凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤

检验操作规程
标准曲线含量公式： ()%100×1A ×A ×C 水分样对样对-⨯=M n 矿物类含量计算公式： 5.004×（B-A ）×稀释倍数×C 样 含量%= ×100% m ×1000×（1-水分） 【含量测定】 本品每1g 含抗凝血酶活性水蛭应不低于16.0U ；蚂蟥、柳叶蚂蟥应不低于3.0U 。

仪器与试剂：分析天平、离心机、数显恒温水浴锅、氯化钠等。

方法：取本品粉末（过三号筛）约1g ，精密称定，精密加入0.9%氯化钠溶液5ml ，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100μl ，置试管（8mm ×38mm ）中，加入含0.5%（牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液[注1]（临用配制）200μl ，摇匀，置水浴中（37℃±0.5℃）温浸5分钟，滴加每1ml 中含40单位的凝血酶溶液[注2]（每1分钟滴加1次，每次5μl ，边滴加边轻轻摇匀）至凝固（水蛭）或滴加每1ml 中含10单位的凝血酶溶液[注2]（每4分钟滴加1次，每次2μl ，边滴加边轻轻摇匀）至凝固（蚂蟥、柳叶蚂蟥），记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算： U=（C 1V 1/C 2V 2） 式中 U -- 每1g 含凝血酶活性单位，U/g ； C 1 -- 凝血酶溶液的浓度，μ/ml ； C 2 -- 供试品溶液的浓度，g/ml ； V 1 -- 消耗凝血酶溶液的体积，μl ； V 2 -- 供试品溶液的加入量，μl 。

中和一个单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位。

产品中天然水蛭素的测定方法（《中国药典》2010年版1部规定的测定方法）方法提要（凝血酶滴定法）水蛭素能与凝血酶直接结合，使凝血酶失活，其结合比例为1:1，抗凝血酶单位以ATU 表示，即每消耗一个凝血酶单位(U)相当于一个抗凝血酶单位(ATU) 。

仪器设备0.75cm×10cm小试管；微量移液器（1～500μl、1～5ml）；45 度角试管架；秒表；恒温水浴箱；分析天平，感量0.0001克；pH测试仪；普通玻璃仪器。

试剂（人）纤维蛋白原；凝血酶； 0.2 mol/L的 Tris-Hcl缓冲液（pH7.4）；0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液；0.1mol/L盐酸溶液；氯化钠；0.9％生理盐水。

溶液的配制1、Tris-HCl缓冲液（pH7.4）的配制将0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液约25 ml、0.1mol/L盐酸溶液约40ml和氯化钠0.8766g混合、溶解，调节pH值至7.4，然后加蒸馏水定容100ml(含0.15 mol 氯化钠)即成Tris-HCl缓冲溶液，备用。

2、0.5％（人）纤维蛋白原的配制用上述已配制好的Tris-HCl缓冲溶液溶解（人）纤维蛋白原，配成0.5%纤维蛋白原溶液（以凝固物计，现用现配），备用。

3、凝血酶溶液的配制用0.9％生理盐水配制成凝血酶浓度为40 U/ml的溶液（现用现配），备用。

分析步骤取1g样品粉末（过三号筛），精密称定，精密加入0.9％氯化钠溶液5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清夜100μl置试管中，加入0.5％（人）纤维蛋白原溶液200μl、摇匀，用移液器在试管内的溶液中吹一小气泡作为观察标记（注意避免产生其它气泡），接着加入已配制好的凝血酶溶液，轻轻摇匀（3～5s，下同）、计时，然后将试管插入位于37℃恒温水浴箱的45 度角试管架中，轻轻旋转并观察气泡随液面转动情况，如气泡随液面转动即为反应终点，否则按每分钟滴加5μl凝血酶溶液至凝固（如滴加凝血酶溶液次数超过5次不凝固者应稀释样品，直至在3～5次为止）。

海南水蛭中水蛭素的抗凝活性研究刘腾;符乃光;李泽友【摘要】Objective To analyze the species of Hainan leeches and the anticoagulant activity of hirudin. Methods The morphological characteristics and thin-layer chromatogram of Hainan leech were observed. Then anti-coagulant activity was measured with the method of thrombin titration. Results Hainan leeches were Hirudinaria ma-nillensis. The anticoagulant activity of Hainan Leech hirudin was 1 174.8 U/g of whole body, 6 521.7 U/g of the head and 308.6 U/g of the body. Conclusion Hainan leeches have very good anticoagulant activity, which deserve further research and development.%目的：分析海南水蛭的品种及其中水蛭素的抗凝作用。

