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流式细胞仪实验方法一、 实验准备 1． 标本制备：2． 最小化非特异性结合二、凋亡1．凋亡的检测方法： 2．PI 染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL 法三、细胞因子1．激活的细胞因子 2．CBA四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药4．微小残留白血病生物秀www.bb i oo.com第一部分 标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl 的HAB ，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM 检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA ），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展【摘要】：细胞因子具有调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等多种生物学功能。
因此，细胞因子的研究成果为临床上预防、诊断、治疗疾病提供了科学基础，特别是利用细胞因子治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫性疾病等，具有非常广阔的应用前景[1]。
随着细胞表面标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
流式细胞术也成为了检测单细胞水平细胞因子表达能力的重要检测方法。
本文针对流式细胞术在胞内细胞因子检测中的研究进展作一综述。
【关键词】：流式细胞术；细胞内；细胞因子；检测技术引言：细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，能介导细胞之间的相互作用，并在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中起到重要作用。
细胞因子的检测方法一般分为生物学测定法、分子生物学测定法及免疫学测定法。
而目前用于检测单个细胞特定细胞因子表达的手段则包括：多参数流式细胞术，酶联免疫斑点法ELISPOT[2]、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR等生物分析技术。
相较于其它的检测方法，流式细胞术在细胞内细胞因子的检测上具有高效、简便、适应性广等优势。
一、流式细胞术的概述流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。
FCM能够快速分析单个细胞或粒子的多种特性，既可以定性，也可以定量，尤其适用于大量样品检测，已在临床检验工作中得到广泛应用。
流式细胞仪（fluorescenceactivated cell sorter，FACS）的检测分析已涉及到细胞生物学、免疫学、肿瘤学、遗传学、血液学、微生物学等学科。
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
细胞因子化学发光法流式细胞法
细胞因子的免疫学测定方法包括ELISA法、流式细胞仪法和酶联免疫斑点试验法等。
以下是这三种方法的介绍：
- ELISA法：具有特异、简便、易于标准化等优点，可同时检测大量标本。
其缺点是敏感性偏低，不能判断细胞因子的生物学活性。
- 流式细胞仪法：主要用于细胞内细胞因子和细胞表面黏附分子的检测，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或黏附因子的检测，精确判断不同细胞亚群的细胞因子和膜分子的表达情况。
- 酶联免疫斑点试验法：便于观察和计数分泌细胞因子的细胞，一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关。
在选择细胞因子测定方法时，需要根据实验目的和条件进行选择。
如果需要同时检测大量样本，ELISA法可能更为合适；如果需要精确判断不同细胞亚群的细胞因子和膜分子的表达情况，流式细胞仪法可能更为适合。
流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。
Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。
由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。
目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。
因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。
目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。
流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。
我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。
由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。
目前国内外推荐的刺激物主要为PMA （佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。
淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。
由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。
抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。
Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T淋巴细胞。
因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。
材料与方法试剂PMA（Sigma）贮存液：PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃保存。
工作液：贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中，此时为1µg/ml。
流式检测细胞因子实验步骤嘿，咱今儿个就来讲讲流式检测细胞因子实验步骤哈！这可是个挺有意思的事儿呢。
首先呢，你得把要检测的细胞给准备好呀。
这就好比要做饭得先有食材一样，细胞就是咱这实验的“主角”呢。
得让它们乖乖地待在那儿，等着咱来摆弄。
然后呢，就是给细胞加上各种试剂啦。
这就像给菜加调料一样，得恰到好处，不然味道可就不对啦。
不同的试剂有不同的作用，可不能加错咯。
接着，就是让细胞和试剂好好地反应反应。
这时候可不能着急，得给它们足够的时间，就像炖肉得小火慢炖才能入味儿一样。
之后呢，把处理好的细胞放到流式细胞仪里去。
嘿，这流式细胞仪就像是个神奇的“眼睛”，能看出细胞的各种小秘密呢。
在这过程中，可得仔细操作呀，就像走钢丝一样，得小心翼翼的。
一个不小心，可能数据就不准确啦。
等仪器检测完了，就到了分析数据的时候啦。
这可需要你有一双“火眼金睛”，能从那些密密麻麻的数据里看出门道来。
你想想看，这细胞因子就像是细胞之间的“悄悄话”，咱通过这个实验就是要去偷听它们在说啥呢。
