十二叶绿素的定量测定分光光度法

叶绿素含量的测定分光光度法叶绿素是植物和一些原生生物中重要的光合色素之一，它在光合作用中起到接收和转换光能的关键作用。

测定叶绿素含量可以帮助我们了解植物的光合效率和健康状况，以及研究光合作用的机制和调控。

分光光度法是一种常用的测定叶绿素含量的方法，本文将介绍该方法的原理、实验步骤和数据分析。

一、原理分光光度法测定叶绿素含量的原理是基于叶绿素对光的吸收特性。

叶绿素分子可以吸收特定波长的光，特别是蓝光和红光，而对绿光的吸收较弱。

利用分光光度计测量叶绿素溶液在不同波长的光下的吸光度，可以通过比较吸光度与叶绿素浓度的标准曲线，计算出待测样品中叶绿素的含量。

二、实验步骤1. 制备叶绿素提取液：将适量的鲜叶片（去除茎和大的叶脉）放入离心管中，加入少量酒精，并用研钵捣碎，使叶绿素释放到酒精中。

然后用酒精将研钵中的残渣洗入离心管中，最后用酒精将叶绿素完全溶解。

注意，酒精的使用要避免火源。

2. 离心沉淀：将叶绿素提取液离心10分钟，以沉淀残渣和悬浮物。

3. 分光光度计测量：取离心后的叶绿素提取液，用分光光度计在特定波长下（如645 nm和663 nm）测量其吸光度。

记录吸光度值。

4. 制备标准曲线：取不同浓度的叶绿素标准溶液，用同样的方法测量其吸光度，记录吸光度值。

5. 计算叶绿素含量：根据标准曲线，将待测样品的吸光度值代入，通过计算叶绿素浓度的公式，得出叶绿素的含量。

三、数据分析1. 标准曲线的绘制：将各个标准溶液的叶绿素浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标，绘制曲线。

利用标准曲线可以通过待测样品的吸光度值，反推出其叶绿素的浓度。

2. 计算待测样品中叶绿素的含量：根据标准曲线，将待测样品的吸光度值代入，通过计算叶绿素浓度的公式，得出叶绿素的含量。

四、注意事项1. 实验中应尽量避免阳光直射，以免光线对实验结果的干扰。

2. 操作时应注意安全，避免酒精接触到火源。

3. 叶绿素提取液的制备应充分溶解，避免残渣和悬浮物的影响。

实验三十三叶绿素含量的测定(分光光度法)根据朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，某有色溶液的吸光度A值与其中溶质浓度C以及光径L成正比，即A＝aCL（a为该物质的吸光系数）。

各种有色物质溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下的吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。

今欲测定叶绿体色素提取液中叶绿素a、b含量，只需测定该提取液在2个特定波长下的吸光度度值，并根据叶绿素a与b在该波长下的吸光系数即可求出各自的浓度。

在测定叶绿素a、b含量时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素a、b的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长645nm 下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：A663=82.04Ca+9.27Cb (1)A645=16.75Ca+45.6Cb (2)式中A663、A664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的吸光度值；Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L)。

解联立方程(1)、(2)可得以下方程：Ca=0.0127A663-0.00269A645 (3)Cb=0.0229A645-0.00468A663 (4)如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3)、(4)式则可改写为：Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645 (5)Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663 (6)叶绿素总量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663 (7)叶绿素总量也可根据下式求导A652=34.5×CT由于652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），因此也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）求出叶绿素总量：CT(g/L)=A652/34.5CT(mg/L)=A652×1000/34.5 (8)因此，可利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素a与b含量，利用(7)式或(8)式可计算叶绿素总量。

叶绿素含量的测定叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，叶绿素含量的测定无论是在生理上，还是在选育品种以及抗性研究等方面都很有必要。

叶绿素含量的经典测定方法是光电比色法，即用光电比色计以无机有色溶液为标准进行比色测定。

该方法不仅要配制无机标准溶液，而且不能对溶液中不同色素分子进行定量测定；分光光度法则不需配制标准溶液，又可对溶液中不同色素分子进行定量测定，已得到广泛应用。

一、原理分光光度法测定叶绿素含量，就是利用叶绿素 a和叶绿素b吸收光谱的不同，测定各特定峰值波长下的光密度，再根据色素分子在该波长下的消光系数，计算出浓度。

叶绿素 a、叶绿素b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于 663nm、 645nm处，同时已知叶绿素a和叶绿素b在663nm处的消光系数分别为82.04和9.27；在645nm处的消光系数分别为16.75和45.60。

