流式检测细胞凋亡几种方法的比较

细胞凋亡的几种常见检测方法细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。

细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种用流式细胞仪进行测定的方法。

一、AnnexinV/PI法在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测。

磷脂结合蛋白V（AnnexinV）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与PS具有高度的结合力。

因此，AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。

碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。

因此将Annexin-V与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

方法： 1、悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ulBindingBuffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ulBindingBuffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

2、贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

注意事项：1、整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。

2、操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。

二、Hoechst33342/ PI法：单纯的PI染色能够观察DNA直方图上凋亡细胞的亚G1峰，但只能代表G0/G1期发生凋亡，无法观察S期和G2期发生的细胞凋亡。

而且，细胞经过固定后无法对活细胞和死细胞进行区分。

Hoechst 33342可以穿透细胞膜，进入正常细胞和凋亡细胞，与DNA结合，能在紫外线下显示蓝色荧光，而且染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。

检测细胞凋亡的三种流式方法细胞凋亡（apoptosis）是细胞自主性死亡的过程，是正常细胞发育和组织调控的重要途径。

为了研究细胞凋亡的机制和调控，科学家们发展出了许多方法来检测和定量细胞凋亡的发生。

其中流式细胞术（flow cytometry）是最常用的方法之一，根据不同的细胞特征和所需信息，可以有多种方法用于检测细胞凋亡。

下面将介绍三种常用的流式细胞术方法。

1. 荧光标记的Annexin V/PI双染法：Annexin V是一种细胞外结合蛋白，具有高度特异性结合细胞凋亡的特点。

当细胞凋亡发生时，磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞内翻转至细胞外，而Annexin V能够结合在PS上。

Propidium Iodide（PI）能够穿过损伤的细胞膜，结合到细胞核内的DNA分子上。

通过将Annexin V标记为绿色荧光染料，将PI标记为红色荧光染料，通过流式细胞术定量测量荧光信号的强度，可以区分出未凋亡细胞（Annexin V和PI双阴性），早期凋亡细胞（Annexin V阳性，PI阴性），晚期凋亡和坏死细胞（Annexin V和PI双阳性）等不同状态的细胞。

2.荧光标记的DNA碎片染色法：3. 荧光标记的Caspase活性检测法：Caspases是细胞凋亡过程中的关键酶，它们在给定的信号下被激活并参与调节细胞凋亡的执行阶段。

通过使用荧光标记的Caspase底物，如FLICA系列（Fluorochrome Inhibitor of Caspases）、CaspGLOW系列（Caspase-Glo Kits），可以测量细胞中Caspase的活性。

这些底物在被Caspase酶剪切后会释放出荧光信号，通过流式细胞技术可以测量荧光信号的强度。

由于Caspase活性与细胞凋亡过程密切相关，因此可以利用这些荧光标记底物来定量测量细胞凋亡的发生。

总结起来，流式细胞术是一种非常有效的方法用于检测细胞凋亡的发生。

Annexin V/PI双染法可以定量测量不同状态的细胞，DNA碎片染色法可以测量细胞凋亡的程度，荧光标记的Caspase活性检测法可以测量细胞中Caspase的活性。

细胞凋亡的几种检测方法Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】细胞凋亡的几种检测方法1、形态学观察方法（1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。

