高度聚集性，因此它们的蛋白质是失去了正常的二级和三级结构，并且失去了原来的功能。

然而，随着对包涵体的深入研究，发现在包涵体内的蛋白质中仍存在着一定的复性能力。

这种复性过程主要是通过转移蛋白质到适宜的环境中，并提供足够的机会和条件来重新折叠，并最终恢复其功能性。

在细胞中，复性的主要机制是由伴随蛋白（chaperone）介导的。

伴随蛋白是一类与蛋白质相互作用，协助其正确折叠的蛋白质。

它们通过与包涵体内的蛋白质结合，并提供正确的空间环境和稳定性，促使蛋白质的重新折叠。

同时，伴随蛋白还可通过提供能量或与其他分子参与交互来帮助蛋白质恢复到其原来的结构。

除了伴随蛋白外，燃酶体（proteasome）也参与了包涵体中蛋白质的复性过程。

燃酶体是一种细胞内能够降解蛋白质的复合体，它能够将包涵体内的蛋白质降解为较小的片段，并通过其他复性机制使其重新折叠。

除了细胞内的复性机制外，近年来还发现一些外源性的方法可以促进包涵体中蛋白质的复性。

例如，通过改变温度、pH值、还原剂或抗氧化剂的条件，可以创造出适合蛋白质复性的环境。

此外，还可以利用化学物质、蛋白质工程和蛋白质设计等手段，改变包涵体内蛋白质的结构和性质，从而促进复性。

总的来说，包涵体中的蛋白质具有一定的复性能力。

复性是通过伴随蛋白、燃酶体等细胞内机制以及温度、pH值等外源性条件的调节实现的。

这些复性机制为包涵体蛋白质的研究和应用提供了重要的基础，并为治疗蛋白质异常聚集性疾病提供了新的策略。

1、上清中亲和层析纯化蛋白（整个纯化过程在低温下操作）：
全菌采用50 mM Tris(pH8.0)，150 mM NaCl，20 mM Imidazole，2 mM DTT 含1% TritonX-100，1 μg/mL Pepstatin A，1 μg/mL Leupeptin 超声裂解，同时以50 mM Tris(pH8.0)，150 mMNaCl，20 mM Imidazole，2 mM DTT 缓冲液平衡Ni-IDA 亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE 分析检测；
2、包涵体通过亲和层析纯化蛋白
包涵体采用50 mM Tris (pH8.0)，150 mM NaCl 含1% Triton X-100，2 mM EDTA，2 mM DTT洗涤后，以50 mM Tris(pH8.0)，150 mM NaCl，8 M Urea，20 mM Imidazole，2 mM DTT 缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA 柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE 分析检测。

3、经Ni-IDA 亲和层析纯化分析，收集纯度较高的梯度，将其加入到处理后的透析袋中，4 ℃环境下，透析到缓冲液［1×PBS(pH 7.4)，4 mM GSH，0.4 mM GSSG，2 mM EDTA，0.4 M L-Arginine，1 M Urea，2 mM DTT］中复性（搅拌，换一次液，不加搅拌一晚上换2次，），复性后最终透析于储存液1×PBS(pH7.4)，20% Glycerol，2 mM DTT 溶液约6-8 h。

透析复性结束后，上清用0.22μm 滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。

蛋白纯化蛋白复性包涵体的纯化和复性总结关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。

此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。

对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。

4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。