微生物检验方法验证共22页

药品微生物限度检查及方法验证从事药品微生物限度检查工作两年时间，从学做到承担工作到变得有点经验，经历了一个摸索、学习和积累的过程，回过头来做一个总结，把一些零散的经验和体会做一个梳理和归整，以供在此岗位工作的同仁参考。

第一部分：外围工作外围工作主要有器皿清洗、灭菌，培养基、试剂配制及灭菌，无菌室清洁消毒等。

器皿的清洗是每个实验室和每一个实验员必须要做的最起码的工作，工作要求简单，操作方便，把握一个原则：干净。

培养基、试剂配制后一般都要求调PH到7.20，因为高温灭菌之后PH值会下降0.2左右。

固体培养基在灭菌前要先加热煮沸，使琼脂均匀分散。

煮沸时要注意不要溢出容器，以免发生烫伤。

万一不小心溢出，可用一湿抹布盖住容器口，迅速将其从加热源上移开，不要在情急之下徒手去拿或者在容器侧面拿，那样容易被从容器口源源不断溢出的培养基烫伤。

液体物品灭菌后，不能立即打开放气阀放气，因为此时被灭菌物品的温度大于100℃，在压力等于常压时，液体会暴沸，造成液体喷出或容器炸裂，发生事故。

万级洁净度的无菌室应当每周进行一次消毒，消毒剂每月更换一次，防止长期使用同一种消毒剂而使微生物形成耐药性。

消毒范围包括墙壁，地面，天花板以及空气。

表面消毒可以用消毒剂擦拭，尤其注意门框边缘以及出风回风口，不能留有死角；空气消毒宜采用臭氧或者紫外灯。

可以使用专门的臭氧发生器产生臭氧进行消毒，也可以在每一个操作间包括净化台安装适宜功率的紫外灯，一方面紫外线可以对近距离的物体表面进行消毒，另一方面紫外线的作用也可以使空气中的氧气转换成臭氧，从而能够杀死空气中的微生物。

另外在每次做完实验之后，都应当对实验台面以及地面进行消毒处理。

第二部分：检验过程整个无菌室的检验操作过程应当有一个标准的操作规范，严格按照无菌操作的规定进行操作，包括进入无菌室的程序以及人员清洁消毒，都应当遵守标准来进行。

首先，进入无菌室应当严格按照洁净区（室）有关规定进行。

进入之前先进行洗手消毒，在一更换鞋，脱去外衣，进入二更，穿洁净工作服，注意穿戴洁净工作衣帽时必须做到衣服的任何部位不得拖地。

微生物限度检查方法验证方案微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。

验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。

3.规性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。

4.验证实施：4.4.1 试验前的准备:4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天使用。

4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周使用。

4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周使用。

4.4.2 试验菌的制备和稀释：4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。

速效心痛滴丸2.微生物限度检查参照中国药典2005年版一部要求，对微生物限度检查作验证试验如下：2．1微生物限度检查法验证实验2.1.1.验证用菌种：金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003、枯草杆菌CMCC （B）63 501、大肠埃希菌CMCC（B）44 102、白色念珠菌CMCC（F）98 001、黑曲霉CMCC（F）98 0032.1.2方法：中国药典2005年版附录一部XIII C 微生物限度检查方法验证试验。

2.1.3操作方法：（1）菌液制备：a. 取经37℃培养24h金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。

b. 取经25℃培养24h的白色念珠菌肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。

c. 取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，用5ml生理盐水洗下霉菌孢子，吸取菌液，用标准比浊管比浊，然后取1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-4（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。

（2）供试液制备：称取供试品10g，研细，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪，混匀，作为1:10的供试液，分别人工污染上述5种代表实验菌株。

（3）回收率测定a. 实验组：取1:10供试液1ml和1ml实验菌液同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时，观察计数。

b. 活菌组：照上述方法测定每1菌株的实验菌数。

c. 供试液对照：测定供试品本底菌数。

d. 稀释剂对照组，取稀释液同法操作，测定，应无菌生长。

4.结果：菌落计数结果，回收率实验结果，见表2、表3：表2 菌落计数（cfu/ml）从表3可知，玉屏风泡腾颗粒样品处理后，按常规法进行微生物限度检查，供试品对5种菌株的回收率试验均高于70%可采用此法检验。

微生物限度方法学验证 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。

二、菌种、培养基及稀释液表2培养基表3对照用培养基表4试剂稀释液：（1）缓冲液取L磷酸二氢钾溶液250ml,加L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。

（2）%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。

（3）％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 ，用％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。

（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。

三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。

上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。

2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。

用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。

微生物限度检查方法验证XX公司微生物限度检查方法验证方案目录1. 验证目的2.验证小组及职责分工2.1验证小组2.2职责分工3.验证程序4.验证结论及综合评价1. 验证目的确认所采用的细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法适合该药品的微生物限度检查。

