P0017S 快速银染试剂盒

DNA银染一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释)1、固定液：50ml乙醇2、前处理液（敏化液）：5ml HNO33、染色液：0.5g 硝酸银（避光配制）4、显色液：无水Na2CO3 12.5g 甲醛200ul 加水至500ml5、终止液：50ml 冰醋酸二、银染步骤（摇床设置52rpm左右）1、准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放入盒中在摇床上轻摇1min；2、凝胶固定：倒掉盒中的水，加入100ml左右的固定液，摇床上缓缓摇动10min；3、洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次30S；4、凝胶氧化：弃双蒸水，加入100ml左右前处理液氧化6min；5、洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗2次每次10S；6、凝胶染色：弃双蒸水，加入100ml左右的染色液避光摇20min；7、洗胶：弃染色液，用双蒸水洗1次10S；8、凝胶显色：加入100ml显色液摇到看到清晰的条带为止；9、终止：弃显色液，迅速加入终止液100ml左右，摇2-3min；10、洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次1min。

三、变性聚丙酰胺凝胶的配制（两块、使用1.0BioRad胶板）1.2%的凝胶可以跑微卫星，和基因组DNA1、尿素：7.2g2、30%聚丙酰胺，4.68ml3、10×TBE，1.5ml (Tris碱108g；硼酸55g；EDTA 40ml 0.5mol/L,Ph=8.0；加水至1L)4、30%AP，35ul5、TEMED,4ul四、下图：左为果蝇正常基因组DNA与损伤后基因组DNA；右为果蝇微卫星电泳12h Treatment24h TreatmentMCT 0 5 10 200 5 10 20Protein银染一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释)1、固定液：200ml甲醇，50ml冰醋酸2、前处理液（敏化液）：150ml 乙醇，34g醋酸钠，1g硫代硫酸钠（使用前加入）3、染色液：1.25g 硝酸银（避光配制）4、显色液：无水Na2CO3 12.5g 甲醛200ul 加水至500ml5终止液：2g甘氨酸二、银染步骤（摇床设置52rpm左右）1、凝胶固定：准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放入盒中，加入100ml左右的固定液，摇床上缓缓摇动30min；2、洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次1min；3、凝胶氧化：弃双蒸水，加入100ml左右前处理液氧化30min；4、洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗3次每次5min；5、凝胶染色：弃双蒸水，加入100ml左右的染色液避光摇20min；6、洗胶：弃染色液，用双蒸水洗2次每次5min；7、凝胶显色：加入100ml显色液摇到看到清晰的条带为止；8、终止：弃显色液，迅速加入终止液100ml左右，摇10min；9、洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次5min。

1）30%(w/v)Acrylamide 1L，(丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=29:1)：配制方法：称量丙烯酰胺290g、甲叉双丙烯酰胺10g溶于600ml去离子水中，充分搅拌溶解，定容至1L，用0.45um滤膜滤去杂质，于棕色瓶中4°C保存。

2）5×TBE（1L）：配制方法：称量54gTris碱，3.72gNa2EDTA2H2O，27.5g硼酸溶于800ml去离子水中，充分搅拌溶解，定容至1L，高压灭菌后室温保存。

3）10%(W/V)过硫酸铵（10 ml）：配制方法：称取1g过硫酸铵，溶于10ml去离子水中搅拌溶解，储存于4℃。

5）10%乙醇(200ml)：配制方法：20ml无水乙醇加水溶解，最后定容至200ml。

6）1%的HNO3溶液（200ml）：配制方法：2ml硝酸加入到198ml双蒸水中，边加边搅拌。

7）染色液：0.2%的AgNO3溶液(200ml)：配制方法:快称0.4克AgNO3倒入200ml双蒸水中，黑暗中搅拌溶解后，快速倒入一棕色瓶中。

8）显色液：2%的Na2CO3及0.4%的甲醛溶液(200ml)：配制方法：称取4g Na2CO3精确量取0.8ml甲醛溶于少量双蒸水中，定容至200ml。

9）终显液：4%冰乙酸(200ml)：配制方法：量取8ml冰醋酸溶于双蒸水中，定容至200ml。

注：1）---3）为制胶配方5）---9）为银染试剂配方实验步骤：PCR产物的检测（12% 的PAGE电泳检测）：洗净玻璃板、胶条及梳子，晾干，然后用夹子夹好制成灌胶板。

↓用枪吸取 2.36ml三蒸水加入10ml离心管中，再加1.2ml 5×TBE缓冲液，2.4ml 30% Acr，4ul TEMED，最后加42ul APS(过硫酸铵)，用移液抢吹打混合混匀，然后缓慢倒入灌胶板中，插上梳子，慢慢放平，让其凝固。

↓待凝胶凝固后，拔掉梳子及玻璃板底部胶条，放入电泳槽，加1×TBE电泳缓冲液并接通电源，60伏，预电泳30min。

基本的银染步骤：（90min）材料：超纯水（>18 megohm/cm全程）、塑料染色托盘、摇床、塑料搅拌棒、10mL 一次性管、干净的玻璃杯、量筒、30%乙醇、100%乙醇、固定液（40%乙醇、10%乙酸）注意事项：1.在拿胶前确定用去离子水清洗橡胶手套。