方法观察海南水蛭的形态特征、薄层色谱图，并采用凝血酶滴定法测定其抗凝活性。

结果海南水蛭为菲牛蛭，水蛭素的抗凝活性分别为：全身1174.8 U/g、头部6521.7 U/g、身体308.6 U/g。

结论海南水蛭具有很好的抗凝血活性，值得进一步研究开发。

【期刊名称】《海南医学》【年(卷),期】2015(000)016【总页数】3页(P2345-2346,2347)【关键词】海南水蛭;水蛭素;薄层色谱;凝血酶【作者】刘腾;符乃光;李泽友【作者单位】海南医学院药学院，海南海口 571199;海南医学院药学院，海南海口 571199;海南医学院药学院，海南海口 571199【正文语种】中文【中图分类】R282.74中药水蛭具有抗凝血、抗肿瘤、提高免疫力、降血脂等多种药理活性，临床上用于治疗多种疾病[1]。

凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤实验目的：凝血酶滴定法测定水蛭素活性含量实验仪器和试剂：电子天平 酸度计 离心机 移液器 45度试管架 三羟甲基氨基甲烷（Tris ） 盐酸（Hcl ） 生理盐水 蒸馏水 凝血酶 纤维蛋白原及常用玻璃仪器实验步骤：1、称取1.21g 三羟甲基氨基甲烷加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml ，浓度为0.2mol/L 。

2、用移液器取429ul 盐酸加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml ，浓度为0.1ml/L 。

3、从1去25ml ，从2取40ml 混合调PH 到7.4（用1或2调），加蒸馏水定溶到100ml 。

4、称取样品1g 放入试管加生理盐水5ml 充分溶解30分钟。

5、把4放入离心机离心10分钟，4000转/分。

6、取3（Tris 缓冲液）1.6ml ，稀释纤维蛋白原0.008g ，浓度0.5%。

7、用生理盐水配制40u/ml 的凝血酶溶液。

8、从5取上清液100ul 。

9、从6取200ul 加入8充分摇匀后，吹一小气泡。

10、从7每分钟取5ul 加入9迅速摇匀后，匀速转动试管，观察反应，溶液上的小气泡随液面转动时视为反应的终点（记录好滴加凝血酶的次数）。

11、计算公式为：2211V C V C U其中C1=凝血酶的浓度C2=样品的浓度V1=滴加凝血酶的体积V2=取样的体积注：1、滴加次数超过5次还不凝固的，应按一定倍数稀释样品。

2、为了提高滴定的准确度可梯度配用不同浓度的凝血酶溶液。

3、为了提高滴定的准确度同时也可在临近凝固的下一次滴加凝血酶5u/次，改为4u/次，3u/次，2u/次，1u/次。

4、如果样品是溶液，直接取样100ul检测，检测步骤和计算方法不变。

5、如果样品是可溶性粉状物，加溶液溶解后，取溶液100ul检测，检测步骤和计算方法不变。

凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤实验目的：凝血酶滴定法测定水蛭素活性含量实验仪器和试剂:电子天平 酸度计 离心机 移液器 ４5度试管架 三羟甲基氨基甲烷（Tris ） 盐酸（Hcl) 生理盐水 蒸馏水 凝血酶 纤维蛋白原及常用玻璃仪器实验步骤：１、称取1.2１g 三羟甲基氨基甲烷加蒸馏水充分溶解,定溶到50ml,浓度为０.２mol/L 。

2、用移液器取４29ul 盐酸加蒸馏水充分溶解,定溶到５０ml ，浓度为0.1ml/Ｌ。

３、从1去25ｍl,从2取４0ｍl 混合调ＰＨ到７.4（用1或2调)，加蒸馏水定溶到10０ml 。

4、称取样品1g 放入试管加生理盐水5ｍl 充分溶解30分钟。

5、把4放入离心机离心10分钟,4000转/分。

6、取3(Ｔri ｓ缓冲液)１.6ｍl,稀释纤维蛋白原0.00８g,浓度0．5%。

7、用生理盐水配制40u/ml 的凝血酶溶液。

８、从5取上清液10０ul 。

９、从6取200ｕl 加入８充分摇匀后，吹一小气泡。

10、从７每分钟取5ul 加入9迅速摇匀后，匀速转动试管,观察反应,溶液上的小气泡随液面转动时视为反应的终点（记录好滴加凝血酶的次数)。

11、计算公式为:2211V C V C U其中C1=凝血酶的浓度Ｃ２=样品的浓度V１＝滴加凝血酶的体积V2=取样的体积注：1、滴加次数超过５次还不凝固的,应按一定倍数稀释样品。

