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2015版《中国药典》即将公布，新修订的《中国药典》对药品微生物检验和检定方法发生了重大变化，本次修订是对《中国药典》多年来固有的微生物检查系统进行根本性的调整，着重解决药品微生物相关检查方法及微生物限度标准与欧美等药典的协调统一问题。
宏观变化一：全面与国际接轨以无菌检查法为例从上述无菌检查法的比较中我们不难看出，新药典参考EP7.0、USP35、JPXV 标准，修订中国药典的微生物标准；参考欧美日药典标准修订菌数标准表达方式；以需氧菌总数替代细菌数、耐胆盐的格兰阴性菌替代大肠菌群等等，并增加新的概念：如含菌量较低的供试品细菌总数测定使用最大可能数法、分散均匀并非一定要溶解等等，同时新药典引入的偏差调查概念和内容更具体等等方面说明，微生物检验技术与国际标准要求接轨已成定势。
微观变化二：实验环境的修订2015年版药典中对无菌检查环境洁净度规定：无菌检查应在B 级背景下的A 级单向流洁净区域或D级背景下的隔离器中进行。
限度检查要求在受控洁净环境下的局部不低于B级单向流空气区域进行。
环境的提升，除了对药品检测设备硬件的要求提高，还有验证和维持环境要求的提高。
洁净或无菌室应配备独立的空气机组或空气净化系统，以满足相应的检验要求，包括温度和湿度的控制，压力、照度和噪声等都应符合工作要求。
空气过滤系统应定期维护和更换, 并保存相关记录。
微生物实验室应划分成相应的洁净区域和活菌操作区域，同时应根据实验目的，在时间或空间上有效分隔不相容的实验活动，将交叉污染的风险降低到最低。
活菌操作区应该配备生物安全柜，以避免危害性的生物因子对实验人员和实验环境造成的危害。
实验室环境监测要求提高，增加人员进出表面微生物的监测，以降低人员操作时带来的风险。
对微生物室使用的消毒剂和清洁剂进行验证，从而有效控制微生物，保证无菌环境达到要求。
微生物实验室需要加强人员在环境监测时的操作规范，保证环境监测数据的准确性。
而且实验人员应经过实验室生物安全方面的培训，保证自身安全，防止微生物在实验室内部污染。
药品微生物限度检查及方法验证从事药品微生物限度检查工作两年时间，从学做到承担工作到变得有点经验，经历了一个摸索、学习和积累的过程，回过头来做一个总结，把一些零散的经验和体会做一个梳理和归整，以供在此岗位工作的同仁参考。
第一部分：外围工作外围工作主要有器皿清洗、灭菌，培养基、试剂配制及灭菌，无菌室清洁消毒等。
器皿的清洗是每个实验室和每一个实验员必须要做的最起码的工作，工作要求简单，操作方便，把握一个原则：干净。
培养基、试剂配制后一般都要求调PH到7.20，因为高温灭菌之后PH值会下降0.2左右。
固体培养基在灭菌前要先加热煮沸，使琼脂均匀分散。
煮沸时要注意不要溢出容器，以免发生烫伤。
万一不小心溢出，可用一湿抹布盖住容器口，迅速将其从加热源上移开，不要在情急之下徒手去拿或者在容器侧面拿，那样容易被从容器口源源不断溢出的培养基烫伤。
液体物品灭菌后，不能立即打开放气阀放气，因为此时被灭菌物品的温度大于100℃，在压力等于常压时，液体会暴沸，造成液体喷出或容器炸裂，发生事故。
万级洁净度的无菌室应当每周进行一次消毒，消毒剂每月更换一次，防止长期使用同一种消毒剂而使微生物形成耐药性。
消毒范围包括墙壁，地面，天花板以及空气。
表面消毒可以用消毒剂擦拭，尤其注意门框边缘以及出风回风口，不能留有死角；空气消毒宜采用臭氧或者紫外灯。
可以使用专门的臭氧发生器产生臭氧进行消毒，也可以在每一个操作间包括净化台安装适宜功率的紫外灯，一方面紫外线可以对近距离的物体表面进行消毒，另一方面紫外线的作用也可以使空气中的氧气转换成臭氧，从而能够杀死空气中的微生物。
另外在每次做完实验之后，都应当对实验台面以及地面进行消毒处理。
第二部分：检验过程整个无菌室的检验操作过程应当有一个标准的操作规范，严格按照无菌操作的规定进行操作，包括进入无菌室的程序以及人员清洁消毒，都应当遵守标准来进行。
首先，进入无菌室应当严格按照洁净区（室）有关规定进行。
进入之前先进行洗手消毒，在一更换鞋，脱去外衣，进入二更，穿洁净工作服，注意穿戴洁净工作衣帽时必须做到衣服的任何部位不得拖地。
<1223>微生物检验替代方法的验证引言本通则目的是为使用法定药典微生物检查方法之外的替代方法所进行的验证提供指南。
