流式细胞检测服务之细胞周期

流式细胞仪细胞周期测定步骤
1）将细胞以1×106接种于60mm培养板，80％汇合后转染。

2）24小时后在新鲜培养液中加入适当的抗生素（真核表达载体上的抗性标记）进行培养（该步可选）。

3）48－72小时后用胰酶消化收集细胞，PBS洗两遍，弃上清，加入1ml 70％预冷乙醇中，吹打均匀，4℃固定12小时以上。

4）PBS洗涤去乙醇，1000rpm, 5min，洗两遍。

5）0.5mlPBS重悬细胞，加入PI和 RNaseA至终浓度50µg/ml，37℃ 温浴30 min。

6）用流式细胞仪测定周期。

PI：碘化丙啶，以PBS配成1mg/ml，4℃保存。

RNaseA：10mg/ml
应用：通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测细胞的增殖、凋亡。

流式细胞仪细胞周期测定经验:1.在测定细胞周期的时候（以BD公司的Calibur为例），除了设置好获取数据的模版外，另外设置以FL3为横坐标的直方图，测量模式为对数（log），调整放大倍数，使二倍体峰出现在横坐标10*3的位置，就很容易的找到了二倍体峰和细胞周期个时相细胞的分布情况。

根据它再调节FL2（线性模式下）的放大倍数，使二倍体峰在10*2的位置即可。

利用流式细胞仪分析细胞存活率细胞周期ROS 流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究领域的技术，可用于分析细胞数量、形态、存活率、细胞周期等多个参数。

下面将详细介绍如何利用流式细胞仪来分析细胞存活率、细胞周期和ROS （Reactive Oxygen Species）。

一、分析细胞存活率细胞存活率是研究细胞毒性或细胞凋亡过程中的重要参数。

在流式细胞仪中，常用细胞染色剂PI（Propidium Iodide）来评估细胞的存活率。

PI是一种能够穿透破损细胞膜并结合DNA的染色剂，可以通过荧光检测器来测量。

具体操作步骤如下：1.培养待测试的细胞，并将细胞备样。

可以使用PBS洗涤一遍，以获得单细胞悬浮液。

2. 使用细胞培养基或PBS将细胞悬浮液稀释至合适的细胞浓度，通常在1×10^6 - 1×10^7 cells/mL之间。

3.加入适量的PI染色剂到细胞悬浮液中，一般终浓度为1-10μg/mL。

4.在黑暗条件下，在4°C冷藏室中孵育15-30分钟，避免光照和温度升高。

5.使用流式细胞仪进行测量。

设置PI染色剂的激发波长和检测通道，根据实验需要选择适当的过滤器。

6. 将细胞悬浮液转移到流式细胞仪的样本管中，进行数据采集和分析。

可以设置门控（gating）策略以排除细胞碎片和颗粒物。

通过分析样本中PI染色的细胞数量，可以计算出细胞的存活率。

二、分析细胞周期细胞周期分析是研究细胞增殖和凋亡机制的一项重要实验。

在流式细胞仪中，通过DNA染色剂染色和分析可以了解细胞的周期分布情况。

具体操作步骤如下：1.培养待测试的细胞，并将细胞备样。

可以使用PBS洗涤一遍，以获得单细胞悬浮液。

2. 使用细胞培养基或PBS将细胞悬浮液稀释至合适的细胞浓度，通常在1×10^6 - 1×10^7 cells/mL之间。

3.用酒精或细胞固定液固定细胞，一般在-20°C的环境中固定20-30分钟。

流式细胞术测定细胞周期一、实验原理碘化丙锭（PI）可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA 消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA 含量的多少。

由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。

因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M 期,并可通过Multicycle软件计算各时相的百分率。

值得注意的是, PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。

乙醇通常为终浓度为70%的冷乙醇。

二、实验准备1、试剂胰酶、PBS、纯乙醇（4℃）、RNase A、Triton X-1002、主要器材300目尼龙过滤网三、实验步骤1、每个样品细胞数不得少于100万。

2、胰酶消化，收集细胞（贴壁细胞）或1000rpm离心5分钟直接收集细胞（悬浮细胞）。

3、4℃ PBS洗一次，将细胞重悬于0.3ml 4℃ PBS，加入0.7ml 4℃的纯乙醇，将枪头伸入液面下，轻轻打入乙醇，轻柔混匀两次，4℃固定过夜。

4、1000rpm离心5分钟，去上清，加入染色缓冲液PI染色缓冲液：50 μg/ml PI0.1 mg/ml RNase A0.05% Triton X-100总体积1ml/样品，37℃孵育40分钟。