（2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。

凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

（3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。

如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。

此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

（4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

2、 DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。

但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。

核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。

检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物，测光吸收制。

用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。

流式细胞仪检测细胞凋亡:PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。

这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。

研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。

许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。

在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。

在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。

此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。

细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。

但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。

因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。

根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。

也可用于活细胞的分类。

试剂与仪器PBS溶液；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。

用棕色瓶4℃避光保存。

70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。

2. 3ml PBS洗涤1次。

3. 离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。

流式细胞仪常用的几种检测方法1.细胞计数和生存率检测：流式细胞仪可以通过测定细胞的大小、形状和胞内染色物来实现细胞计数和生存率的检测。

通过自动聚焦和自动获取图像的功能，可以对大量的细胞进行计数和分析，并得出生存率数据。

2.表面标记检测：流式细胞仪可以利用荧光染料或荧光标记抗体对细胞表面的蛋白质、糖类或其他生物分子进行检测。

这种检测方法主要用于检测细胞表面标记的数量和分布情况，例如测定细胞表面特定抗原的表达水平。

3.细胞周期分析：流式细胞仪可以通过染色剂或荧光标记抗体对细胞进行染色，然后分析细胞在不同细胞周期阶段的比例。

这种检测方法可以用于研究细胞的增殖能力、细胞周期调控机制以及细胞周期与疾病发展的关系。

4.细胞凋亡检测：流式细胞仪可以利用染色剂或荧光标记抗体对细胞凋亡的标志物进行检测。

凋亡是细胞死亡的一种形式，通过测定凋亡细胞的数量和凋亡标志物的表达水平，可以研究细胞凋亡的调控机制以及细胞凋亡与疾病的关系。

5.细胞功能检测：流式细胞仪可以通过检测细胞内Ca2+浓度、ROS （活性氧物种）水平、蛋白质磷酸化等细胞功能指标来研究细胞的信号转导和功能活性。

例如，利用荧光染料可以测定细胞内钙离子的浓度变化，以研究细胞响应外界刺激的机制。

此外，流式细胞仪还可以进行细胞分选、多色细胞分析和细胞细胞间相互作用的研究。

细胞分选功能可以根据细胞标记物的表达水平将细胞分离出来，用于研究特定功能细胞的特性。

多色细胞分析可以用于同时检测多种标记物的表达水平，以揭示不同细胞类型的分子特征。

细胞间相互作用的研究可以通过检测细胞间的共聚或共表达标记物来研究细胞间的相互作用和相互影响。

总的来说，流式细胞仪是一种功能强大的实验室设备，常用于细胞生物学和疾病研究。

通过不同的检测方法，可以在细胞水平上研究细胞的数量、表面标记、周期、凋亡、功能以及细胞间相互作用等方面的特征。

细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在维持机体内稳态和发育过程中起着关键作用。

因此，对细胞凋亡的检测方法研究具有重要意义。

在本文中，我们将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法，以及它们的优缺点和适用范围。

1. 形态学观察法。

形态学观察法是最早用于检测细胞凋亡的方法之一。

通过光学显微镜观察细胞形态的变化，如细胞体积缩小、胞质浓缩、核染色质凝聚和核小体形成等，来判断细胞是否发生凋亡。

这种方法简单直观，但不适用于高通量检测和定量分析。

2. DNA断裂检测法。

DNA断裂是细胞凋亡的一个显著特征，因此可以通过检测DNA 的断裂来判断细胞是否发生凋亡。

常用的DNA断裂检测方法包括凝胶电泳、TUNEL法和DNA断裂酶切法。

这些方法可以对凋亡细胞进行定量分析，但需要特殊仪器和试剂，操作较为复杂。

3. 蛋白质检测法。

细胞凋亡过程中，一些特定的蛋白质会发生变化，如Bcl-2家族蛋白、caspase家族蛋白等。

因此，可以通过检测这些蛋白质的表达水平或活性来判断细胞是否发生凋亡。

常用的蛋白质检测方法包括Western blot、免疫荧光染色和流式细胞术。

这些方法对于定量分析和高通量检测具有优势，但需要特异性抗体和专门仪器。

4. 细胞色素C释放检测法。

在细胞凋亡过程中，线粒体膜通透性增加，导致线粒体内膜空间的细胞色素C释放到细胞质中。

因此，可以通过检测细胞色素C的释放来判断细胞是否发生凋亡。

常用的方法包括免疫荧光染色和细胞色素C活性检测。

这些方法对于研究凋亡的机制和药物筛选具有重要意义。

综上所述，不同的细胞凋亡检测方法各有优缺点，研究者可以根据具体的实验目的和条件选择合适的方法。

随着生物技术的发展，新的细胞凋亡检测方法也在不断涌现，相信在不久的将来，会有更多更简便、灵敏的方法问世，为细胞凋亡研究提供更多的选择和可能性。

应用流式细胞仪检测细胞凋亡的4种方法的比较作者：范宁娟项萍段敏来源：《安徽农业科学》2014年第32期摘要[目的]比较4种测定细胞凋亡方法的优缺点。

[方法]应用流式细胞仪，分别采用PI单染法、Annexin VFITC/ PI 复染法、罗丹明123染色法及Fluo3染色法测定细胞凋亡。

[结果]每种分析方法均有自己优势和不足，在检测过程中应进行多参数分析。

[结论]该研究可为后续研究提供试验方法支持。

关键词流式细胞仪;细胞凋亡;检测方法中图分类号 S1088;G306.0 ;文献标识码 A ;文章编号 0517-6611（2014）32-11240-03Comparison of Four Methods for Apoptosis Assay by Flow CytometryFAN Ningjuan1， XIANG Ping2*， DUAN Min1（1.College of Life Sciences， Northwest A&F University，Yangling， Shaanxi 712100; 2. College of Plant Protection， Northwest A&F University， Yangling， Shaanxi 712100）Abstract [Objective]The research aimed compare the advantages and disadvantages of four methods for apoptosis assay. [Method] Flow cytometry was used to examine cell apoptosis which labeled with PI， Annexin VFITC/PI， Rhodamine 123 and Fluo3 respectively. [Result] Each menthod had its merits and drawbacks， and multiparameter analysis should be considered in the inspection process. [Conclusion]It could provide experimental support for sequential studies.Key words ;Flow cytometry; Apoptosis; Detection method1972年，Kerr等[1]首次提出细胞凋亡（Apoptosis， APO）的概念，宣告对细胞凋亡探索的真正开始。