这多有趣呀！做这个实验，就像是搭积木一样，一步一步都得稳稳当当的。
要是有一步没弄好，那可能整个“大楼”就塌啦。
所以呀，做流式检测细胞因子实验可不能马虎，得认真对待每一个步骤。
只有这样，才能得到准确可靠的结果呢。
这可不是闹着玩的哟！咱得为科学负责，为自己的实验负责呀！你说是不是这个理儿呢？反正我觉得是这么回事儿！好啦，就说到这儿吧，希望你做实验的时候顺顺利利的哟！。
流式胞内细胞因子检测流式胞内细胞因子检测是一种用于研究细胞因子在单个细胞水平上的表达和分泌的技术。
细胞因子是一类产生于免疫细胞和其他细胞类型中的小分子蛋白质，对于细胞的发育、增殖、分化和功能调节具有重要作用。
流式胞内细胞因子检测可以帮助科研人员了解细胞因子的表达模式、功能和调控机制，从而深入研究细胞免疫学、炎症反应、感染和免疫相关疾病等领域。
流式胞内细胞因子检测的原理是利用单克隆抗体与特定细胞因子结合，然后使用荧光标记的二抗检测这种结合。
首先，需要选取合适的抗体对细胞因子进行检测。
抗体通常选择单克隆抗体，因为其高度特异性和亲和性。
对于胞内细胞因子的检测，首先需要破坏细胞膜，使细胞内的细胞因子释放到胞外液中。
一般来说，可以通过细胞固定和渗透化处理来实现这一步骤。
接着，使用标记有荧光染料的二抗与细胞因子结合，产生荧光信号。
最后，使用流式细胞仪对细胞进行分析，并得到细胞因子的表达和分泌水平。
流式胞内细胞因子检测的优势之一是可以在单个细胞水平上进行分析。
通过研究单个细胞的细胞因子表达水平，可以得到更准确、具体的结果，避免了整体细胞群体的平均值的混淆。
此外，流式胞内细胞因子检测还可以同时分析多种不同细胞因子的表达和分泌水平，可以全面了解细胞因子的调控网络。
另外，流式胞内细胞因子检测还具有高灵敏度和高速度的特点，可以快速得到结果，并且对于微量样品的检测也有很好的表现。
流式胞内细胞因子检测在多个研究领域发挥了重要作用。
在免疫学领域，可以通过检测不同类型免疫细胞中细胞因子的表达水平，了解它们在免疫应答中的作用和调控机制。
在炎症反应研究中，可以检测炎症细胞中细胞因子的表达水平，从而了解炎症反应的机制，并寻找调控炎症的目标。
此外，流式胞内细胞因子检测还可以应用于感染和免疫相关疾病的研究，帮助科研人员了解疾病的发病机制和炎症信号通路。
然而，流式胞内细胞因子检测也存在一些局限性和挑战。
首先，流式胞内细胞因子检测需要选择合适的抗体对特定细胞因子进行检测。
细胞因子检测方法
细胞因子检测方法是一种用于测量和评估细胞因子水平的实验技术。
细胞因子是一类重要的分子信使，它们在免疫调节、炎症反应和细胞信号传递中发挥着关键作用。
通过检测细胞因子的水平，可以更好地了解免疫系统的功能状态，对疾病的诊断和治疗具有重要意义。
目前，常用的细胞因子检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术和多重细胞因子检测技术等。
ELISA是一种常规的实验方法，通过特异性抗体与目标细胞因子结合，然后通过酶标记的二抗进行检测，并测量光学信号来定量细胞因子的水平。
ELISA具有高灵敏度和特异性，常用于检测单个细胞因子的水平。
流式细胞术是一种可以同时检测多个细胞因子的方法。
它基于细胞表面标记和荧光染料，通过流式细胞仪分析细胞因子的表达。
流式细胞术具有高通量和多参数分析的优势，可以同时检测多个细胞因子，为复杂疾病的研究提供了便利。
此外，近年来出现了多重细胞因子检测技术，如Luminex和Bio-Plex等。
这些技术基于微球和荧光染料的原理，可以同时检测上百种细胞因子，具有高通量和高灵敏度的特点。
多重细胞因子检测技术在疾病的诊断和治疗方面有着巨大的潜力。
细胞因子检测方法在临床诊断和研究中发挥着重要作用。
通过测量细胞因子的水平，可以评估免疫功能、炎症反应和疾病进展等，为疾病的早期诊断和治疗提供
了重要的参考依据。
随着技术的不断进步，细胞因子检测方法将持续发展，为临床医学和生物学研究提供更多的可能性。
流式细胞术检测胞内细胞因子的经验分析颜彩玲;张慧;周瑞祥【摘要】目的探讨流式细胞术检测胞内细胞因子的注意事项.方法制备小鼠脾脏淋巴细胞悬液.采用细胞表面抗原CD4、CD25及细胞核内因子FOXP3染色检测调节T细胞,胞内因子TNF-α的检测采用PMA/Iono-mycin,anti-CD3/CD28,PMA/Ionomycin与anti-CD3/CD28联合3种方案进行刺激,比较不同刺激条件下TNF-α胞内因子的表达情况,培养后各组细胞悬液采用固定破膜处理技术进行细胞表面抗原CD3、CD4及细胞内因子TNF-α染色.结果脾脏淋巴细胞悬液制备中研磨、裂解红细胞及染色过程中破膜等操作的不当,均导致前向/侧向(FSC/SSC)点图中目的细胞群模糊不清,从而影响后续分析.新鲜脾脏淋巴细胞得率、CD3+T淋巴细胞得率及TNF-α表达率与冻存的脾脏各类细胞比较,差别无统计学意义(P>0.05).胞内因子TNF-α检测结果显示,刺激组PMA/Ionomycin以及anti-CD3/CD28表达率显著高于未刺激组(P<0.05),PMA/Ionomycin与anti-CD3/CD28联合刺激组的表达率也显著高于未刺激组和独立刺激组(P<0.05).结论流式细胞术胞内细胞因子的检测有很多影响因素,包括脾脏细胞悬液制备中的研磨、裂解红细胞操作,染色处理过程中的破膜、固定,上机检测过程中补偿的调节、对照的设置等均影响实验结果,检测前应注意摸索选择适合待测胞内因子的测定条件.%Objective To investigate factors that may affect the detection of intracellular cytokines with flow cytometry . Methods Splenocytes from mice were disaggregated , and regulatory T cells (Treg) were detected by staining of CD4 ,CD25 ,and intranuclear transcription factor FOXP3 . Forthe detection of TNF-α,splenocytes were stimulated withPMA/Ionomycin ,anti-CD3/CD28 or PMA/Ionomy-cin plus anti-CD3/CD28 ,respectively . Following activation ,the cells were stained with anti-CD3 APC and anti-CD4 FITC ,then intracellularly stained to detect TNF-α after fixation and permeabilization . Controls were designed for both experiments . Results The improper operations in the grinding ,lysing erythrocytes ,fixing and perming the cells all leaded to indistinct target cells of interest in the FSC /SSC dot plots ,which affected the subsequent analysis . There were no significant differences in the percentages of lymphocytes ,CD3+ T lymphocytes ,and TNF-α p roducing cells between the