5、1000rpm 离心5分钟，小心去除上清，加入1ml PBS，轻柔混匀，300目过滤，上机检测。

流式细胞仪分析DNA（细胞周期）通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M/%，借此可以了解细胞的增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。

正常细胞具有较恒定的DNA含量，而细胞癌变过程中结构和/或染色体的异常是很常见的。

这种变化在流式分析中以DNA倍体指数的形式表现出来，这一指数对于肿瘤的早期诊断，交界瘤、间叶组织肿瘤的良恶性判断提供了重要的辅助指标。

细胞周期操作步骤：1. 收获细胞于流式管中，加入3-4ml的PBS清洗细胞。

2. 1000rpm离心10分钟，弃上清。

3. 逐滴加入5ml或更多预冷的70-80%的乙醇，涡旋混匀细胞，4°C避光过夜（>18小时）。

4. 1000-1500rpm 离心细胞10分钟，弃上清。

之后清洗细胞2次以去除所有的乙醇。

注：第一次用1x PBS，第二次用染色液（货号：554656）。

5. 细胞染色：每管样本需10^6细胞。

具体操作如下：1) 对于PI/RNase 染色，将细胞重悬于0.5 mL PI/RNase 染色液（货号：550825）。

2) 对于7-AAD染色，将细胞重悬于0.1 mL 染色液（货号：554656），同时加入20 μL7-AAD 染色液（货号：559925）6. 室温避光孵育15分钟。

7. 分析前4°C避光保存样本。

1小时之内上流式细胞仪检测。

正常细胞周期分析细胞周期检测所需产品：使用说明：DNA染料，尤其是PI，具有较强的粘性。

样本上机检测之后，应遵照仪器说明书仔细清洗流式细胞仪，以免对下一位操作者结果造成影响。

固定好的细胞可保存长达12个月(储存于70-80% 的乙醇，置于-20°C保存).。

流式细胞检测内容
流式细胞检测是一种用于分析单个细胞的技术，通过流式细胞仪可以对细胞进行高通量的检测和分析。

流式细胞检测可以提供关于细胞的多个参数的信息，包括形态、大小、表面标记物的表达水平和分布、细胞周期状态等等。

流式细胞检测的内容主要包括以下几个方面：
1. 细胞计数和活力分析：通过测量细胞数量来评估样品中细胞的浓度，并通过活细胞染色来分析细胞的存活率。

2. 表面标记物分析：利用荧光标记的抗体或其他可特异性结合到细胞表面的分子来分析细胞表面标记物的表达水平和分布情况。

3. 细胞周期和DNA含量：通过核酸染色剂如荧光素染色剂或DNA特异性抗体来分析细胞的DNA含量、细胞周期和细胞增殖状态。

4. 免疫细胞功能分析：通过检测细胞的细胞因子分泌、胞外泌液和细胞内蛋白的表达来评估和分析细胞的免疫功能。

5. 细胞凋亡分析：通过核酸染色剂和特定的抗体来检测细胞凋亡的特征，如细胞核形态变化和磷酸化的蛋白质表达。

6. 细胞排序：根据细胞表面标记物的表达水平，可以使用流式细胞仪将特定类型的细胞分离、分选和收集。

通过对以上内容的分析，可以获得关于样品中细胞的多个参数和特性的信息，从而进行进一步的研究和分析。

流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程哎呀，这可是个不简单的活儿啊！今天我们就要聊聊流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程。

