微生物方法学验证范本

AAAA片微生物限度检查方法验证本品为中成药制剂，系口服给药制剂，按中国药典2005年版要求，需做细菌、霉菌及控制菌检查，同时需对检验方法进行验证，以确保检验方法的准确可靠。

一、试验材料及方法1．材料1．1 试验样品：AAAA片（BBBBBBBBBBB有限公司）批号：XXXXX，规格：XXX1．2 实验菌株：金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC （B）44102、枯草杆菌CMCC（B）63501、白色念株菌CMCC（F）98001，购自中国医学细菌保藏中心。

2．方法2．1菌液制备：接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌新鲜培养物至营养肉汤中30~35℃，培养18~24小时；接种白色念株菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中25℃，培养18~25小时，上述培养物用%.9无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100CFU的菌悬液，备用。

2．2 试液制备：取本品制成1：10的供试液备用。

2．3 试验组：取1：10的供试液1ml，置平板中，加入营养琼脂培养基15~20ml，放冷，倒置平板，30~35℃温度培养24~28小时，白色念珠菌用改良马丁培养基，于25℃培养72小时，观察结果。

根据药典要求药品微生物学检查方法验证主要用规定的已知菌数的试验菌加入到已制备处理好的样品溶液中，测定其数据，同时测定样品本底菌数，并设置稀释对照组。

根据已加入的菌数及测得菌数，计算回收率，规定要求：试验组及稀释组的菌回收率均不得低于7%，否则需重新选择样品处理方法，再进行回收率直到所采取的方法回收率试验达7%以上方可认为验证试验符合要求。

2．4 菌液组按中国药典2005年版微生物限度菌落计数方法测定每1ml中菌数。

2．5 供试品对照组：取规定量的供试液，按中国药典2005年版微生物限度菌落计数方法测定本品的本底数。

2．6 稀释剂对照组取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml，余下同试验组。

2．7 验证试验至少应进行二次独立的平行试验，并分别计算各次试验的菌回收率。

微生物限度检查检验方法验证报告
方案编制年月日方案审核年月日方案批准年月日
上海美宝生命科技有限公司
7
7.1试验样品
确认人：日期：
7.2 产品试验组微生物生长情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：7.3 供试品对照组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：
7.4 稀释剂对照组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：7.5 菌液组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：
7.6稀释剂对照组菌回收率计算
检验人：日期：复核人：日期：7.7 试验组菌回收率计算
检验人：日期：复核人：日期：
7.8 结果说明
经过验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分别为： %、 %、 %、 %、 %。

稀释剂回收率为： %、 %、 %、 %、 %。

7.9 结论
以上验证结果证明，本品（适合/不适合）采用上述方法进行微生物限度检查。

附录。

微生物限度检查法方法验证结果报告一、验证用样品：********片（批号：********）二、验证用菌种（1）枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]（2）金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )[CMCC(B) 26003]（3）大肠杆菌（Escherichia coli）[CMCC(F) 44102]（4）白色念珠菌(Candida a lbicans )[CMCC(F )98001]（5）黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]均为第3代，由山东省药品检验所提供三、方法中国药典2005年版二部附录XⅠ J。

四、培养基制备：(1)营养琼脂培养基批号********称取 32 g，加入 1000 ml蒸馏水(2)改良马丁琼脂培养基批号********称取 42 g，加入 1000 ml蒸馏水(3)MUG培养基批号********称取 23.37 g，加入 1000 ml蒸馏水(4)玫瑰红钠培养基批号********称取 31.5 g，加入 1000 ml蒸馏水(5)胆盐乳糖培养基批号********称取 38.5 g，加入 1000 ml蒸馏水五、菌数、霉菌数、酵母菌数计数方法学验证1、菌液制备：（1）取经30～35℃培养18～24小时，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌营养琼脂培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。

（2）取经23～28℃培养24～48小时的白色念珠菌改良马丁琼脂培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。