2.用干净的容器，并标明银染专用。

3.当摇动时，确保容器大小可使胶在里面自由移动，染色时溶液能完全沫过胶面。

4.在拿胶或换溶液时，避免徒手摸胶或用金属物品接触，及避免对胶施加压力。

5.用有铁氟龙图层的棒和干净的玻璃容器准备试剂。

6.避免试剂交叉污染。

7.用新鲜配置的溶液。

样品含有高浓度的DTT：如果你的样品含有高浓度的DTT （>50mM）,银染时可能导致条带拖尾和黄色背景。

为避免拖尾按照下面的方法还原和烷基化样品：1. 用新鲜配制的DTT还原你的样品到终浓度为17mM，并在70℃加热10min.2. 用新鲜配制的碘乙酰胺烷基化你的样品到终浓度为35mM，并在70℃加热10min.3. 加不含DTT的SDS样品buffer到还原和烷基化后的样品中。

进行电泳，并按手册进行银染。

在开始之前：用试剂盒中的试剂准备如下溶液用于银染：程序：下面的程序用于8*8厘米预制胶，1.0mm厚。

如果要染两块小胶或1.0mm厚的大胶（18*18），保证孵育时间，将所有溶液的体积加倍。

注意：如果你的胶的尺寸和上面提到的不一样，你可能必须通过调整孵育时间和溶液体积来选择银染策略。

所有的孵育应该在一个旋转摇床上进行，以1圈/秒的速度在室温下进行。

确保每个胶有100ml的溶液。

1. 电泳后，将胶取出至合适尺寸的银染托盘内，用超纯水简单的清洗一下。

2. 用100ml固定液在摇床上缓慢旋转，固定胶20min。

如果你用的是Tricine 胶，那么就固定1小时。

注意：如果没有足够的时间完成银染程序，胶可以在固定液中存放一夜。

长时间的固定在某些情况下可能会改善灵敏度和背景。

PAGE凝胶快速银染试剂盒使用说明货号:G7210规格:1L保存:室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月。

试剂盒内容：G7210染色液A200ml染色液B1ml染色液C100ml显色液D100ml试剂E2g注：1L规格指可配制的银染液的体积，实际使用次数根据PAGE胶大小不同而不同。

产品说明:蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，然后用还原剂如甲醛在碱性环境下使Ag+还原成银颗粒，可把蛋白电泳带染成黑褐色。

它主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。

其灵敏度比考马斯亮蓝高，PAGE凝胶快速银染试剂盒整个过程操作简单，灵敏度高，能检测到10ng以下的蛋白条带。

操作步骤:一、染色液配制(无水乙醇自备)需要配制的染色液体积根据PAGE胶的大小而定，一般的mini-PAGE胶需要20-30mL。

配制用的器皿清洗干净后用去离子水涮洗，染色液须用去离子水配制，现用现配。

如果配制的溶液体积不是100mL，可以按比例改变各成分用量。

1.固定液：取40ml无水乙醇，10ml染色液A加去离子水至100ml，混匀；2.敏化液：取30ml无水乙醇，10ml染色液C加去离子水至100ml，混匀；3.银染液：称取0.12g试剂E，用50ml去离子水溶解，加入10ul染色液B混匀，加去离子水至100ml现用现配。

4.显色液：10ml显色液D和30ul染色液B加入去离子水至100ml，混匀，现用现配。

5.终止液：取5ml染色液A加去离子水稀释至100ml，现用现配。

二、染色：1.PAGE电泳结束后，将PAGE蛋白胶转移至玻璃平皿或搪瓷盘中，用固定液固定30min。

2.将PAGE胶转移至敏化液中，使染液没过PAGE胶，室温作用30min。

可置于摇床上缓慢摇晃3.弃去敏化液，用去离子水漂洗三次，每次10min。

4.将PAGE胶转移至银染液中，使染液没过PAGE胶，室温摇晃40min。

5.将PAGE胶转移至显色液中，使显色液没过PAGE胶，室温摇晃，该显色一般在10min 左右。

快速银染银染步骤及相关药品配制银染步骤及相关药品配制一．银染基本步骤1．洗板和擦板电泳槽板先用无水乙醇擦一遍，5分钟后用配制的剥离硅烷（repel）溶液涂抹均匀。

放置15－30分钟玻板（用过的玻板先用NaOH溶液浸泡，直至废胶脱落）先用抹布蘸少许洗洁精在自来水下洗净，再用无水乙醇擦一遍，5分钟后用新鲜配制的亲和硅烷（binding）溶液涂抹均匀。