2.验证小组及职责分工2.1验证小组组长：小组成员：2.2职责分工组长：负责验证期间各部门的协调及整个验证过程的具体实施。

分析中心（微生物室）：负责验证方案的起草及具体实施，确保验证过程能按方案规定的程序进行，对各种验证资料（验证结果）应及时交与GMP组相关人员整理。

GMP办：负责验证方案的编写规范；负责各种验证资料（检查结果）的收集整理及结果的审核；审查验证报告及发放验证报告。

质量管理部：参与验证方案的编制；负责验证方案的审核及批准；负责出具检验报告；并对微生物限度检查环境进行检测；负责验证文件的管理。

3．验证内容3.1品种：XXXX；批号：。

3.2培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，批号；霉菌液体培养基，批号；营养肉汤培养基，批号；营养琼脂培养基，批号；0.1%蛋白胨溶液，批号；虎红钠琼脂培养基，批号；由中检所培养基室提供。

（根据检验要求选择适宜的培养基）3.3方法：微生物限度检查方法验证（《中国药典》2005年版）。

3.5计数方法的验证3.5.1 验证试验用菌种：验证试验用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

a.大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B) 44102〕b.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 〔CMCC(B) 26 003〕c.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 〔CMCC(B) 63 501〕d.白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕e.黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F)98 003.5.2菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，培养18～24h；黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基，培养5～7天。

《中国药典》 2005年版微生物限度检查法的方法验证试验目录一、微生物限度检查的意义二、微生物限度检查的范围三、验证的目的四、验证的类型五、验证的过程一、微生物限度检查的意义药品是治病防病，关系患者生命健康的特殊商品，必须保证其质量,用药的安全与有效。

微生物污染药品引起的药源性疾病屡见不鲜，在国内外均有报道。

为保证药品质量，必须对微生物污染进行必要的控制和检验。

其意义在于(1)保证药品质量已有许多实例表明，药品污染微生物不仅危机病人用药安全，而且也直接影响药品的有效性，所以药品卫生质量是药品质量不可分割的部分。

(2) 反映药品生产工艺的科学性，合理性及质量管理水平，通过检验，凡工艺条件，生产管理水平，生产人员的素质差，不注意文明生产的单位和企业，其生产的药品，染菌必然严重，不合格率无疑就高。

微生物限度的检验是提供药品卫生质量的重要依据，因而在保证销售与使用过程中药品的有效性和安全性，是促进与提高生产单位全面质量管理水平与提高药品质量的重要措施。

二、微生物限度检查的范围1．根据药品使用要求，把药品化为两大类:(1) 规定灭菌药品:包括注射剂和输液剂，及用于体腔，严重烧伤,溃疡,出血用药等制剂。

(2) 非规定灭菌药品:包括常用口服制剂与一般外用制剂。

对这一部分制剂一般不要求绝对无菌，允许一定限量的微生物存在，但同时规定不得有可疑致病的细菌存在。

由于致病菌的范围很广，各国药典都规定了几个常见的致病菌或指示菌作为控制菌。

2．在非灭菌的各种制剂中，对每克或每毫升的药品按剂型或品种不同规定(1)染菌量检查:包括细菌数，霉菌数及酵母菌数测定，以检查这几类微生物对药品的污染程度。

(2) 控制菌检查:包括大肠埃希菌，大肠菌群，沙门菌，金黄色葡萄球菌及铜绿假单孢菌，生孢羧菌。

3．药品微生物限度检验中的困难，最根本的原因在于检验对象本身的特殊性。

(1) 不确定性:药品受外来微生物的污染，这种污染是可有可无;在有中又可多可少;其种类可以多样.污染的情况依生产,设备,原材料,管理,剂型等等条件而定,非药品本身所固有.所以微生物限度检验的对象是不确定的。

速效心痛滴丸2.微生物限度检查参照中国药典2005年版一部要求，对微生物限度检查作验证试验如下：2．1微生物限度检查法验证实验2.1.1.验证用菌种：金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003、枯草杆菌CMCC （B）63 501、大肠埃希菌CMCC（B）44 102、白色念珠菌CMCC（F）98 001、黑曲霉CMCC（F）98 0032.1.2方法：中国药典2005年版附录一部XIII C 微生物限度检查方法验证试验。

2.1.3操作方法：（1）菌液制备：a. 取经37℃培养24h金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。

b. 取经25℃培养24h的白色念珠菌肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。

c. 取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，用5ml生理盐水洗下霉菌孢子，吸取菌液，用标准比浊管比浊，然后取1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-4（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。

（2）供试液制备：称取供试品10g，研细，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪，混匀，作为1:10的供试液，分别人工污染上述5种代表实验菌株。

（3）回收率测定a. 实验组：取1:10供试液1ml和1ml实验菌液同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时，观察计数。

b. 活菌组：照上述方法测定每1菌株的实验菌数。

c. 供试液对照：测定供试品本底菌数。

d. 稀释剂对照组，取稀释液同法操作，测定，应无菌生长。

4.结果：菌落计数结果，回收率实验结果，见表2、表3：表2 菌落计数（cfu/ml）从表3可知，玉屏风泡腾颗粒样品处理后，按常规法进行微生物限度检查，供试品对5种菌株的回收率试验均高于70%可采用此法检验。