2、为了提高滴定的准确度可梯度配用不同浓度的凝血酶溶液。

3、为了提高滴定的准确度同时也可在临近凝固的下一次滴加凝血酶5ｕ/次，改为４ｕ/次,3ｕ/次，2ｕ/次，１u/次。

4、如果样品是溶液，直接取样10０uｌ检测,检测步骤和计算方法不变。

5、如果样品是可溶性粉状物，加溶液溶解后,取溶液1０0uｌ检测,检测步骤和计算方法不变。

XXXXXXXXXX 有限公司原料质量标准及检验操作规程1品名：1.1中文名：水蛭1.2汉语拼音：Shuizhi2代码：3取样文件编号：4检验方法文件编号：5依据：《中国药典》（2020年版一部）6质量标准：7.1试药与试剂：乙醇、水蛭对照药材、环已烷、乙酸乙酯、盐酸、10% 硫酸乙醇溶液、0.9%氯化钠溶液、1ml中含40单位的凝血酶溶液、0.5%（牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液。

7.2仪器与用具：电子天平、超声波处理器、硅胶G薄层板、紫外光灯、烘箱、马福炉、离心机、水浴锅。

7.3性状：取本品适量，自然光下目测色泽，嗅闻气味。

7.4鉴别：取本品粉末1g,加乙醇5ml，超声处理15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。

另取水蛭对照药材1g，同法制成对照药材溶液。

照薄层色谱法（附录7）试验，吸取上述两种溶液各5卩」分别点于同一硅胶G薄层板上，以正已烷-乙酸乙酯（4: 1 ）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105C加热至斑点显色清晰。

供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；紫外光灯（365nm）下显相同的橙红色荧光斑点。

7.5检查：7.5.1水分：不得过18.0% （附录15第二法）。

7.5.2总灰分：不得过10.0% （附录17）。

7.5.3酸不溶性灰分：不得过2.0% （附录17）。

7.5.4酸碱度：取本品粉末（过三号筛）约1g,加入0.9%氯化钠溶液10ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液照pH值测定法（附录11）测定，应为4.5~6.5。

7.5.5重金属及有害元素照铅、镉、砷、汞、铜测定法（附录35原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体质谱法）测定，铅不得过十万分之一；镉不得过百万分之一；砷不得过百万分之五；汞不得过百万分之一；7.5.6黄曲霉毒素照黄曲霉毒素测定法（附录50）测定。

取本品粉末约5g,紧密称定，加氯化钠3 g,照黄曲霉毒素测定法项下的供试品的制备方法，测定，计算，即得。

表1因素水平因素水平123浸泡时间／h61224乙醇量／倍6812醇浓度／%607590渗漉速度／（min ／mL ）351前列宁胶囊由水蛭、黄芪等多味中药组成，具有清热解毒、活血化瘀、益气补肾的功效，用于治疗慢性前列腺增生及前列腺炎，疗效显著［1］。

现代研究表明，水蛭主要成分为多肽类物质，含有抗凝血酶活性的有效成分，具有很强的抗凝和抗血栓活性，是目前已知最强的凝血酶抑制剂［2］。

为优化前列宁胶囊中水蛭的提取工艺，我们采用正交试验法对复方中主药水蛭的提取工艺进行研究，以确定水蛭的最佳提取工艺。

1仪器与试药1.1仪器Sartoious BT 25S 型电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；DFY-500型摇摆式高速中药粉碎机（浙江温岭市大海药材器械厂）；PHS-3C 型精密pH 计（上海精密科学仪器有限公司）；DZF —6050型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2试药水蛭（产地江苏，安徽德昌药业饮片有限公司，批号：20080510），经药学院中药鉴定教研室卢伟副教授鉴定为水蛭科动物蚂蝗Whitmaniapigra Whitman ；牛血纤维蛋白原（中国药品生物制品检定所，凝固物含量61%，批号：626-200207）；凝血酶（中国药品生物制品检定所，规格：580IU ／支，批号：605-0123）；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（上海楷洋生物技术有限公司，含量≥99.5%）2方法与结果水蛭中主要抗凝血成分为水蛭素和其它抗凝血成分，多为水溶性多肽，在水煎煮过程中易被破坏，故采用渗漉法提取。

2.1正交试验设计根据药典条件和文献［3-5］，以浸泡时间、乙醇用量、乙醇浓度、渗漉速度为考察因素，用抗凝血酶活性含量为评价指标，采用正交试验优选水蛭渗漉最佳条件。

因素水平设计见表1。

2.2提取方法水蛭粉末过1号筛，称取30g ，共9份，按表1条件进行正交试验提取，合并渗漉液。

2.3抗凝血酶活性的含量测定根据2010年版《中国药典》收载的凝血酶滴定法［6］测定水蛭的抗凝血酶活性。