放置15－30分钟2．装板玻板在下，电泳槽板在上，中间放两根压条(涂抹repel和binding的面相互靠近)，对齐后，用三对夹子将波板与电泳槽板夹紧。

3．灌胶用针筒吸取6％的聚丙烯酰胺凝胶溶液，缓慢均匀的从灌胶口将胶灌入，灌好后取下靠近灌胶口的夹子，倒插入梳子，注意不要起汽泡，插好后，再夹上夹子。

凝胶需要1－2个小时。

4．预电泳取下夹子，拔出倒插的梳子，在自来水下将灌胶口冲洗干净，放入电泳槽，卡紧，灌入缓冲液，上下槽各300ml左右，注意用夹子夹紧上槽排放缓冲液的胶管。

80W衡功率电泳半小时。

5．点样用吸管吹干净灌胶口的废胶，将梳子顺插入灌胶口，开始点样，注意不要串样，梳齿不要将胶面弄坏。

6．电泳80W衡功率电泳1小时左右。

7．银染将玻板放入配制好的银染液中，银染半小时左右10．显影从银染液中拿出玻板快速水洗3－5秒，然后放入新鲜配制的显影液中，室温显影，直至条带清晰11．用自来水轻轻冲洗板子正反面几次，洗净残余的NaOH。

二．药品配制1．6%聚丙烯酰胺凝胶（PA）：Urea: 420.42gAcr: 60g 丙烯酰胺Bis: 3.16g10×TBE: 50ml加超纯水定容至 1L8% 聚丙烯酰胺PA：尿素 420.42gAcr： 80gBis: 4.212g10*TBE: 100ml加超纯水定容至 1L2. 10×TBETris-base: 216g硼酸：110gEDTA-Na2：14.88g3. binding（亲和硅烷）无水乙醇：2mlBinding原液：8ul冰醋酸：8ul4．Repel （剥离硅烷）三氯甲烷：100mlRepel：2ml5．Loading buffer：甲酰氨：49ml10mM EDTA（PH=8.0）：1ml溴酚蓝：0.125g二甲苯青：0.125g7．银染液蒸馏水：1500ml无水乙醇：150ml硝酸银溶液（1g/ml）：1500ul 8．显影液蒸馏水：1500ml氢氧化钠：30g甲醛：6ml硫代硫酸钠（10mg/ml）：300ul。

蛋白快速银染试剂盒操作步骤及注意事项蛋白快速银染试剂盒操作步骤及注意事项货号：G0180规格：20T有效期：6个月有效。

产品内容：试剂(A):Silver Stain Sensitizer(500×)2×1ml RT试剂(B):Silver Stain(100×)10ml RT避光试剂(C):Silver Stain Developer(5×)2×100ml RT避光试剂(D):Silver Stain Stop Buffer(10×)100ml RT产品说明：蛋白快速银染试剂盒(Protein Fast Silver Stain Kit)是一种快速的可用于SDS-PAGE 或非变性PAGE等蛋白银染染色的试剂盒，该试剂盒含有增敏步骤，可明显降低背景。

其优点还在于：1、操作简单、快速；2、可用于2D凝胶的银染，并可进行后续的质谱检测；3、目的条带清晰；4、不含甲醇。

Protein Fast Silver Stain Kit与Protein Silver Stain Kit 相比，前者操作速度更快，当检测灵敏度可能低于后者，尤其是在检测小分子量蛋白质的时候。

本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

自备材料：1、水平摇床或侧摆摇床2、去离子水(超纯)3、乙醇、冰乙酸操作步骤(仅供参考)：1、准备工作：以下操作以8.5×5.5cm、厚度为1.0mm的凝胶为例，以凝胶全部浸没到溶液为准，一般用量是25ml，对于凝胶体积较大的，各溶液的使用量需按凝胶体积比例放大。

整个银染过程应在摇床上进行，摇床转速控制在60～70rpm。

提前配制固定液，即按无水乙醇:冰乙酸:去离子水=5:1:4的比例配制。

提前配制洗涤液，即按无水乙醇:去离子水=1:4的比例配制。

2、水洗：电泳结束后，取凝胶放入去离子水中清洗2次，每次5min。

3、固定：取凝胶放入50～100ml固定液中，在摇床上室温摇动15～20min，重复固定步骤1次。

快速银染试剂盒Protein Stains Q产品编号：BSP029S-N包装规格：50 Assays产品简介银染是灵敏度较高的一种染色法，是对各种凝胶中的蛋白质进行染色时最常用的方法。

它通过被还原银离子在蛋白质上形成黑色来指示蛋白区带的。

银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍，可以检测低于2 ng的蛋白质。

本试剂盒在保证检测灵敏度的同时，还具有操作方便快速的优点，可在1小时内完成1块凝胶的银染。

运输和保存条件在常温下运输，收到后，将所有试剂放置在2-8°C的环境中保存，保质期一年。

产品组成成份BSP029-NBSP029S-N-1溶液A 300 ulBSP029S-N-2溶液B 20 x 10 mlBSP029S-N-3干粉0.2 gBSP029S-N-4溶液D 5 x 40 mlBSP029S-N-5溶液E 10 ml注意:使用前将干粉用10ml的双蒸水溶解成20倍浓缩的溶液C,再按照需要的体积,稀释为1倍浓度.使用方法1. 取出电泳后的聚丙烯酰胺凝胶，用蒸馏水冲洗凝胶,根据以下程序所需要的试剂量,取一定体积的溶液B2. 和D，用双蒸水稀释成1倍的溶液后再使用.3. 加入20 ml蒸馏水，置于摇床上，震荡5 min。