（3）取经23～28℃培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加3～5ml盐水洗下霉菌孢子，吸出孢子悬液，（用管口带有薄的无菌棉花能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。

文件编号：SVP YF-0-01-00验证文件******微生物限度 检查法验证方案********有限责任公司目录1 适用范围 2 目的 3 概述 4 验证所需要的仪器设备及文件 5 可接受的限度范围标准 6 测试方法 7 异常情况处理 8 测试结果 9 结论 10 再验证周期 11 附表1 适用范围 本验证方案适用于******微生物限度检查法的验证。

2 目的 建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的完整性，保证检验结果的可靠性。

3 概述 3.1******处方中含有盐酸氨基葡萄糖以及常用辅料等成分，文献报道盐酸氨基葡 萄糖有抑菌活性。

根据以上特点，按《中国药典》2010 年版附录Ⅺ J《微生物限度 检查法方法》的“供试品的制备”项下需用特殊方法制备供试液中（6）制备供试 液。

“细菌，霉菌，酵母菌计数”项下检查法 2 薄膜过滤法进行细菌，霉菌及酵母 菌的计数方法验证，控制菌检查项下控制菌的检查法验证。

3.2 验证时间：************批平行三次试验。

4 验证所需要的仪器设备及文件 4.1 验证需用仪器设备器具名称规格型号检定日期检定单位有效期电热恒温培养箱 HG101-3多用生化培养箱 SP-80 蒸汽灭菌器 ZDX-35B4.2 验证所需要的文件及存放地方 资料名称《HG101-3 电热恒温培养箱操作维护保养 SOP》 《SP-80 型生化培养箱操作维护保养 SOP》 《ZDX-35B 蒸汽灭菌器操作维护保养 SOP》 《微生物限度检查法 SOP》 5 可接受的限度范围标准 5.1******微生物限度检查质量标准存放地点项目标准规定细菌总数≤1000 个/g霉菌、酵母菌≤100 个/g大肠埃希菌不得检出5.2 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果判断在 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不低于 70%。

若试验组的菌回收率均不低于 70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌；若任一次试验中实验组的菌回收率低于 70%，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

微生物限度检测方法学验证方案文件编号：P-批准签字页目录1.目的 (4)2.范围 (4)3.责任者及职责 (4)4.验证简介 (4)5．验证过程 (7)6．结果判断 (8)7．结论和建议 (8)8．异常情况报告 (8)9．再验证 (8)10．附件 (8)附件1：培养基的灵敏度复核 (9)附件2：稀释液的无菌性检查 (10)附件3：方法验证 (11)1. 目的按照中国药典2010版（第三部），采用薄膜过滤法进行微生物限度检查，本方案对新修订的方法进行验证。

2. 范围本公司要求进行微生物限度检查的原辅料和制剂，中间制品以及消毒剂。

3. 责任者及职责4. 验证简介4.1 定义●CFU：菌落数●供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

●试验组当采取薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌加在最后一次冲洗液中，过滤后，取出滤膜接入对应培养基中。

●菌液组测定所加的试验菌数。

●稀释剂对照组用相应的稀释液替代供试品，按试验组规定的方法进行菌落计数。

4.2 菌悬液4.2.1菌种及来源检查人：复核人：检查日期：4.2.2菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，30~35℃培养18~24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，20~25℃培养24~48h。

上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50~100CFU的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28℃培养5~7天，加入3~5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100CFU的孢子溶液。

4.3 培养基及稀释液4.3.1培养基和稀释液的名称培养基：营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基稀释液：pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液、灭菌纯化水4.3.2培养基灵敏度复核培养基灵敏度复核，参见《培养基的灵敏度检查操作规程》QC2524.3.3稀释液的无菌性检查对稀释液进行无菌检查，14天规定温度培养后应无菌。