对于微生物的回收和鉴定，微生物检验实验室出于各种不同的原因，如成本、工作量和效率，有时会使用药典附录方法之外的替代方法。
这些方法必须经过验证。
在凡例与要求中的检测与含量测定中提供了一些使用替代方法的验证指南。
这一节还说明，在发生争议时，只有使用药典方法所得到的结果才是决定性的。
微生物替代方法的验证研究应考虑到很大程度的变异。
例如，在使用常规平板计数法进行微生物检测时，经常要面对比通常使用化学分析方法所得到的（RSD为1%〜3%）更为宽泛的结果范围（RSD为15%〜35%）。
许多常用的微生物检验方法容易受到抽样误差、稀释误差、浇碟误差、培养误差和操作误差的影响。
药典分析方法验证<1225>定义了一些在分析方法验证中需要应用的术语，如准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围、重现性和耐用性。
这些定义对于回答“至少与药典方法相当”这一问题所进行的微生物检验替代方法的验证而言是不很适宜的。
（见凡例与要求中的检测与含量测定）。
关键的问题是替代方法将产生的结果能否相当于或优于传统方法。
其他行业组织也提供了微生物检验替代方法的验证指导原则。
通过比较研究USP方法和替代方法来证明新方法或修改后的方法的适用性。
本章定义的特性，可用于建立这种比较。
微生物检验的类型验证的关键点是要确认检验方法中使用了替代技术的哪部分。
例如，有各种技术可用于检测活细胞的存在。
这些技术可能会被各种检验方法所采用（例如，生物负荷，无菌检查），但亊实上，并没有完全地替代检验方法的关键方面。
例如，使用结合有回收培养基的特殊过滤器并按药典规定的程序用薄膜过滤法进行无菌检査，然后使用一些现有的技术来证明活细胞的存在。
对这种方法进行验证，只需要针对所使用的回收系统而不必是整个方法。
针对微生物检验主要有三种检验类型。
药品质量标准分析方法验证指导原则《中国药典》2015年版药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应检测要求。
在建立药品质量标准时,分析方法需经验证；在药品生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时,则质量标准分析方法也需进行验证。
方法验证理由、过程和结果均应记载在药品质量标准起草说明或修订说明中。
生物制品质量控制中采用的方法包括理化分析方法和生物学测定方法，其中理化分析方法的验证原则与化学药品基本相同，所以可参照本指导原则进行，但在进行具体验证时还需要结合生物制品的特点考虑；相对于理化分析方法而言，生物学测定方法存在更多的影响因素，因此本指导原则不涉及生物学测定方法验证的内容。
验证的分析项目有：鉴别试验、限量或定量检查、原料药或制剂中有效成分含量测定，以及制剂中其他成分（如防腐剂等，中药中其他残留物、添加剂等）的测定。
药品溶出度、释放度等检查中，其溶出量等的测定方法也应进行必要验证。
验证指标有：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。
在分析方法验证中，须采用标准物质进行试验。
由于分析方法具有各自的特点，并随分析对象而变化，因此需要视具体方法拟订验证的指标.表1中列出的分析项目和相应的验证指标可供参考。
一、准确度准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（％）表示.准确度应在规定的范围内测定。
1。
化学药含量测定方法的准确度原料药采用对照品进行测定，或用本法所得结果与已知准确度的另一个方法测定的结果进行比较。
制剂可在处方量空白辅料中,加入已知量被测物对照品进行测定。
如不能得到制剂辅料的全部组分，可向待测制剂中加入已知量的被测物对照品进行测定，或用所建立方法的测定结果与已知准确度的另一种方法测定结果进行比较。
准确度也可由所测定的精密度、线性和专属性推算出来。
2。
化学药杂质定量测定的准确度可向原料药或制剂处方量空白辅料中加入已知量杂质进行测定。
9203药品微生物实验室质量管理指导原则控。
本指导原则将对微生物限度检查方法和标准中的特定内容及应用做进一步的说明。
1.非无菌产品微生物限度检査过程中，如使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。