话说这个方法可是科学家们研究细胞生长和分裂的重要工具呢，那咱们就好好聊聊吧！咱们得明白什么是细胞周期。

简单来说，就是细胞从一个生命周期阶段到另一个阶段的过程。

就像人一样，从出生到长大再到老去，每个阶段都有不同的特点和任务。

而细胞也是这样，它们也有自己的生命周期，从分裂开始，到分化成不同的细胞类型，再到死亡或修复损伤。

如何知道这些细胞在什么时候开始分裂、什么时候结束呢？这就需要用到流式细胞术了。

流式细胞术的原理其实很简单，就是通过激光或其他光源对细胞进行照射，然后利用特殊的摄像头捕捉不同颜色的荧光染料标记的细胞。

这些荧光染料会因为细胞内部的某些分子而发光，所以我们可以通过观察荧光的颜色和强度来判断细胞的状态和位置。

咱们就来看看流式细胞术的技术流程吧。

第一步，准备工作。

先要把待检测的细胞样本准备好，然后把它们稀释到一定浓度，这样可以让更多的地方都能看到荧光信号。

接着，要把样品放到流式细胞仪上，这里有一个小技巧：要尽量让样品均匀分布，这样才能保证检测结果的准确性哦！第二步，激光照射。

这时候要用到激光器或者其他光源对样品进行照射。

记住啊，这个过程一定要快，否则荧光信号可能会减弱或者消失。

不过不用担心，现在的流式细胞仪都设计得很聪明，能够自动调整激光功率和时间长度，以获得最佳的检测效果。

第三步，数据采集。

照射完成后，流式细胞仪就会自动记录下每个荧光信号的位置、强度和持续时间等信息。

这些数据会被传输到电脑上进行分析和处理。

别看这步骤听起来简单，实际上需要非常高的精度和速度才能做到哦！第四步，数据分析。

这一步主要是通过软件对收集到的数据进行分析和比对，找出其中的规律和异常情况。

比如说，我们可以通过观察不同细胞的荧光信号强度来判断它们的生命周期阶段；也可以通过比较不同样品之间的荧光信号差异来寻找潜在的疾病标志物等等。

流式细胞检测细胞周期一、所需试剂1、细胞周期检测试剂盒（1）PI：Propidium Iodide，碘化丙啶，是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光，如果自己买，那就10mg用200mlPBS 溶解，4℃避光保存（0.05mg/ml）（2）RNAase：PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase降解，如果自己买，那就100mg用20mlPBS溶解，200μl分装-20℃避光保存（5mg/ml）2、预冷70%-75%酒精：可用无水乙醇和纯水配制3、预冷PBS4、流式管：可以去医研中心拿二、实验步骤<一>、细胞处理1、种板处理等同功能实验（保证细胞有2-5×10*5个）2、消化细胞，离心(1000r/300g 5min)收集细胞沉淀。

3、用预冷的PBS清洗细胞1-2次。

4、离心(1000r/300g 5min)收集细胞沉淀5、固定细胞：用0.2ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入2ml预冷70-75%酒精，震荡，4℃固定过夜。

（直接向细胞加入酒精容易使细胞成团，震荡不要过猛，容易使细胞破碎）<二>、细胞染色和检测1、离心（1000r/300g 5min）收集固定的细胞2、2mL的预冷PBS洗细胞一次，离心再次获取细胞沉淀3、染色：加入50μlRNA酶和250μl-450μl PI染色剂（用量根据试剂盒说明书），避光染色5-10min（一般加300μl，保证适当细胞浓度，浓度太高检测速度太快，结果不准；浓度太低检测速度太慢，时间太长）4、上机检测三、注意事项1、流式细胞仪原理看ppt非荧光信号（1）前向角散射光（FSC Forward scatter）细胞相对大小及其表面积（2）侧向角散射光（SSC side scatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性2、PI(碘化丙啶)不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。