这样叶绿素a和叶绿素b的浓度与他们在663nm、645nm处的光吸光密度的关系可用下式表示：D663=82.04C a+9.27C bD645=16.75C a+45.60C b式中D663和D645分别为叶绿素溶液在波长663nm、645nm处的光密度；C a、C b分别为叶绿素a和叶绿素b的浓度，单位g.·L-1。

解方程可得到：计算：C a=12.7D663-2.59D645C b=22.9D645-4.67D663C a+b=20.3D645+8.04D663C a ,C b分别为叶a和叶b的浓度，C a+b为叶a和叶b的总浓度，单位为mg·L-1所测材料单位重量或单位面积的叶绿素含量可按下式进一步计算：叶绿素含量（mg·L-1或mg·dm-2）= C*VA*1000式中C：叶绿素浓度（mg·L-1）；V：提取液总体积（ml）；A：叶片鲜重（g）或面积（dm2）二、丙酮乙醇混合液法提取叶绿素：药品：丙酮：乙醇按1：1体积混合成浸提液仪器：分光光度计-1-1-1方法：丙酮乙醇混合液法1．将丙酮、无水乙醇按1：1比例配成混合浸提液。

国标水质叶绿素的检测方法
国标水质叶绿素检测方法是用于评估水体中叶绿素含量的一种标准化方法。

叶绿素是水中藻类和其他植物生物的主要光合色素，水体中的叶绿素含量可以反映藻类生物量和水体中的营养状况。

以下是关于国标水质叶绿素检测方法的10条详细描述：
1. 分光光度法：该方法根据叶绿素对不同波长光的吸收特性，通过分光光度计测量水样在不同波长下的吸光度，并根据叶绿素的吸光特征计算出叶绿素浓度。

2. 涡旋方法：这是一种用于提取叶绿素的常用方法，通过将水样与有机溶剂混合并加入氮气产生涡旋，从而有效地提取叶绿素。

3. 高效液相色谱法：采用高效液相色谱仪分析水样中的叶绿素，该方法具有快速、灵敏度高和准确性高的特点。

4. 荧光法：利用荧光光谱特性测量叶绿素的含量，通过激发叶绿素产生荧光信号，并测量其强度来计算叶绿素含量。

5. 电化学法：利用电化学分析技术测量叶绿素的含量，将水样中的叶绿素氧化成草酸根离子，并利用电极电位变化来测量叶绿素的浓度。

6. 微波辐射法：该方法利用微波辐射加热样品，使样品中的叶绿素溶解在溶剂中，然后通过分光光度法或其他方法进行测量。

7. 质谱法：利用质谱仪对水样中的叶绿素进行分析，该方法可以提供叶绿素的分子结构和相对分子质量等信息。

8. 固相萃取法：采用固相萃取柱将水样中的叶绿素吸附在固定相上，然后用溶剂洗脱并进行分析。

9. 高温灼烧法：采用高温灼烧样品，将叶绿素燃烧成无机物后进行测量。

10. 核磁共振法：利用核磁共振仪测量叶绿素的核磁共振信号，通过信号强度来推断叶绿素的含量。

叶绿素测定方法一、方法选择1、分光光度计法>荧光光度法>SPAD速测法，浸提比色法>萃取比色法，常温浸提比色测定>高温速浸提比色法，如果时间条件允许，建议选择常温浸提比色法。

2、药品的选择，常用有机浸提叶绿素的试剂由甲醇、乙醇、丙酮，乙醇对身体的伤害最小，丙酮最厉害，如果通风条件不是太好，建议选择乙醇;有机试剂混合液提取具有协同优势，乙醇与丙酮的混合液比甲醇与丙酮的混合液(甲醇乙醇混合很少)浸提的要完全，而且稳定，乙醇、丙酮、水的浸提效果次之，差异不显著;综上，如果能买到丙酮的话，乙醇、丙酮以1:3的比例混合液提取最好，其次是乙醇、丙酮、水以4.5:4.5:1的比例混合液，如果不想用丙酮，可以用95%的乙醇代替，但是与混合液比，提取效率不高。

3、称样量，0.2g样品，选用20ml浸提液浸提，0.5g样品，选用50ml浸提液浸提。

二、实验原理分光光度法测定叶绿素(包括a\b\类胡萝卜素\总量) 含量的原理是，以有机溶剂在常温暗室直接提取样品中的叶绿素，测定其吸光度，根据叶绿素(包括a\b\类胡萝卜素\总量)在特定波长的吸收，用公式计算其含量。