4. 倾出蒸馏水，加入40%的甲醇20 ml和10 ul溶液A，置于摇床上，震荡10 min。

5. 倾出溶液A，加入20 ml蒸馏水，置于摇床上，震荡5 min，重复1次。

6. 倾出蒸馏水，加入20 ml溶液B，置于摇床上，震荡5 min。

7. 倾出溶液B，加入20 ml蒸馏水，置于摇床上，震荡20s，重复1次。

8. 倾出蒸馏水，加入20 ml溶液C，置于摇床上，震荡10 min。

9. 倾出溶液C，加入20 ml蒸馏水，置于摇床上，震荡1 min.10. 倾出蒸馏水，加入20 ml溶液D和10 ul溶液A，缓慢摇动，直至蛋白质条带具有足够的显色强度（约30 s-1 min）。

碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线：400-168-3301或800-8283301订货e-mail：******************技术咨询：*****************碧云天网站微信公众号网址：考马斯亮蓝染色试剂盒(常规法)产品编号产品名称包装P0017A 考马斯亮蓝染色试剂盒(常规法) 1盒产品简介：本考马斯亮蓝染色试剂盒(Coomassie Blue Staining Kit)采用了最经典的考马斯亮蓝染色和脱色方法，以考马斯亮蓝R250为染料，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白电泳凝胶的常规染色和脱色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。

使用本试剂盒，采用常规染色脱色方法累计时间达到2-3小时后可以观察到蛋白条带；采用快速染色脱色方法20分钟左右即可观察到蛋白条带。

观察到最清晰的蛋白条带则需染色脱色更长时间。

本试剂盒中的染色液和脱色液经过改良，不含有毒的甲醇，但含有刺激性气味的乙酸。

包装清单：产品编号产品名称包装P0017A-1 考马斯亮蓝染色液100mlP0017A-2 考马斯亮蓝染色脱色液500ml—说明书1份保存条件：室温保存，至少一年有效。

注意事项：可以使用枪头盒或适当大小的培养皿作为染色和脱色的容器。

本染色液和脱色液呈酸性，有轻微腐蚀性，使用时请作必要防护。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：1.常规染色脱色方法：a.电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。

b.置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。

注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。

凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。

凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。

通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。

蛋白凝胶银染试剂盒使用说明书产品编号：SK6020储存条件：RT，保质期1年。

产品内容：产品内容SK6020-25TA液（增敏浓缩液200×）5mlB液（银染浓缩液100×）10mlC液（显色浓缩液5×）2×100mlD液（添加液）5ml说明书1份产品说明：本试剂盒采用高灵敏度的银染染料，可应用于变性胶及非变性胶的蛋白染色，具有目的条带清晰、背景低、操作时间可灵活控制的优点。

另外，本试剂盒增加了一步短时敏化作用步骤，可明显降低背景及提升目的条带的亮度。

使用说明：（需自备无水乙醇、冰醋酸）以下操作步骤中各溶液的用量以大小为8.5×5.5cm、厚度为1.0mm的凝胶为例，以凝胶全部浸没到溶液为准，置于摇床上操作，一般用量25ml。

对于大型凝胶，各溶液的配制量需按凝胶体积的比例放大。

注：实验前准备50ml固定液（冰醋酸：乙醇：超纯水=1:4:6）、50ml洗脱液（10%乙醇）和50ml 终止液（5%的冰醋酸）。

1．水洗：电泳完成后，用超纯水洗胶2次，每次洗涤5分钟。

2．固定：用25ml固定液固定凝胶2次，每次固定15分钟。

3．洗脱：用洗脱液洗胶2次，每次洗涤5分钟。

4．水洗：用超纯水洗胶2次，每次洗涤5分钟。

5．增敏：将上一步洗好的凝胶置于增敏液中，室温下准确孵育1分钟后用超纯水洗胶3次，每次洗涤20秒。

增敏液的配制：取A液125μl加入到25ml超纯水中，混匀。

6．银染：弃去超纯水，将凝胶置于银染工作液中孵育30分钟。

银染液的配制：取B液250μl、D液50µl 加超纯水至25ml，混匀。

7．水洗：用超纯水快速洗胶2次，每次洗涤准确控制为20秒。

8．显影：立即将洗好的凝胶浸没在显影液中，室温孵育2-3分钟，直至蛋白条带显示清晰。

显影液的配制：取C液5ml、D液30µl加超纯水至25ml，混匀。

注意：显影30秒内，蛋白条带开始显现，继续显影至2-3分钟。

天净沙系列CAT#:220509-10常温运输和保存脂多糖PAGE 胶银染试剂盒LPS PAGE Silver Staining Kit使用手册V1.0江苏天净沙基因诊断技术有限公司网址：；电话：400-6605850；电邮：*****************产品及特点脂多糖银染的原理是银离子(Ag+）可与脂多糖形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛在碱性环境下使Ag+还原成银颗粒，可把脂多糖电泳带染成黑褐色。