细胞周期检测方法细胞周期检测是指利用特定的实验方法和技术来研究和分析细胞的生命周期和不同阶段的变化。

细胞周期是指细胞从一个时间点开始进行DNA复制，到下一个DNA复制结束之间的时间段。

细胞周期检测方法可以帮助我们了解细胞的增殖、分化和死亡过程，并在生物医学研究中发挥重要作用。

本文将介绍几种常用的细胞周期检测方法。

一、流式细胞术流式细胞术是一种常见的细胞周期检测方法，通过利用细胞在流式细胞仪中流动时吸收和散射光的不同特性来分析细胞的周期。

在流式细胞术中，可以使用DNA 染料（如普罗津红或荧光素）将细胞的DNA染成不同浓度的颜色，根据DNA 含量的不同来分析细胞处于不同的细胞周期阶段。

此外，流式细胞术还可以利用蛋白标记和单克隆抗体来检测特定细胞周期蛋白的表达水平。

流式细胞术准确、快速、灵敏，可以同时检测大量的细胞，因此被广泛应用于细胞周期的研究和生物医学领域。

二、免疫荧光染色法免疫荧光染色法是一种利用免疫学技术和荧光探针对特定蛋白进行定位和分析的方法。

在细胞周期检测中，可以利用特定蛋白的表达来反映细胞处于不同的细胞周期阶段。

例如，细胞周期蛋白D（Cyclin D）在G1期表达增加，在细胞周期的S期和G2期表达较低。

通过使用与Cyclin D特异性结合的荧光探针，可以在细胞中观察和分析Cyclin D的表达情况，从而判断细胞处于细胞周期的哪个阶段。

三、细胞核酸染色法细胞核酸染色法主要利用染色剂（如乙锭、Hoechst33342等）染色DNA分子，观察和分析细胞核的形态和DNA含量的变化来判断细胞的细胞周期阶段。

在染色前后使用不同颜色的荧光染料来观察和分析细胞核的变化。

通过测量细胞核中DNA含量的变化，可以确定细胞处于细胞周期的哪个阶段。

此外，细胞核酸染色法还可以与流式细胞术或免疫荧光染色法相结合使用，进一步提高细胞周期的检测准确性和灵敏度。

四、蛋白质组学方法蛋白质组学方法是一种通过比较和分析细胞中蛋白质的表达、修饰和互作来研究细胞功能和生命周期的方法。

PI染色检测细胞周期
1、HepG2细胞培养至70%左右，细胞铺板（60mm小皿），8万/皿，饥饿48小时，加药处理96h（加药组10万/皿）
2、收集培养基，2ml胰酶消化细胞，新培养基3ml重悬，收集细胞悬液，1000rpm，5min离心
3、弃去上清，加入1ml预冷的PBS充分重悬细胞，转移到1.5ml的EP管
4、混匀，4°，600g，5min离心
5、弃去上清，用250ul预冷的PBS重悬细胞，充分重悬，加入至750ul冰浴的无水乙醇，轻轻吹打混匀；
6、用封口膜封口，—20°，4h，最好过夜，可在—20°保存1w左右；
7、染色：
㈠、除去封口膜，加入500ulPBS重悬细胞，4°，600g，5min离心；
㈡、弃去上清，加入1ml预冷的PBS洗涤一次；
㈢、同上离心，弃去上清；
㈣、每管加入200ul PBS +2ul RnaseA（100µg/ml）溶液缓慢充分混匀后，室温，避光孵育30min, 再加2.5ul PI(250µg/ml)，室温避光15min；
㈤、24h内流式检测。

试剂：RnaseA，beyotime,10mg/ml,ST576
PI, beyotime,20 mg/ml,ST512。

基于流式细胞术的细胞周期分析细胞周期是生命科学中一个非常重要的概念。

细胞周期指的是细胞在生命周期中的一次分裂过程的全过程，包括从细胞生长、DNA复制到细胞分裂等一系列过程。

细胞周期的控制与细胞的增殖和分化、肿瘤的发生和发展密切相关。

因此，研究细胞周期对于我们深入了解生命活动、疾病发生机制以及治疗等方面都有着重要意义。

细胞周期的研究手段有很多，其中流式细胞术技术是一种经典且重要的方法。

流式细胞术是一种将细胞悬浮液通过装置推进以获得细胞个体某些特征的技术，它可以同时获得大量的细胞特征信息，包括细胞的大小、形态、DNA含量等参数，并且可以对这些参数进行统计分析。

在细胞周期研究中，通过采用流式细胞术对细胞进行染色分析，可以准确测定细胞周期的各个阶段，对细胞周期的研究提供了非常有力的工具。

细胞周期可以分为四个主要阶段：G1期、S期、G2期和M期。

G1期为生长期，细胞的体积增大，蛋白质合成增加，准备进行DNA复制。

S期为DNA合成期，细胞的DNA复制分为前期和后期两部分，复制完成后，细胞核内将有两套完全相同的DNA序列。

G2期为后生长期，细胞生长和检查DNA复制的准确性。

M期为分裂期，包括前期、中期和后期三个分阶段。

其中中期时细胞染色体粘附到纺锤体纤维上并完成分离，后期时新核膜形成，染色体解缠并核质分划，两个新的细胞膜形成。

在细胞周期分析中，可以通过多种方法染色来区分不同时期的细胞。

例如，DNA染色剂如荧光素-二乙酸盐（PI）染色，可以区分G1期、S期和G2期细胞；利用蛋白质抗体标记技术可以检测细胞的分裂状态，还可以用流式细胞术探测特定分子（如细胞周期蛋白等）的表达量来分析细胞周期进程。