综述ＣＨＩＮＡＦＯＲＥＩＧＮＭＥＤＩＣＡＬ勰啊四种细胞凋亡检测方法的比较何雯张蓓刘无逸（上海体育学院上海２００４３８）【摘要】近年来细胞凋亡一直是生命科学和医学领域各专业的研究热点。

本文综述了电镜检测法、Ｉ）ＮＡ琼脂糖凝胶电泳检测法、流式细胞术和ＴＵＮＥＬ／－去－四种细胞凋亡的检测方法，并对各种方法的优点及局限性做一简要比较。

在选择细胞凋亡检测方法时，要充分了解各种方法的原理和应用范围，进行综合考虑。

多种检测方法的联合应用常可获得更准确的结果。

ｌ关键词】凋亡检测方法Ｉ中图分类号】Ｒ３６１Ｉ文献标识码】ＡＩ文章编号】１６７４—０７４２（２００７）１２（ｂ）一０００１—０２细胞凋亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）是由基因控制的、高度有序的细胞主动死亡过程，即程序性细胞死亡（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ，ＰＣＤ）。

细胞在一定的生理或病理状态下，遵循自身的程序，自己结束自己生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，而被其他细胞吞噬，不导致炎症反应。

细胞凋亡不受到外损伤因素直接导致的被动改变而属机体自身的生理活动，是一种基因指导的生物过程，是对外部或内部的死亡信号作出的反应，贯穿从受精、发育、成熟、衰老的整个生命过程。

近年来一直是生命科学和医学领域各专业的研究热点。

随着对凋亡研究的不断深入，各种各样检测凋亡的新技术和新方法相继建立，因此在我们的研究中选择哪种凋亡检测方法非常关键。

本文就细胞凋亡的概况及四种细胞凋亡的检测方法做一下比较，以期为将来的研究打下理论基础。

１细胞凋亡的概况Ｋｅｒｒ等（１９７２年）【１１根据形态学的变化，首先提出和描述］‘一种不同于细胞坏死的死亡方式即细胞凋亡。

细胞凋亡的发生是一个很复杂的过程，基本过程大体可以分为：起始阶段、效应阶段和清除阶段。

它的发生是渐进性分阶段的过程，我们可以对其事件的发生大致排一个先后顺序：首先是凋亡受体的激活或凋亡诱导因子的活化，然后通过不同途径进行传导，按下来是线粒体的变化及其ｃａｓｐａｓｅｓ的活化，这是凋亡的前期事件；接着随着活化核酸内切酶激活，细胞出现凋亡特有的表现：磷脂酰丝氨酸外翻、细胞皱缩、染色质凝集等，直至形成凋亡小体。

流式检测凋亡的讨论2010-07-15 14:28 来源：丁香园点击次数：15397 关键词：流式检测凋亡关于凋亡的流式检测wanhood一、PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。

这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1.细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。

研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。

许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

2.光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。

在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。

在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。

此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。

细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。

但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。

因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。

根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。

也可用于活细胞的分类。

试剂与仪器PBS溶液（配制方法见附录）；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。

用棕色瓶4℃避光保存。

70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1.收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。

三种流式方法检测细胞凋亡1、检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，采用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

常用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有拒染性，荧光着色很浅，凋亡细胞主要摄取hoechs-PI染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈红色荧光。

2、DNA片段原位标记凋亡细胞DNA片段原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，UDTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidy1 transferase，TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3'的羟基（-OH）端相结合经显色反应后检测DNA裂解点的技术。

DNA片段原位标记法有两种（1）原位缺口转移（in situ nick-translation，ISNT）技术，该技术是1994年由Fehsel等提出，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸接到断裂的3'-OH端（2）原位缺口末端原位标记技术（in situ end labelling technique，ISEL），该技术即TUNEL法，于1993年由Wijsman等提出，它是利用TdT将标记DUTP接到3'-OH端。

研究证明，TUNEL的敏感性远高于尤其对早期凋亡的检出TUNEL更为适用。

其原因可能是凋亡发生时DNA大多是双链同时断裂而单链断裂少见。

ISNT是依赖DNA多聚酶I的单链修复反应，故阳性率较低。

细胞凋亡时DNA断裂早于形态学改变及DNA含量减少。

因此该法较前述各法具有更高的灵敏性，但环死细胞亦有DNA裂点形成。

因此环死亦可呈TUNEL阳性反应。

流式细胞仪细胞凋亡检测技术一、固定细胞的染色方法1）PI单染色法方法一1．收集细胞（1～5）×106个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。