2.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法应尽量选择微生物计数方法中操作简便、快速的方法，同时，所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。
对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。
3.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查，以保证药品微生物检验用培养基的质量。
对照培养基由中国食品药品检定研究院研制及分发。
4.进行微生物计数方法适用性试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法适用性试验。
此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，最高稀释级供试液的选择根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则而确定，如供试品应符合的微生物限度标准是l g需氧菌总数不得过103cfu,那么最髙稀释级是1:103。
若采用允许的最高稀释级供试液进行方法适用性试验还存在1株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么应选择回收情况最接近要求的方法进行供试品的检测。
如某种产品对某试验菌有较强的抑菌性能，采用薄膜过滤法的回收率为40%,而采用培养基稀释法的回收率为30%，那么应选择薄膜过滤法进行该供试品的检测。
在此情况下，生产单位或研制单位应根据原辅料的微生物质量、生产工艺及产品特性进行产品的风险评估，以保证检验方法的可靠性，从而保证产品质量。
药品微生物检验替代方法验证指导原则本指导原则是为所采用的试验方法能否替代药典规定的方法用于药品微生物的检验提供指导。
随着微生物学的迅速发展，制药领域不断引入了一些新的微生物检验技术，大体可分为三类：（1)基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等；(2)直接测定被测介质中活微生物的检验技术，如固相细胞技术法、流式细胞计数法等；（3)基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。
这些方法与传统检查方法比较，或简便快速，或具有实时或近实时监控的潜力，使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同时新技术的使用也促进了生产成本降低及检验水平的提高。
在控制药品微生物质量中，微生物实验室出于各种原因如成本、生产量、快速简便及提高药品质量等需要而采用非药典规定的检验方法（即替代方法）时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。
微生物检验的类型及验证参数药品微生物检验方法主要分两种类型：定性试验和定量试验。
定性试验就是测定样品中是否存在活的微生物，如无菌检查及控制菌检査。
定量试验就是测定样品中存在的微生物数量，如菌落计数试验。
由于生物试验的特殊性，如微生物检验方法中的抽样误差、稀释误差、操作误差、培养误差和计数误差都会对检验结果造成影响，因此，药品质量标准分析方法验证指导原则（附录XIX A)不完全适宜于微生物替代方法的验证。
药品微生物检验替代方法的验证参数见表1。
表1 不同微生物检验类型验证参数注：尽管替代方法的验证参数与药品质量标准分析方法验证参数有相似之处，但是其具体的内容是依据微生物检验特点而设立的。
替代方法验证的实验结果需进行统计分析，当替代方法属于定性检验时，一般采用非参数的统计技术；当替代方法属于定量检验时，需要采用参数统计技术。
进行微生物替代方法的验证时，若替代方法只是针对药典方法中的某一环节进行技术修改，此时，需要验证的对象仅是该项替代技术而不是整个检验方法。
如无菌试验若改为使用含培养基的过滤器，然后通过适宜的技术确认活的微生物存在，那么，验证时仅需验证所用的微生物回收系统而不是整个无菌试验方法。
替代方法验证的一般要求在开展替代方法对样品检验的适用性验证前，有必要对替代方法有一个全面的了解。