通过不同的染色方式，我们可以精准地区分不同的细胞周期阶段，实现对细胞周期的深入研究。

细胞周期研究的应用范围非常广泛。

在肿瘤学领域，流式细胞术被广泛应用于分析肿瘤细胞的分裂、生长特性和药物处理后的变化。

通过对细胞周期阶段特异性化合物的筛选，可以发现对某些恶性肿瘤的治疗非常有效的药物。

流式细胞仪检测细胞周期原理和方法流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种现代生物学实验技术，主要用于检测和分析细胞的形态、结构、功能及其分子水平的变化。

它通过利用激光传感器探测透过细胞的激光散射或荧光信号，同时可以通过细胞的大小、荧光强度和荧光波长的变化将细胞分为不同的亚群。

流式细胞仪的使用已经广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、生殖医学等领域。

流式细胞仪检测细胞周期的原理主要基于细胞的DNA含量不同于不同细胞周期阶段。

细胞周期通常分为G1期（细胞生长期）、S期（DNA复制期）、G2期（前期）、M期（有丝分裂期）和G0期（休止期）。

在细胞周期中，细胞会通过分子调控机制从一个阶段进入到下一个阶段。

细胞在G1期，其DNA含量为单倍体（2N）。

G1/S转变时，细胞准备开始进入DNA复制期（S期），在S期中，细胞的DNA含量翻倍，达到二倍体（4N）。

接下来，细胞进入G2期，准备进入有丝分裂期（M期），在M期，细胞的DNA含量达到四倍体（8N），细胞核开始分裂。

而G0期，则代表细胞处于休眠或未分裂状态，DNA含量不变（通常是2N）。

1.细胞样本制备：首先需要制备良好的单细胞悬浮液，通常通过细胞消化酶处理细胞集落或组织样本，将细胞分散为单细胞。

同时，还要对细胞进行化学固定或冷冻处理，以保持其形态和结构的完整性。

2.细胞染色：将细胞进行荧光染色或抗体标记。

如果使用荧光染料，可以直接将染料加入到细胞悬浮液中，使其与DNA结合。

如果使用抗体标记，先将抗体与细胞混合，然后再加入荧光二抗进行染色。

3.流式细胞仪检测：将样品注入流式细胞仪仪器中。

细胞悬浮液在仪器中通过微细管道流动，激光通过细胞悬液时，细胞会散射激光，形成散射信号。

同时，荧光标记的细胞也会发出荧光信号。

4.数据分析：通过流式细胞仪仪器，可以获取每个单个细胞的散射与荧光信号。

利用仪器中的分析软件，可以对细胞的散射与荧光信号进行分析和计数。

根据荧光信号强度，可以对细胞进行不同周期阶段的区分和计数。

细胞周期检测点的流式细胞术分析一、概述细胞周期检测点的流式细胞术分析是一种先进的生物学研究方法，它结合了流式细胞术的高通量、高精度特点与细胞周期检测点的关键生物学意义，为研究者提供了深入理解细胞生长、增殖和分化过程的强大工具。

细胞周期是指细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的全过程，包括DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）以及细胞分裂期（M期）。

在每个周期阶段，细胞都会进行特定的生理活动，如DNA复制、蛋白质合成等。

而检测点则是细胞周期中确保各个阶段顺利进行的关键环节，它们能够监测并应对各种可能影响细胞周期进程的内外因素。

流式细胞术是一种可以对细胞进行快速、定量分析和分选的技术。

通过利用不同荧光物质标记的单克隆抗体，流式细胞术能够检测细胞周期中各个阶段的特异性标志物，从而实现对细胞周期的精确分析。

流式细胞术还具有高通量、高灵敏度和高准确性的优点，能够在短时间内处理大量样本，并获取丰富的数据信息。

细胞周期检测点的流式细胞术分析在多个领域具有广泛的应用价值。

在基础研究中，它可以帮助我们深入了解细胞周期的调控机制以及检测点在细胞周期中的作用在临床医学中，它可以用于诊断肿瘤、评估治疗效果以及预测疾病进展等在药物研发中，它可以作为筛选具有细胞周期特异性作用的药物的重要手段。