本产品就是根据此原理开发，它具有下列特点：1.即开即用，用户不需要单独准备各个成分，优化操作条件。

2.可用于聚丙烯酰胺凝胶电泳得到的脂多糖。

3.灵敏度高，能检测到几十ng的脂多糖条带。

4.比常规的银染方法快捷，只有染色和显影两步，只需要20分钟。

5.本产品足够配制1000mL的工作液，足够10次银染。

6.本产品只能用于科研。

规格及成分本产品采用小扁盒（无垫）包装成份编号规格包装材料溶液A成分一（干粉）220509a12克10mL棕色塑料瓶溶液A成分二，10×220509a2100mL125mL本色瓶溶液A成分三，10×220509a3100mL125mL本色瓶溶液B成分一，10×220509b1100mL125mL本色瓶溶液B成分二220509b25mL5mL本色瓶使用手册220509sc1份无运输及保存常温运输和保存，保存期限为一年。

自备试剂去离子水。

使用方法一、配制溶液A（即染色液）100mL注意：溶液A需要新鲜配制，不能存放。

所需溶液A（染色液）的体积跟PAGE胶的面积大小相关，一般的10cm×10cm的mini-PAGE胶需要20-30mL。

下面的用量是针对配制100mL溶液A。

如果配制的溶液A的体积不是100mL，则需按比例改变各成分用量。

1.在一干净烧杯中加入下列成分，充分搅拌混匀即可。

成分用量自备去离子水80mL溶液A成分一0.2g溶液A成分二10mL溶液A组分三10mL二：配制溶液B100mL需要配制的溶液B（显色液）的体积完全跟PAGE胶的大小相关，一般的10cm×10cm的mini-PAGE胶需要20-30mL溶液B。