fresh and frozen samples (P>0 .05) . Expression of TNF-αin cells stimulated by PMA/Ionomycin ,anti-CD3/CD28 ,or combined stimulation groups were significantly higher than controls (P<0 .05) . Conclusion Many factors may af-fect the detection of intracellular cytokines by flow cytometry ,including the spleen ,lysing erythrocytes in the preparation of splenocytes suspension ,fixing and perming the cells duringdyeing ,adjusting the com-pensation values ,designing controlled trials and so on . Therefore ,attentions should be paid to explore and select the suitable conditions for studying intracellular factors before testing .【期刊名称】《福建医科大学学报》【年(卷),期】2017(051)005【总页数】8页(P303-310)【关键词】流式细胞术;细胞因子类;小鼠【作者】颜彩玲;张慧;周瑞祥【作者单位】福建医科大学基础医学院 ,福州 350122;福建医科大学新药安全性评价中心,福州 350122;福建医科大学基础医学院 ,福州 350122【正文语种】中文【中图分类】R332;R341.1;R392.21;R977.6辅助性T淋巴细胞(T helper, Th)是人体内免疫系统的重要组成部分。
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。
在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。
目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。
随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T 淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－ )与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin 阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。
在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。
这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。
在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。
且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测点击次数：621 作者：佚名发表于：2008-07-24 15:51转载请注明来自丁香园来源：51protocol一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。
在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。
目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。
随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆">克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆">）与TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但这些研究很难外推，因为T细胞克隆"克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－>克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin（BFA）、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。
在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。
这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。
在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。
且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞（T、B、NK）不能分泌细胞因子。
胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。
具有其它方法难以比拟的优点：快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便；简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs；灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；安全：减少样本处理与生物源性污染接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。
二、所需仪器1、流式上样管及细胞培养皿或板2、25%CO2，37℃孵箱3、混匀振荡器4、离心机5、加样器、Tips6、流式细胞仪三、常用的标本类型和处理方法全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。
如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
自身血浆中外周血单个核细胞（PBMCs）：使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。
组织培养基中的外周血单个核细胞（PBMCs）：用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI－1640培养基中，调节细胞浓度为2×106细胞/ml。
调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。
冰冻全血与PBMCs：使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，－70℃冻存。
溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。