细胞周期检测点的流式细胞术分析是一种强大的生物学研究方法，它将为我们揭示细胞周期的奥秘提供有力的技术支持。

1. 细胞周期检测点的重要性细胞周期是生物体细胞生长、分裂和繁殖的基础过程，它确保了遗传信息的准确传递和细胞功能的正常维持。

在这个过程中，细胞周期检测点扮演着至关重要的角色。

检测点是细胞周期中的特定阶段，它们能够监测细胞内的各种条件和状态，确保只有在满足特定条件时，细胞才能继续其周期进程。

细胞周期检测点对于维护基因组稳定性至关重要。

在DNA复制和染色体分离的过程中，任何错误都可能导致基因突变或染色体异常，进而影响细胞的正常功能。

流式细胞仪检测细胞周期9、采用流式细胞仪（FCM）研究MG63细胞周期FCM检测细胞周期原理流式细胞仪(flow cytometry或flow cytomyter，FCM)又称荧光活化细胞分拣器(fluorescence activated cell sorter，FACS)是20世纪60年代后期利用激光器和层流流动室而建立的一种用于测定放射性染色体的新技术。

细胞周期(cell cycle)是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程，包含G1期、S期、G2期、M期四个阶段(图1)。

细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂, 结束于它的子细胞的形成，或是细胞的自身死亡。

通常将通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程称为细胞周期。

在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。

用FCM 进行细胞周期分析是通过测定细胞中DNA量而完成的。

测定DNA含量后，可用FCM配备的细胞周期分析软件(例如Becton Dickinson公司的Cell FIT)对其进行自动分析。

此测定的细胞周期按照DNA的量分可为Go/G1期、S期及G2/M期。

FCM检测细胞周期流程①培养MG63细胞在6 孔板内依次放入对照组和3 个实验组钛片各40 片，接种密度为 4 × 105/ ml。

培养至细胞汇合后，每孔加矿化液2． 5 ml( 含10 nmol/L 地塞米松，10 mmol/L β －甘油磷酸钠，50 μg/ml 抗坏血酸的培养液) 。

分别培养3、5、10、15d 后，每组各取出5 个钛片移至新的6 孔板内，将钛片表面细胞消化离心收集。

② PBS清洗经消化收集的细胞2～3次，调整细胞密度为1×106个/ml;③将细胞悬液100ul转移至试管中;④ 加入FITC标记的annexin V和PI溶液，轻轻混匀;⑤室温避光放置10～15min;⑥ 加入400ul缓冲液，将全部液体转移至FCM分析用试管;⑦ 尽快进行FCM分析（用FCM进行细胞周期分析是通过测定细胞中DNA量而完成的。

流式检测细胞周期要点：最关键的就是减少细胞碎片和单细胞悬液的制备！1、细胞消化要理想，资料显示最好消化时加EDTA，可使流式做的很漂亮；2、细胞消化后不可吹打过度，减少细胞破碎；以后的吹打也要注意，尤其是固定后的细胞容易破碎；3、细胞用PBS洗涤离心，转速不超过1000r/min，有文献用800r/min；可考虑在此过程中用300目的尼龙网过滤一遍细胞（有人主张用钢网，以减少细胞与尼龙网粘连的损失，本人认为钢网易损伤细胞，DNA外溢也会造成细胞粘连，所以在细胞数足够的情况下，首选尼龙网）；4、离心后的固定，标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精，而不是向细胞中加酒精，这样是为了减少细胞聚集，这一点很重要，很多人都忽视了！5、一般选择4℃固定过夜；6、加染液前的洗涤仍要注意离心转速的问题；7、关于PI染液的组成及配方，应主要以文献为主，PI（作用为DNA染色剂）的浓度从0.5μg/ml,20μg/ml，到50μg/ml都见报道，响应的求助显示都可出良好结果，RNAs酶（由于PI也可染RNA，故要去除RNA）一般浓度为50μg/ml，配方中的Triton-X-100（曲拉通）主要是通透细胞膜使PI能进入细胞核。

8、检测时细胞要达到1～2×106个细胞（实际检测是1万到2万个细胞），为了既保持初始条件相同，又可搜集到足够的细胞，应选用多孔培养板，在搜集细胞时，浓度大、抑制强的组可多搜集些孔，以保证检测的细胞数量。