一种快速有效检测SSR标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶的银染方法郭培国;刘文杰;李海洋;王直亮;夏岩石;李荣华【摘要】聚丙烯酰胺凝胶银染法是一种具有高分辨率检测SSR标记的有效方法,然而传统的银染方法存在操作步骤较多、所需时间较长及试剂种类与用量较多等不足.本研究利用菜心和烟草SSR标记为研究对象,建立一种能快速有效检测其PCR扩增产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶的银染方法.该方法包括染色和显影2个主要操作步骤,整个银染流程耗时6～7 min,只需要AgNO3、NaOH和甲醛3种试剂,所检测SSR标记的DNA条带清晰、易辨.与其他银染法相比,本研究建立的银染法具有易于操作、耗时少、所需试剂种类和用量少及检测效果好的优势.【期刊名称】《广州大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(015)004【总页数】6页(P8-12,49)【关键词】SSR标记;检测;非变性聚丙烯酰胺凝胶;银染【作者】郭培国;刘文杰;李海洋;王直亮;夏岩石;李荣华【作者单位】广州大学生命科学学院,广东广州510006;广州大学生命科学学院,广东广州510006;广州大学生命科学学院,广东广州510006;广州大学生命科学学院,广东广州510006;广州大学生命科学学院,广东广州510006;广州大学生命科学学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】Q503DNA简单序列重复(SSR)标记在植物基因组中覆盖面广、数量丰富，且具有特异性强、共显性和操作简单的优点[1]，已成为研究工作者常用的分子标记之一.该技术已广泛应用于植物的遗传多样性分析、生物进化、遗传图谱的构建、QTL定位和分子标记辅助育种等研究和应用工作[2-3].聚丙烯酰胺凝胶的银染法是检测SSR标记的常用方法之一，该方法具有较高的灵敏度和较高的分辨率，可鉴别出低至1 pg·mm-2的DNA量和区分1个碱基的差异[4-5].但传统经典的银染法操作流程含有固定、漂洗、银染、漂洗、显色和终止等步骤，在使用前需配制一些溶液等[5]，存在操作复杂、耗时和费力等不足；另外，其染色的一致性、银染后凝胶的贮存时间等方面亦不是很理想[6-7].针对银染操作繁琐及染色效果的不足，先后有一些研究对银染方法进行了改进，如修改了固定步骤中固定液的成分、减少了显色和终止步骤要求10 ℃低温的条件[8-9]；取消固定步骤、调整染色液和显色液化学成分及比例等[6, 10-16].但这些改良的银染方法在操作繁琐程度或效率上仍存在不足，在化学试剂种类及用量上面还有减少的空间.据此，本研究在前人建立的银染方法基础上，利用菜心(Brassica campestrisL.ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee)和烟草(Nicotiana tabacum L.)SSR标记作研究对象，探讨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染检测方法，建立一种仅需染色和显色2个主要步骤、3种试剂的操作简单、耗时少和分辨力高的快速有效检测SSR 标记的银染方法，适用于大量SSR标记的基因分型工作.1.1 材料1.1.1 植物材料供试的菜心材料为“四九-19号菜心”、“油绿501”、“3T6”和“柳叶50”，由广州市农业科学院提供；烟草材料“红花大金元”、“粤烟98”、“118-3”和“岩烟97”，由广东省烟草南雄科学研究所提供；盆栽种植供试的菜心和烟草材料.1.1.2 SSR标记的引物和试剂选取菜心和烟草SSR标记的引物组合各1对，用于检测银染的效果.这些SSR标记的引物由生物工程生工(上海)股份有限公司合成，其信息见表1.DNA分子大小标样DL500购自于日本宝生物工程株式会社(Takara Bio Inc.)，其他试剂均购自于Sigma-Aldrich公司.1.2 方法1.2.1 DNA的提取采收幼嫩的菜心和烟草材料的叶片，按李荣华等[17]改良的CTAB法提取菜心和烟草材料的基因组DNA；采用琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量，用NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo Scientific，USA)检测DNA的浓度，并将之调整到10 ng·μL-1作为SSR扩增的DNA模板.1.2.2 PCR扩增及电泳分离在10 μL的PCR反应总体积中，含10 ng·μL-1的DNA模板2.0 μL，10×PCR Buffer 1.0 μL，25 mmol·L-1 MgCl2 0.8 μL，10 μmol·L-1正向引物0.25 μL，10 μmol·L-1反向引物0.25 μL，10 mmol·L-1 dNTPs 0.25 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.15 μL，ddH2O 5.3 μL.PCR扩增循环反应程序：94 ℃预变性5 min，之后按94 ℃下变性45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min的PCR程序运行35个循环，最后再在72 ℃条件下延伸10 min；之后置于4 ℃条件下贮藏备用.选取美国CBS公司MGV-216-33双面三倍宽垂直电泳槽及电泳仪，电泳玻璃板大小为33 cm宽×16 cm高，采用6%(丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺之比为29∶1)的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离SSR标记的PCR扩增产物.凝胶厚度为1.5 mm，每个载样孔宽3 mm，上样2 μL.电泳条件为电压120 V，电泳时间120 min.1.2.3 银染方法电泳结束后，取下附有凝胶的玻璃板，按表2中列出的各个银染方法的实验条件和步骤进行操作，除有说明外，均在室温下操作.银染结束待凝胶晾干后，用BenQ M800扫描仪扫描，贮存扫描图片.在电脑中观察、读取数据并分析.2.1 不同银染方法的检测效果图1为除去颜色并调整至适宜亮度和对比度后不同银染法检测菜心和烟草SSR标记的银染图.从图1可见，所有的银染方法均能检测到烟草和菜心SSR标记的主条带，但BASSAM等[5]、QU等[10]和KUMAR等[16]3种银染法的背景反差较小，DNA条带强度低和清晰度不高，一些具有多态性的次级条带难观察到，检测效果差.SANGUINETTI等[8]和BYUN等[13]银染法的条带强度和清晰度要高于前3种方法，主条带清晰易辨，且能粗略判断次级条带的多态性，但清晰度不高.而AN等[14]、LIANG等[15]和本研究建立的银染法效果更进一步，经扫描成像后的凝胶背景较浅、清晰度高，菜心和烟草SSR标记的主、次条带强度高且清晰，容易检测；尤其是本研究建立的改良银染法，检测效果最佳.A～H分别为BASSAM等[5]、SANGUINETTI等[8]、QU等[10]、BYUN等[13]、AN等[14]、LIANG等[15]、KUMAR等[16]和本研究建立的银染法.