四、所需试剂1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂依据实验需要选择特殊表面标志CD45圈定所有淋巴细胞CD3 圈定T淋巴细胞CD4 圈定T辅助淋巴细胞亚群CD8 圈定T抑制淋巴细胞亚群CD19/或CD20圈定B淋巴细胞CD56圈定NK淋巴细胞CD14圈定单核细胞2、荧光标记的细胞因子抗体R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体3、溶血素用外周全血检测时需使用溶血素（R&D目录号WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目录号00-4333）溶解红细胞4、激活剂① Phorbol 12-Myristate 13 Acetate（PMA）（Alexis，目录号ALX-445-004-M001）DMSO中调节浓度mLL），－20℃储存。
勿反复冻融分装（20每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液终浓度25ng/mL细胞悬液② Ionomycin （Alexis，目录号ALX-450-006-M001）于乙醇中配制成浓度mL－20℃储存每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液g/mL细胞悬液③Ionomycin终浓度1Staphylococcal enterotoxin B（SEB）（Sigma，Catalog ）无菌无叠氮钠PBS调节浓度mL4℃储存g/mL细胞悬液SEB终浓度10④ CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞⑤ CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml5、阻断剂阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内① Brefeldin-A（BFA）（eBioscience，目录号00-4506）于DMSO中调节浓度5mg/mL分装（20L），-20℃储存。
勿反复冻融。
每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液g/mL细胞悬液。
激活最后4－5小时BFA终浓度10注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降② Monensin （eBioscience，目录号00-4505）6、不含谷氨酰胺的RPMI-16407、固定剂细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。
固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。
含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目录号00-8 222）8、破膜剂含1%皂甙、%叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目录号00-8333）将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因子结合9、其它试剂无菌无叠氮钠PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃储存。
五、细胞培养和刺激的基本方法细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。
下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。
表1、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法人TNF-人IL-1人IL-8/CXCL8方法3 (24 小时)人MCP-1/CCL2方法3 (24 小时)人MIP-1a/CCL3方法3 (24 小时)人MIP-1b/CCL4方法3 (24 小时)人RANTES/CCL5方法1小鼠IL-2方法9小鼠IL-4方法10小鼠IL-5方法10小鼠IL-6方法11小鼠IFN方法9 or 方法12小鼠TNF-方法9为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6个小时，需要使用蛋白转运抑制剂（如3uM monensin，10mg/ml的BFA）方法1：只使用转染细胞检测方法2：人的PBMCs使用PMA （10 ng/ml）和Ionomycin （1 uM）刺激4-24 小时.方法3：人的PBMC 使用LPS （ - 1 ug/ml）刺激24 小时.方法4：人的PBMCs或者纯化的CD4＋细胞在包被人CD3抗体的培养板中，使用含有重组人的IL-2（10 ng/ml，目录号202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目录号204-IL-005）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA（10 ng/ml）和Ion omycin （1 uM）刺激6小时20mL于Falcon管中，加入100mL激活后的全血（细胞浓度维持在2×106/mL）混匀，室温暗处孵育15分钟；方法5： CD4 T 细胞使用PHA （10 ng/ml）刺激4 days方法6： T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1b （Lorre, et al., 1994，Clin Immuno Immunopath 70:1）方法7：使用PMA （50 ng/ml）和Ionomycin （500 ng/ml）刺激（10 ng/ml，目录号285-IF-100）刺激2 小时，然后使用IFN（10 ng/ml） LPS（1方法8： P BMCs细胞使用重组人IFN ug/ml）刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.方法9： EL4 在包被抗小鼠CD3抗体（25 ug/ml）的培养板中，使用抗CD28抗体（2 ug/ml） PMA （5ng/ml） Ionomycin（500 ng/ml）刺激6小时方法10：CD4＋T细胞在包被小鼠CD3（25ug/ ml）抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28（2 ug /ml）的抗体，重组小鼠的IL-2（10 ng/ml，目录号402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目录号404-ML-00 5）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA（5 ng/ml）、Ionomycin（500 ng/ml）和monensin刺激6小时。
方法11：小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时方法12：小鼠脾细胞使用PMA（5 ng/ml）和Ionomycin（500 ng/ml）刺激6小时六、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）1、收获细胞肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书），混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时2、阻断Fc受体用于消除非特异性的结合染色①在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。