5.5微生物限度依据《中国药典》2010年版一部附录XIII C微生物限度检查法，依法对三批中试产品进行检查，结果见表15-6。

表15-6 金刚藤分散片微生物限度检查结果批号031219 031221 031223细菌总数霉菌总数大肠杆菌活螨80<10未检出未检出60<10未检出未检出100<10未检出未检出结论：本品三批中试产品微生物限度检查均符合规定。

2010年版药典对微生物限度检查提出了新的要求，因此，在对准备送检的三批样品检验时，参照《中国药典》2010年版一部附录XIII C进行，试验如下：5.1.1细菌、霉菌及酵母菌的检查菌种金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC （F）44 102]菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，35℃培养24小时。

用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。

接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，25℃培养48小时。

用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，28℃培养7天，加入5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，用管口带有薄的无菌纱布的无菌毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试管中，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

计数方法验证供试液的制备：取050815批样品10g，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白栋缓冲液至100ml，振摇，使溶解，作为1：10的供试液。

方法验证及不确定度评定
报告
方法名称：
方法依据：
分析项目：
报告编写：日期：
报告审核：日期：
报告批准：日期：
1 方法原理（或适用范围）
2 主要人员、仪器设备及试剂耗材
样品处理，方法适用性等等，复现整个验证过程
4 验证报告结果
4.1精密度
描述精密度试验过程（同一个样品重复测量或同一产品多个样品平行测量）
表4 重复测量检测结果
4.2结果质量控制（阴性，阳性，环境监控）
5不确定度分析
从方法步骤可知，不确定度来源主要是由样品中微生物分布的均匀性和重复测量带来。

5.1检测结果：详见表4；
5.2取对数lgX ，得到对数后lgX = ； 5.3求残差lgX-X lg ； 5.4求残差平方和
210
1
)lgX (lg ∑=-
i X
=
5.5求平均值的标准不确定度
)
1(n )
lg lg (U 1
2
lgx --=∑=n X X n
i ）
（
5.6求扩展不确定度
若取包含因子k=2，故）
（lgx kU U == 由于lgx 与x 之间属于非线性关系，不能直接求扩展不确定度U 的反对数，因此首先确定lgx 的取值范围：**≤lgx≤**
取反对数得：** ≤x≤ **
则本次测量结果的取值区间为** ≤x≤ **（置信概率95%）
6结论
由上述方法验证实验可知，实验室已满足方法要求的条件（包括人员资历、仪器设备、试剂、精密度等），适合在本实验室开展。

目录1. 目的 (3)2. 简介与汇总 (3)3. 样品、仪器、培养基及稀释液 (4)4. 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 (4)5. 控制菌检查方法验证 (6)6. 总结 (7)7. 偏差 (7)附录A:****胶囊(规格10mg)微生物限度检查方法 (8)1 目的通过对生产工艺和辅料发生变更后的***胶囊(规格10mg )微生物限度检查的验证，确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度的测定,以证明所设定的检验条件及检验程序对可能存在的各类微生物无抑制作用，确保检验结果的真实性和重现性。

2 简介与总汇***胶囊(规格10mg)微生物限度检查中计数方法验证细菌、霉菌及酵母菌采用平皿法（1ml/皿）；控制菌检查方法验证采用常规法（10ml供试液加入到100mlBL培养基中）。

为证明此方法能消除***胶囊(规格10mg)的抑菌活性及测定方法的可靠性，QC按照方案（文件编号：VP9023-01）对微生物限度检查方法进行验证。

方法验证内容包括：细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证、控制菌检验方法验证。

验证结果证明：该检验方法和检验条件能消除***胶囊(规格10mg)的抑菌活性，符合微生物限度检查方法验证要求。

日常检测按验证的方法和条件进行微生物限度检查。

计数方法验证及控制菌方法验证结果汇总见下表：方法验证结果汇总3 样品、仪器、培养基及稀释3.1 样品***胶囊规格：10mg 批号：20110701 、20110702、20110703 3.2 仪器3.3 培养基3.4 稀释液PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液0.9%无菌氯化钠溶液含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液4 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证4.1 菌种4.2 菌液制备及同步计数将制备好的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌菌悬液用0.9％无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释制成每1ml含菌数50～100CFU的工作菌液；黑曲霉的新鲜培养物用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，并做10倍系列稀释制成每1ml含孢子数50～100CFU的孢子菌液。