微生物限度检查方法验证方案目录1. 目的 (3)2. 适用范围 (3)3. 参考标准 (3)4. 接受标准 (3)5. 人员职责 (3)6. 抽样计划 (4)7. 设备、试剂和菌种信息 (4)8. 方法适用性试验 (5)9. 文件控制 (6)10. 不合格情况处理 (6)11. 再验证周期 (6)12. 附件清单 (6)1.目的根据中国药典2020版微生物限度检查法的要求，对产品的微生物限度检查法进行验证，以确定所采用的方法适合于本产品的微生物限度检查，即确认本品在该检查量及该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计。

保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。

2.适用范围适用于本司产品的微生物限度检查。

3.参考标准《中华人民共和国药典》（2020版第四部1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的测定》《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的估计》4.接受标准4.1.阴性对照组不长菌；4.2.回收率（试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值）应在0.5~2范围内；4.3.若回收率小于0.5，考虑产品有抑菌性，则重新考虑检查方法的建立。

5.人员职责5.1.成员及其职责详见表一：表一人员及职责5.2.培训要求确保参与验证的所有人员了解其职责和角色，以及验证的过程和要求。

验证开始前，负责本次验证的检验员将对参与确认执行的人员讲解验证的过程和要求，并记录在《培训记录》中。

适用时，培训考核记录作为附录包含在验证报告中。

6. 抽样计划随机抽取3个批次，每个批次随机抽取7套样品。

具体信息详见表二：表二 样品信息确认人/日期： 复核人/日期： 7. 设备、试剂和菌种信息 7.1. 设备信息详见表三表三 设备信息确认人/日期：复核人/日期： 7.2. 试剂信息详见表四表四 试剂信息确认人/日期： 复核人/日期： 7.3. 菌种信息详见表五表五 菌种信息确认人/日期：复核人/日期：7.4.菌液的制备用接种环取枯草芽孢杆菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取金黄色葡萄球菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取铜绿假单胞菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取白色念珠菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取黑曲霉的斜面培养物，向培养物中加入10mL0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，转移孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的孢子悬液。

文件类别：验证文件编号：VF-PR-17-A部门：生产部微生物限度检查方法（平皿法）验证方案版次□新订□替代起草人：起草日期：年月日验证小组审阅方案批准人批准日期：年月日验证实施日期年月日复印数份批准人：分发至：质控部目录一、验证方案的制定二、验证方案的起草与审批三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案1．验证目的和原理2．验证方法步骤3．试验实施3.1试验前的准备3.2验证试验操作3.3试验结果4．验证结果评价分析5．附件微生物限度检查方法（平皿法）验证文件一、验证方案的制定二、验证方案的起草与审批1验证方案的起草2．验证方案的审核与批准验证方案审核人：审核日期：年月日验证方案批准人：批准日期：年月日三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案1．验证目的和原理1.1 验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。

验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。

1.2 原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。

2．验证方法步骤2.1验证前的准备进行微生物限度检查方法（平皿法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。

试验菌应包括G-、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。

2.2验证试验的操作计划用3个不同批号产品按照微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断微生物限度检查方法是否对产品有影响。

2.3试验结果可接受标准用标准菌株评价方法“尿素维生素E乳膏的微生物限度检查”对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组的回收率也不低于70%。

3．试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：高压蒸汽灭菌器、恒温烘干箱、净化工作台、生物安全柜、恒温培养箱、霉菌培养箱。

微生物限度检查方法验证微生物限度检查方法验证报告目录1. 验证目的2. 验证小组及职责分工2.1验证小组2.2职责分工3. 验证程序4. 验证结论及综合评价1. 验证目的确认所采用的细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法适合该药品的微生物限度检查。

2. 验证小组及职责分工2.1 验证小组组长：分析中心主任小组成员：GMP( )、微生物室( )、质量管理部( )2.2 职责分工组长：负责验证期间各部门的协调及整个验证过程的具体实施。

分析中心(微生物室)：负责验证方案的起草及具体实施，确保验证过程能按方案规定的程序进行，对各种验证资料(验证结果)应及时交与GMP组相关人员整理。

GMP fi:负责验证方案的编写规范；负责各种验证资料(检查结果)的收集整理及结果的审核；审查验证报告及发放验证报告。

质量管理部:参与验证方案的编制；负责验证方案的审核及批准；负责出具检验报告；并对微生物限度检查环境进行检测；负责验证文件的管理。

3．验证内容3.1品种：XXXX口服溶液；批号：。

3.2 方法:微生物限度检查方法验证(《中国药典》2005年版) 。

3.3 计数方法的验证3.3.1 验证试验用菌种：验证试验用的菌株传代次数不得超过5 代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代)，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

a. 大肠埃希菌(Escherichia coli) 〔CMCC(B) 26 003〕b. 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 〔C M CC(B) 26 003〕c. 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) 〔CMCC(B) 63 501〕d. 白色念珠菌(Candida albicans) 〔CMCC(F) 98 001〕e. 黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F)98 003.3.2 菌液制备：取经30〜35C培养18〜24小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽抱杆菌肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10—5〜10—7约为50〜100cfu/ml 备用。