三、器材棕色容量瓶、721型分光光度计(751型分光光度计更好，越精确越好) 四、步骤1、将叶片洗净，选取中间部分，称0.200克左右，并剪成2mm左右碎条2、将样品放入容量瓶中，加入浸提液，定容，放在暗处26h左右3、比色，如果仅仅测定叶绿素A\B总量，测定波长在665nm、649nm、652nm 处吸光度即可，如果还测定类胡萝卜素含量，再测定处波长在470nm处的吸光度即可。

目前，不同的浸提液提取方法都是在这些波长下测定的。

4、每个实验样品重复三次，空白两次重复即可(本实验中空白意义不大)五、计算Ca=13.95*A665-6.88*A649Cb= 24.96* A649-7.32* A665C类胡萝卜素= (1000*A470-2.05* Ca -114.8* Cb)/245C总= A652*50/(34.5*m)Ca 为叶绿素a的浓度M 为称样量。

叶绿素的定量测定实验报告摘要本实验旨在通过分光光度法测定叶绿素的浓度。

首先，通过酒精提取叶绿素，并用乙醇作为溶剂。

接下来，利用紫外-可见分光光度计测定不同浓度的叶绿素溶液的吸光度，并绘制标准曲线。

最后，使用标准曲线计算未知浓度的叶绿素溶液的浓度。

实验结果表明，利用分光光度法可准确、快速地测定叶绿素的浓度。

材料与方法材料•鲜叶片样本•乙醇•磨砂仪器•紫外-可见分光光度计•常规实验室玻璃仪器（量筒、移液管等）方法步骤 1: 样本制备1.取适量鲜叶片样本，并将其切碎成细小的颗粒。

2.使用磨砂仪器将叶片样本研磨成均匀的绿色汁液。

步骤 2: 叶绿素提取1.取一小瓶子，加入适量的乙醇。

2.将研磨后的叶绿素样本加入乙醇中，充分混合。

3.将混合液静置一段时间，使叶绿素充分溶解于乙醇中。

步骤 3: 吸光度测定1.使用紫外-可见分光光度计设置波长为特定的吸收峰波长（一般为665 nm）。

2.设置一组空白对照组，即只包含乙醇的样本。

3.取不同浓度的叶绿素溶液，分别进行吸光度测定。

记录每个浓度对应的吸光度值。

步骤 4: 绘制标准曲线1.将吸光度测定结果绘制成标准曲线。

横轴为叶绿素浓度，纵轴为吸光度值。

2.通过回归分析，得到标准曲线的方程。

步骤 5: 叶绿素浓度测定1.取一个未知浓度的叶绿素溶液样本，并进行吸光度测定。

2.利用标准曲线的方程，计算未知浓度叶绿素溶液的浓度。

结果与讨论通过实验得到的标准曲线如下图所示：<标准曲线的图表>根据标准曲线的方程，可以计算出未知浓度叶绿素溶液的浓度为X mg/L。

本实验的结果表明，通过分光光度法可以准确地测定叶绿素的浓度。

然而，在实际操作中，仍存在一些潜在的误差来源，例如叶绿素的提取效率、光度计的精度等。

在今后的研究中，可以进一步优化实验步骤，以提高测定结果的准确性。

结论本实验利用分光光度法成功地测定了叶绿素的浓度。

通过制备叶绿素样本、提取叶绿素、吸光度测定和标准曲线绘制等步骤，得到了一条准确的标准曲线。

试验十二叶绿素的定量测定分光光度法实验二十叶绿素含量的测定叶绿素的含量与植物光合作用及氮素营养有密切的关系，在科学施肥、育种及植物病理研究上常有测定的需要。

方法Ⅰ一、目的掌握叶绿素含量测定的基本原理和方法。

二、原理叶绿素与其他显色物质一样，在溶液中如液层厚度不变则其吸光度与它的浓度成一定的比例关系。

已知叶绿素a 、b在652 nm波长处有相同的比吸收系数（均为34.5）。

因此，在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，即可计算出叶绿素a 、b的总量。

三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：菠菜叶；芥菜叶或其他植物叶片。

2. 仪器设备：电子分析天平；分光光度计；漏斗；25ml容量瓶；剪刀；滤纸；玻棒等。

3. 试剂：95﹪乙醇、石英砂、碳酸钙粉。

四、实验步骤1. 叶绿素的提取称取植物鲜叶0.20g（可视叶片叶绿素含量增减用量），剪碎放入研钵中，加少量碳酸钙粉和石英砂及3～5ml95﹪乙醇研成匀浆，再加约10ml 95﹪乙醇稀释研磨后，用滤纸过滤入25ml 容量瓶中，然后用95﹪乙醇滴洗研磨及滤纸至无绿色为止，最后定容至刻度，摇匀，即得叶绿素提取液。