微生物分子驗證方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：微生物分子验证方法是指利用分子生物学技术对微生物进行鉴定和检测的方法。

随着科学技术的不断发展，分子验证方法已经成为微生物学研究和实践中不可或缺的一部分。

它不仅可以更加准确地鉴定微生物的种类和品质，还可以快速、高效地进行检测和分析。

本文将介绍一些常用的微生物分子验证方法，以及它们在不同领域的应用。

一、PCR技术PCR（聚合酶链反应）技术是一种常用的微生物分子验证方法。

通过PCR技术可以在微生物体内特异性地扩增某一段特定的DNA序列，从而对微生物的种类进行鉴定。

PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优点，可以检测极微量的微生物。

PCR技术还可以在短时间内完成大批样本的检测，适用于高通量的微生物鉴定和检测。

二、基因测序技术基因测序技术是一种通过测定微生物DNA序列来鉴定微生物的方法。

基因测序技术可以获得微生物的全基因组序列信息，从而对微生物的种类和基因组结构进行深入分析。

通过基因测序技术可以快速、准确地鉴定微生物的种类，并了解微生物的遗传变异和进化过程。

基因测序技术在微生物学研究、环境监测、食品安全等领域具有广泛的应用价值。

三、质谱技术质谱技术是一种通过分析微生物体内的代谢产物来鉴定微生物的方法。

质谱技术可以通过测定微生物代谢产物的分子质量和碎片谱图等信息，快速、准确地鉴定微生物的种类和代谢途径。

质谱技术具有高分辨率、高灵敏度和高准确性的优点，可以对微生物的多种代谢产物进行全面、快速地检测和分析。

质谱技术在微生物学领域的研究和应用方面具有重要意义。

四、荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术是一种通过检测微生物的核酸序列来鉴定微生物的方法。

荧光原位杂交技术可以利用荧光标记的核酸探针与微生物DNA或RNA特异结合，从而在显微镜下观察到目标微生物的位置和数量。

荧光原位杂交技术具有高特异性、高敏感性和高分辨率的优点，可以对微生物的种类和数量进行快速、直观地检测和分析。

速效心痛滴丸2.微生物限度检查参照中国药典2005年版一部要求，对微生物限度检查作验证试验如下：2．1微生物限度检查法验证实验2.1.1.验证用菌种：金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003、枯草杆菌CMCC （B）63 501、大肠埃希菌CMCC（B）44 102、白色念珠菌CMCC（F）98 001、黑曲霉CMCC（F）98 0032.1.2方法：中国药典2005年版附录一部XIII C 微生物限度检查方法验证试验。

2.1.3操作方法：（1）菌液制备：a. 取经37℃培养24h金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。

b. 取经25℃培养24h的白色念珠菌肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。

c. 取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，用5ml生理盐水洗下霉菌孢子，吸取菌液，用标准比浊管比浊，然后取1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-4（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。

（2）供试液制备：称取供试品10g，研细，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪，混匀，作为1:10的供试液，分别人工污染上述5种代表实验菌株。

（3）回收率测定a. 实验组：取1:10供试液1ml和1ml实验菌液同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时，观察计数。

b. 活菌组：照上述方法测定每1菌株的实验菌数。

c. 供试液对照：测定供试品本底菌数。

d. 稀释剂对照组，取稀释液同法操作，测定，应无菌生长。

4.结果：菌落计数结果，回收率实验结果，见表2、表3：表2 菌落计数（cfu/ml）从表3可知，玉屏风泡腾颗粒样品处理后，按常规法进行微生物限度检查，供试品对5种菌株的回收率试验均高于70%可采用此法检验。