如果细胞数量太低，技师为了减少对流式细胞仪的损伤，就会选择高速流（一般的检测用低速流，误差小），检测的质量就会大大下降，数据的说服力就下降了！1.收集细胞；2.3000～5000rpm离心5min，收集沉淀，重悬于200ul的PBS中，再次离心收集沉淀；3.75％冰冻乙醇（-20度保存）4度固定过夜or-20度固定1h；4.离心收集沉淀，PBS洗一次（视沉淀量可忽略）；5.沉淀重悬于200～500ul的PBS，加入Rnase A 37度水浴1h；6.400目纱布过滤至流式管，加入PI染色，4度避光30min-1h，上机器。

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。

↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。

↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析——Flowjo软件分析图片拷贝：直接Ctrl+CFCM-DNA量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S、G2M。

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流式细胞术检测细胞周期
1. 纵坐标Cell Number：即计数到的有效细胞数；
2. 横坐标DNA Content：即DNA量，为什么用DNA量来区别各周期
3. G1、G2、S三期在上图已经用箭头标示；
4. 右侧数字含义：Mean G1=19
5.4即G1期DNA含量平均值为
195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%；
1 G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；
② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；
2 G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时
间；④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。

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3、流式细胞结果图各参数的意义：
前面讲过，常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：
G1期：细胞DNA复制还没有开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；
S 期：细胞开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；
G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第二个峰；
M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤流式细胞仪是一种能够对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。

在细胞生物学研究中，流式细胞仪常用于检测细胞周期，这对于了解细胞的增殖、分化和凋亡等生理过程具有重要意义。

以下是流式细胞仪检测细胞周期的详细操作步骤：一、实验前准备1、细胞培养选择处于对数生长期的细胞进行实验，以保证细胞状态良好且增殖活跃。

根据细胞类型和实验要求，在合适的培养条件下培养细胞。

2、试剂和材料70%乙醇：用于固定细胞。

碘化丙啶（PI）染液：用于染色细胞核中的 DNA。

RNA 酶：用于去除 RNA 对染色的干扰。

磷酸盐缓冲液（PBS）：用于洗涤细胞。

流式细胞仪专用的上样管。

3、仪器设备流式细胞仪，并确保仪器处于正常工作状态，包括光路校准、液流系统稳定等。

离心机：用于离心细胞。

二、细胞收集1、当细胞培养达到所需的密度和状态时，小心吸出培养基。

2、用 PBS 轻轻洗涤细胞两次，以去除残留的培养基和杂质。

3、加入适量的胰蛋白酶或其他细胞解离试剂，将细胞从培养容器表面解离下来。

4、加入含有血清的培养基终止胰蛋白酶的作用，防止过度消化细胞。

5、将细胞悬液转移到离心管中，离心（一般 1000 1500 rpm，510 分钟），使细胞沉淀。

三、细胞固定1、弃去上清液，留下细胞沉淀。

2、缓慢加入预冷的 70%乙醇，边加边轻轻涡旋或吹打细胞，使细胞充分分散在乙醇中。

乙醇的最终浓度应在 70%左右。

3、将细胞在 4°C 下固定至少 1 小时，可固定过夜以确保固定效果。

四、PI 染色1、离心固定后的细胞，弃去乙醇。

2、用 PBS 洗涤细胞两次，以去除残留的乙醇。

3、加入适量的 RNA 酶溶液，在 37°C 水浴中孵育 30 分钟，以去除 RNA 对染色的干扰。

4、加入 PI 染液，使其终浓度达到合适的范围（通常为 50 100μg/mL），在室温下避光孵育 30 分钟。

流式细胞术检测细胞周期流式细胞术在许多题中常用到，但对其结果的分析却不是很清楚。

在此收集点相关资料并以实验中的一张图片为例，大家共同学习。

图中白色箭头及尾部G1,G2,S是我用PS加上去的，方便讨论。

首先来认识下图：1.纵坐标Cell Number：即计数到的有效细胞数；2.横坐标DNA Content：即DNA量，为什么用DNA量来区别各周期我们等下再讲；3.G1、G2、S三期在上图已经用箭头标示；4.右侧数字含义：Mean G1=195.4即G1期DNA含量平均值为195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%；以此类推……下面从细胞周期的角度看各参数的意义：1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。

可分为四个阶段（见图）：①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。

2、从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。

②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。

③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。

细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人了成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。

不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。

3、流式细胞结果图各参数的意义：前面讲过，常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：G1期：细胞DNA复制还没有开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；S 期：细胞开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第二个峰；M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。