2. 测定取光径为1cm的比色杯，倒入叶绿素提取液距杯口1cm处，以95﹪乙醇为空白对照，在652 nm波长下读取吸光度（A）值。

五、计算将测得的吸光度A652值代入公式(1), 即可求得提取液中叶绿素浓度。

所得结果再代入公式(2)，即可得出样品中叶绿素含量（mg ·g－1Fw）。

A652C ( mg .ml－1 ) = ———— (1)34.5公式中：C —叶绿素（a 和b ）的总浓度( mg ·ml－1 )A652—表示在652nm 波长下测得叶绿素提取液的吸光度34.5为叶绿素a和b混合溶液在652nm波长的比吸收系数（比色杯光径为1cm, 样品浓度为1g·L－1时的吸光度）。

C（mg.ml－1）×提取液总量（ml）叶绿素含量（mg .g－1Fw）= ———————————————— (2)样品鲜重（g）方法Ⅱ一、目的掌握叶绿素a、b含量测定的基本原理和方法。

叶绿素含量的测定标准可以根据不同的方法来确定。

其中，分光光度法是一种常用的测定叶绿素含量的方法。

该方法基于叶绿素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在特定波长下测定其吸光度，然后根据朗伯-比尔定律计算出提取液中各色素的含量。

以下是使用分光光度法测定叶绿素含量的标准步骤：原理：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：A=acl。

当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，a 为该物质的吸光系数。

各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等丁各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。

今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。

在测定叶绿素a、b时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素a、h的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的吸光系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：Ca=13.95A665-6.88A649 Cb=24.96A649-7.32A665 Cx=(1000A470-2.05Ca-1 14.8*Cb)/245 最终，叶绿素含量计算公式为：叶绿素含量（mg/g）= （色素浓度mg/L * 提取液体积ml * 稀释倍数）/(1000 * 样品鲜重g)。

通常操作选取的叶片大概为0.1g，剪碎放入装有5ml 95%以纯的10ml离心管中，暗处理24h，即可测量其吸光度。

叶绿素含量的测定分光光度法叶绿素是一种广泛存在于植物和一些浮游生物中的绿色色素，它在光合作用过程中起着至关重要的作用。

测定叶绿素含量是研究植物光合作用和生长发育的重要手段之一。

其中，分光光度法是一种常用的测定叶绿素含量的方法。

分光光度法是通过测量溶液对特定波长光的吸收程度来确定其中物质浓度的一种方法。

在测定叶绿素含量时，我们会选择特定波长的光，并测量通过溶液后的光线强度。

根据光线的吸收程度，可以计算出样品中叶绿素的浓度。

在进行叶绿素含量的分光光度法测定时，我们首先需要提取叶绿素。

通常采用乙醇、丙酮等溶剂来破坏叶绿素在叶片中的结构，并将其溶解出来。

然后，将提取液置于离心管中进行离心，以去除悬浮的杂质。

离心后，我们可以得到含有叶绿素的溶液。

接下来，我们需要使用分光光度计来测量叶绿素溶液的吸光度。

分光光度计通过选择特定波长的光源，将光线通过样品后，再通过光电二极管接收光信号，最后转化为电信号。

根据吸光度的定义，可以通过测量进射光和透射光的光强来计算吸光度，并由此得到叶绿素的浓度。

为了准确测定叶绿素含量，我们需要在测量前进行一些预处理。

首先，需要校准分光光度计，以确保测量的准确性。

其次，应该选择适当的波长进行测量。

常用的波长为663纳米和645纳米，这两个波长对叶绿素的吸光度较高。

最后，要注意样品的稀释，以确保其吸光度在仪器检测范围内。

在实际测定中，我们可以根据测量结果计算出叶绿素的浓度，并进行统计分析。

通过比较不同处理组的叶绿素含量，可以了解不同因素对植物生长和光合作用的影响。

此外，还可以将分光光度法与其他方法相结合，来对叶绿素含量进行验证和比对，以提高测定结果的可靠性。

分光光度法是一种常用的测定叶绿素含量的方法。

通过测量溶液对特定波长光的吸收程度，可以计算出叶绿素的浓度。

在实际应用中，我们需要注意校准仪器、选择适当的波长、稀释样品等步骤，以确保测定结果的准确性。

分光光度法的应用为我们研究植物生长和光合作用提供了重要的手段。