首先，所选用的替代方法应具备必要的方法适用性证据，表明在不含样品的情况下，替代方法在不同类型的微生物检验中所具有的专属性、精密度和检测限等参数。
这些证据或由替代方法的研发者提供，或由方法使用者完成。
使用者在基本确认替代方法的适用性后，应采用样品按表1规定的参数逐一进行验证，以确认替代方法可否用于该样品的检验。
验证至少使用2个批号的样品.每批样品应平行进行至少3次独立实验。
在开展各参数验证时，涉及的菌种除应包括微生物限度检査法（附录XI J)和无菌检査法（附录XI H)中培养基适用性检查规定的菌株外，还应根据替代方法及样品的特点增加相应的菌株。
各菌种应分别进行验证。
样品中微生物定性检验方法的验证1．专属性微生物定性检验的专属性是指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力。
当替代方法以微生物生长作为判断微生物是否存在时，其专属性验证时应确认所用培养基的促生长试验，还应考虑样品的存在对检验结果的影响。
当替代方法不是以微生物生长作为判断指标时，其专属性验证应确认检测系统中的外来成分不得干扰试验而影响结果，如确认样品的存在不会对检验结果造成影响。
采用替代方法进行控制菌的检验，还应选择与控制菌具有类似特性的菌株作为验证对象。
2．检测限微生物定性检验的检测限是指在替代方法设定的检验条件下，样品中能被检出的微生物的最低数量。
由于微生物所具有的特殊性质，检测限是指在稀释或培养之前初始样品所含有的微生物数量，而不是指检验过程中某一环节的供试液中所含有的微生物数量。
例如，微生物限度检查中规定不得检出沙门菌，对检测限而言，是指每10g样品中能被检出的沙门菌的最低数量。
检测限确定的方法是在样品中接种较低浓度的试验菌(每单位不超过5cfu),然后分别采用药典方法和替代方法对该试验菌进行检验，以检出与否来比较两种方法的差异。
试验菌的接种量须根据试验而定，以接种后采用药典方法50%的样品可检出该试验菌为宜。
检测限验证至少应重复进行5次。
对于同一种试验菌可采用卡方检验（X2)来评价两种方法的检测限是否存在差异。
3．重现性微生物定性检验的重现性是指相同的样品在正常的实验条件（如实验地点、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。
重现性可视为微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。
方法使用者应优先测定该验证参数。
在样品中接种一定数量的试验菌（接种量应在检测限以上），采用药典方法和替代方法，分别由不同人员，在不同时间，使用不同的试剂（或仪器）进行检验，采用卡方检验（X2)来评价两种方法的重现性是否存在差异。
验证过程中，应关注样品的一致性。
4．耐用性微生物定性检验的耐用性是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。
方法使用者应优先测定该验证参数。
与药典方法比较,若替代方法检验条件较为苛刻，则应在方法中加以说明。
替代方法与药典方法的耐用性比较不是必须的，但应单独对替代方法的耐用性进行评价，以便使用者了解方法的关键操作点。
样品中微生物定量检验方法的验证微生物定量检验一般都涉及菌落计数。
对计数结果进行数据处理时通常需要使用统计的方法。
由于菌落计数服从泊松分布，因此采用泊松分布的统计方法对计数结果进行数据处理优于采用正态分布的统计方法。
检验者往往习惯采用正态分布的统计方法，因此也可以通过对数转换或平方根加1的方法将原始数据转换为正态分布数据后再进行统计分析。
两种统计方法都适用于微生物数据的统计分析。
1．准确度微生物定量检验的准确度是指替代方法的检验结果与药典方法检验结果一致的程度。
准确度的确认应在检测的范围内，通常用微生物的回收率（％)来表示。
检测范围内的准确度都应符合要求，准确度验证的方法是：制备试验菌的菌悬液，菌悬液的浓度应选择为能够准确计数的最高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于l0cfu/ml）、例如，菌落计数平皿法的替代方法，在制备高浓度菌悬液时，其浓度可以是103cfu/ml,并系列稀释至100cfu/ml。