图中M为DNA分子大小标样，1～4分别为烟草品种“岩烟97”、“ 红花大金元”、“ 118-3”和“粤烟98”的SSR标记TME0580的扩增产物，5～8分别为菜心品种“油绿501”、“柳叶50”、“四九-19号菜心”和“3T6”的SSR标记CX-3的扩增产物.2.2 不同银染方法所需时间和试剂种类分析根据各个银染方法报道的从固定或染色步骤开始至完全显色或终止步骤的操作流程，测定各银染法检测菜心和烟草SSR标记PCR扩增产物所耗费的时间.几种银染方法实际所需检测时间见表3.从表3可见，BASSAM等[5]、SANGUINETTI等[8]和KUMAR等[16]建立的银染方法所需的时间较长，检测需时在30 min以上；QU 等[10]和BYUN等[13]建立的银染方法需要15 min或以上，而AN等[14]和LIANG等[15]建立的银染法减少了银染所需的时间，但仍分别需时10 min；而本研究建立的银染法只需6～7 min，整个银染过程所需时间最短.从银染所需试剂的种类来看，BASSAM等[5]、SANGUINETTI等[8]和BYUN等[13]的方法需5种试剂，QU等[10]、AN等[14]、LIANG等[15]和KUMAR等[16]银染法需6种试剂，而本研究建立的改良银染法仅需3种试剂(表3)，这3种试剂为AgNO3、NaOH和甲醛，且用量亦相对较少(表2).目前SSR标记主要采用琼脂糖凝胶电泳检测和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的方法，其中琼脂糖凝胶电泳技术由于易于操作而被广泛使用，但存在难以分辨几个碱基差异的不足；聚丙烯酰胺凝胶电泳可区分几个碱基的差异，但BASSAM等[5]和SANGUINETTI等[8]建立的传统银染法检测聚丙烯酰胺凝胶中SSR扩增产物，具有操作步骤较多(包括固定、清洗、染色、清洗、显色、终止和清洗等步骤)、耗时较长等不足；使用荧光SSR标记技术能提高检测效率[18]，但需要较为昂贵的专用仪器设备，检测所需的试剂药品花费也较高，普通实验室里难以开展检测工作.据此，不少研究对银染法进行了改进，如在染色步骤中加入5%～10%乙醇，将原银染法中的固定、清洗和染色步骤合并成一个同时进行固定和染色的步骤[6, 10, 13-16, 19]，或不加乙醇直接进入染色步骤[11]；将银染检测过程减少至2个[6, 15]或3～4个主要步骤[10-11, 13-14, 16]，但有些银染法流程的操作较为复杂，如需在5 ℃[16]或55 ℃条件下显色[13].报道这些改进方法银染操作时间最少可达13～15 min[11, 16],有的最低可至10 min左右[6, 10, 13-14],甚至达7 min [15].但利用业已报道的银染法的操作步骤检测本研究菜心和烟草SSR标记时发现，需时最少的为AN等[14]和LIANG等[15]建立的银染法，均为10 min，但高于其报道所需的7～9 min的检测时间，这一现象亦在其他银染法[5, 10, 13, 16]中出现.究其原因，是各方法中显色步骤所需时间均高于其报道所需的最少时间(数据未发表)，因而导致整个检测过程所需时间的增加.而本研究建立的银染法，只有染色和显色2个主要步骤，检测菜心和烟草SSR标记只需要6～7 min；从检测SSR标记所需时间来看，优于其他银染法.从菜心和烟草SSR标记的检测效果来看，BASSAM等[5]、QU等[10]和KUMAR 等[16]建立的银染方法背景较浅、显淡黑色，DNA条带强度较弱，尽管能分辨出SSR标记的主条带，但次级条带相对较模糊，辨别难度较大，表明这些方法的分辨力较低.SANGUINETTI等[8]、AN等[14]、BYUN等[13]、LIANG等[15]及本研究建立的改良银染法染色背景呈浅黄色，SSR标记的DNA条带强度高，经扫描除黄色背景色、调整亮度和对比度后，凝胶图背景浅、SSR标记的主、次级条带较清晰，易于辨别，均可有效检测菜心和烟草的SSR标记.其中AN等[14]、LIANG等[15]及本研究建立的改良银染法DNA条带强度高、对比度大、分辨力高，检测效果好,尤为本研究建立的改良银染法，DNA条带更为清晰易辨.另外，本研究建立的改良银染法检测菜心和烟草SSR标记时所需试剂种类和用量最少，与检测效果较好、耗时较短的AN等[14]和LIANG等[15]所需6种试剂相比，未使用这2种方法需要的乙醇、HNO3、Na2CO3或铬黑T(EBT)，只利用这2种方法均具有的AgNO3、NaOH和甲醛3种试剂.AgNO3和NaOH的用量与An等[14]方法基本一致，但分别为LIANG等[15]方法的75%和25%；而甲醛的含量则为这2种方法的25%.这一结果表明，染色步骤中溶液的乙醇和HNO3成分不影响DNA的检测效果，但较高浓度的HNO3可能延长显色步骤中DNA显色所需的时间.究其原因是染色液中具有的HNO3，染色结束后1次5～10 s的去离子水冲洗难以将HNO3清洗完全，残留在凝胶中的HNO3减缓显色步骤中碱性环境下甲醛与Ag+的反应速度，从而延长显色时间.本研究建立一种能快速、有效检测SSR标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染方法，检测效果明显优于传统的银染方法.该银染法只需染色和显色2个主要步骤，整个银染过程耗时6～7 min，检测只需AgNO3、NaOH和甲醛3种试剂且用量少.具有简便快速、成本低、检测效果好和对环境污染少的特点，适合于大量样品的SSR标记的基因分型工作.【相关文献】[1] POWELL W, MACHRAY G C, PROVAN J. 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SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶快速银染方法的建立李建武;李宁【摘要】Traditional silver staining method of denaturing polyacrylamide gel electrophoresis is time-consuming, tedious, and difficult for large-scale operation. An improved silver staining method and four other reported methods were compared in terms of staining quality, time consumption, and reagent cost. For the improved silver staining methods, rinsing and fixing were omitted at the early stage, and only silver staining, rinsing, developing and ending were needed, taking only 12 min total y in the process. This improved method was time efficient, and showed clear target fragments, which used less amount of reagents and was easy to operate when compared with other reported methods.%针对传统聚丙烯酰胺凝胶电泳银染方法存在染色时间长、步骤繁琐，难以大批量试验等诸多不利因素，对改良的银染检测方法与文献报道的4种银染检测方法的染色效果、时间及试剂成本等进行对比分析。