2．3ml PBS洗一次。

3．离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。

4．离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。

5．400目的筛网过滤1次，500～1000r/min离心5min，弃去PBS。

6．用1ml PI染液，4℃避光30min。

7．流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。

方法二1．收集细胞（1×106个），500～1000r/min离心5min，弃去培养液。

2．1ml PBS/FCS洗一次。

3．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，加入500μl PBS/FCS和500μl的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在4℃下固定4min。

4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％Tween 的PBS 1ml，37℃孵育15min。

5．1ml PBS/FCS洗3次，每次5min。

6．400目的筛网过滤1次。

7．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4℃避光至少30min。

染色在24h之内皆可行，流式细胞仪分析。

2）调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析1．离心收集细胞，PBS洗1～2次。

2．1％多聚甲醛低温下固定15min。

3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱内放置1～3天。

4．PBS轻洗1次5．细胞与TdT标记液37℃孵育，时间1～2h。

6．PBS轻洗1次。

7．细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。

8．含0.1％Triton-X 100的PBS轻洗1次。

4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％Tween 的PBS 1ml，37℃孵育15min。

流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin V/PI双染色法
实验步骤
1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106，/mL 500~1000r/min离心5min，弃去培养液。

2. 用孵育缓冲液洗涤1次，500~1000r/min离心5min。

3. 用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。

4. 500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。

5. 加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。

6. 流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm 的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。

7. 结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。

细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。

因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。

正常活细胞与此相似。

在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。

常用细胞凋亡检测方式及区别
细胞凋亡流式检测法：经荧光染料标记过的细胞样品要求制成单细胞悬液，以一定的流速经过喷嘴，流速的选择与检测的目的有关，当液体刚好进入光源发出的激光形成的聚焦区，此时，标记的荧光染料在激发光的激发下发射出特异颜色的荧光信号和散射光信号。

信号经过光电倍增管和光电探测器接收后转化成电脉冲，送入计算机处理，应用分析软件可分析样品的各种参数，以直方图或三维图的形式显示出来。

细胞凋亡流式检测特点：此方法是判断细胞有无凋亡发生的简便方法，且费用低廉。

凋亡的定量分析主要依靠流式细胞术，是检测细胞凋亡的有力工具，具有分析准确、重复性好、费用低廉、分析速度缺点是特异性较差、不易定性、灵敏性较差
区别：TUNEL检测法也是细胞凋亡的常用检测方法，是极为敏感、特异的方法，可量化凋亡细胞，动态观察凋亡细胞超微结构的变化以及与细胞表型同时分析。

取材制成石蜡切片、冰冻切片或者细胞悬液等，继而根据试剂盒说明操作。

其局限性为只能标记中期及晚期凋亡细胞，不能检测只发生DNA大片段断裂的凋亡细胞，也不能检测断裂末端的准确数量。

流式细胞技术分析细胞凋亡方法
流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特征及荧光参数时行的。

细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射，分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息。

散射光包括前向散射光和左向角散射光两种，前向散射光的强度与细胞大小、体积相产，右向角射光的强度与细胞结构的析射性、颗粒性（granu-larity）有关。

细胞凋亡过程中出现的形态改变如细胞皱缩、胞膜起泡、核浓缩和碎裂等可以使光散射特性发生改变。

早期凋亡细胞主要表现为前向散射光减弱而右向角散射光增强或不变，前者反映了细胞的皱缩，后者反映了细胞的核逐缩及碎裂。

晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射光均减弱。

由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标，细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱。

因此，只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡细胞。

细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解，导致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡细胞。

根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率。

此外，流式细胞术还可以通过测定线粒体膜的电位、溶酶体质子泵的活性及细胞DNA/总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞。

检测方法：获取密度1×106细胞/ml左右的细胞悬液，精洗，固定，荧光染料染色，上流式细胞仪分析。

流式检测细胞凋亡
实验目的
用不同方法处理培养目的细胞，收集细胞，流式检测细胞凋亡
实验材料
1.目的细胞
2.凋亡检测试剂盒
3.流式仪器
实验步骤
1. 细胞培养：
5% CO2，37℃二氧化碳培养箱中培养。

2. 细胞铺板
•将目的细胞接种在6孔板中，37℃5%CO2培养箱培养24小时•不同的方法处理细胞
3. 细胞染色及流式检测
•用ep管分别收集各孔中的培养上清，1000rpm离心5分钟，收集培养上清中的细胞。

•同时，用胰酶消化底面贴壁的细胞，1000rpm离心5分钟，收集细胞，与步骤1）的细胞混合
•PBS洗涤细胞2次，1000rpm离心5分钟，收集细胞
•每个样品用300ul 1*binding buffer重悬细胞，轻轻吹匀
•加入APC/PI，轻轻混匀
•20℃左右孵育30分钟，注意避光
•上机流式检测
实验结果
1. 流式数据分析
对照组实验组
流式数据分析图
2.数据统计图
实验结论
由以上结果可知，处理组的目的细胞的凋亡率明显高于对照组。