每个试验菌应至少选择5个菌浓度进行准确度确认，替代方法的检验结果不得少于药典方法检验结果的70%，也可以采用合适的统计学方法表明替代方法的回收率至少与药典方法一致。
当替代方法的回收率高于药典方法时，有必要结合专属性项下的有关内容对准确度进行评价。
2．精密度微生物定量检验的精密度是指在检验范围内，对同一个均匀的样品多次重复取样测定，其检验结果的一致程度，通常采用标准偏差或相对标准偏差来表示，也可以采用其他适宜的方式。
精密度验证的方法是：制备试验菌的菌悬液，菌悬液的浓度应选择为能够准确读数的最高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于l0cfu/ml)。
每个试验菌选择其中至少5个浓度的菌悬液进行检验。
每一个浓度至少应进行10次重复检验，以便能够采用统计分析方法得到标准偏差或相对标准偏差。
一般情况下，可以接受的相对标准偏差（RSD)应不大于35%。
不考虑特殊的检验结果，替代方法的相对标准偏差（RSD)应不大于药典方法。
例如，药典菌落计数平皿法其可接受的相对标准偏差（RSD)与含菌浓度的关系见表2。
表2不同含菌浓度下预期的相对标准偏差3．专属性微生物定量检验的专属性是指通过检测适宜的试验菌，以证明检验方法与其设定目的相适应的能力。
例如，菌落计数平皿法其设定目的在于检出一定数量的微生物，则其专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时，通过平皿法检验，能够检出试验菌，而样品的存在不会对结果造成影响。
专厲性验证时，应能够设计出可能使替代方法出现假阳性的实验模型来挑战替代方法，从而确认替代方法的适用性。
当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时（如不需要增菌或在1〜50cfu范围内就可直接测定菌数的定量方法），以上验证方式就显得更为重要。
4．定量限微生物定量检验的定量限是指样品中能被准确定量测定的微生物最低数量。
由于无法得到含有已知微生物数量的实验样品，因此,在定量限验证时,应选择在检验范围内至少5个菌浓度，每个浓度重复取样测定不少于5次，替代方法的定量限不得大于药典方法。
需要注意的是，由于细菌计数和菌落数服从泊松分布,可能存在计数结果的误差，因此替代方法的定量限仅需证实在相近的低限度下其灵敏度至少相当于药典方法。
定量限验证的方法是：在检验范围的低限制备5份不同含菌浓度的菌悬液，每份菌悬液分别用药典方法和替代方法进行不少于5次检验，采用统计方法比较替代方法的检验结果与药典方法结果的差异，从而评价替代方法的定量限。
5．线性微生物定量检验的线性是指在一定范围内，检验结果与样品中微生物数量成比例关系的程度。
线性验证时必须覆盖能够准确测定的所有浓度范围。
每株试验菌应选择至少5个浓度，每个浓度至少测定5次。
根据以上实验数据，以检验结果为因变量，以样品中微生物的预期数量为自变量进行线性回归分析，计算相关系数r。
当相关系数不能准确评估线性时，只能确定简单大约的关系值。
替代方法的相关系数不得低于0.95。
6．范围微生物定量检验的范围是指能够达到一定的准确度、精密度和线性，检验方法适用的高低限浓度或数量的区间。
7．重现性微生物定量检验的重现性是指相同的样品在正常的实验条件（如实验地点、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。
重现性可视为微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。
方法使用者应优先测定该验证参数。
在样品中接种一定数量的试验菌（接种量应在定量限以上），采用药典方法和替代方法，分别由不同人员，在不同时间，使用不同的试剂（或仪器）进行检验，对检验结果进行统计分析，以相对标准偏差（RSD)来评价两种方法的重现性差异。
验证过程中，应关注样品的一致性。
8．耐用性微生物定量检验的耐用性是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。
方法使用者应优先测定该验证参数。
与药典方法比较，若替代方法检验条件较为苛刻，则应在方法中加以说明。
替代方法与药典方法的耐用性比较不是必须的，但应单独对替代方法的耐用性进行评价，以便使用者了解方法的关键操作点。