结果表明，改良方法省略前期的漂洗与固定步骤，只进行银染、漂洗、显影和终止4个步骤，整个银染过程耗时12 min，较其他方法耗时少，目标片段较清晰，试剂用量少，过程较为简单，可批量操作。

石蜡切片神经纤维波蒂安（Bodian）银染试剂盒产品说明书（中文版）主要用途石蜡切片神经纤维波蒂安（Bodian）银染试剂是一种旨在使用标准化的化学分离石蜡方法和银还原技术，分析存档中的石蜡包埋的组织切片中神经纤维、神经末梢、神经原纤维形态学的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心改良波蒂安（Bodian）方法、成功实验证明的。

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产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。

技术背景神经纤维对于银离子敏感。

通过嗜银（argyrophilic）染色，即使用蛋白银（silver proteinate）浸润组织切片，由铜离子移去结缔组织中的银，实现神经纤维和结缔组织的差异化，在还原剂的存在下，使神经纤维上的离子银还原为可见金属银沉积，呈现黑色。

产品内容脱蜡液（Reagent A）300毫升补水液A（Reagent B）100毫升补水液B（Reagent C）100毫升补水液C（Reagent D）100毫升补水液D（Reagent E）300毫升染色液（Reagent F）50毫升置换液（Reagent G）1毫升还原液（Reagent H）10毫升强化液（Reagent I）10毫升显色液（Reagent J）10毫升平衡液（Reagent K）10毫升产品说明书1份保存方式保存在4℃冰箱里，避免光照；试剂具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证3月用户自备小型玻璃染色缸：用于石蜡切片的脱蜡和染色操作培养箱：用于切片染色孵育中性树脂：用于切片封片光学显微镜：用于切片染色后观察分析实验步骤一、脱蜡处理1．取出10片待测的10微米厚的石蜡包埋的组织切片（注意：石蜡包埋前，组织切片须用10％甲醛4℃条件下，固定16小时，此步很重要）2．按下表依次放进小染色缸里孵育3．小心移去切片上的补水液D（Reagent E）二、样本染色处理1．准备一个6孔板或小型玻璃染色缸2．加入5毫升染色液（Reagent F）（注意：可以进行10张切片处理）3．加入100微升置换液（Reagent G），混匀4．放入整个切片，室温下孵育48小时，或直至切片呈现黑色，避免光照5．取出切片，小心移去切片上的染色液（Reagent F）6．室温下，小心将切片置入50毫升补水液D（Reagent E）中孵育15秒7．小心移去切片上的补水液D（Reagent E）8．小心加上200微升还原液（Reagent H）在切片上，铺满整个切片样品表面9．室温下孵育10分钟10．小心移去切片上的还原液（Reagent H）11．室温下，小心将切片置入50毫升补水液D（Reagent E）中孵育30秒12．小心移去切片上的补水液D（Reagent E）三、样本显色处理1．小心加上200微升强化液（Reagent I）在切片上，铺满整个切片样品表面2．室温下孵育5分钟3．即刻移去切片上的强化液（Reagent I）4．室温下，小心将切片置入50毫升补水液D（Reagent E）中孵育30秒5．小心移去切片上的补水液D（Reagent E）6．小心加上200微升显色液（Reagent J）在切片上，铺满整个切片样品表面7．室温下孵育3分钟至5分钟，或直至背景出现灰色为止（注意：避免过度显色；显微镜下观察后继续下列操作）8．即刻移去切片上的显色液（Reagent J）9．室温下，小心将切片置入50毫升补水液D（Reagent E）中孵育30秒10．小心移去切片上的补水液D（Reagent E）11．即刻加上200微升平衡液（Reagent K）在切片上，铺满整个切片样品表面12．室温下孵育5分钟13．小心移去切片上的平衡液（Reagent K）14．室温下，小心将切片置入50毫升补水液D（Reagent E）中孵育2分钟15．小心移去切片上的补水液D（Reagent E）16．（选择步骤）复染处理（注意：建议使用核固红复染试剂盒- HLS40011）17．（选择步骤）透明处理18．放上盖玻片或封片（中性树脂）19．即刻在一般光学显微镜下观察：神经纤维呈现黑色结缔组织呈现灰色与黑色之间细胞核呈现粉红色（如果复染）背景呈现灰色或紫色注意事项1．本产品为50次操作2．操作时，须戴手套3．试剂具有腐蚀性，注意操作安全4．建议使用玻璃染色缸5．石蜡包埋前，组织切片须用10％甲醛4℃条件下，固定16小时，否则造成样品支离破碎6．每次更换试剂溶液时，保持切片面基本晾干7．试剂溶液在切片表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满切片表面8．染色完成后，即刻进行光学显微镜观察9．样品染色后保存，避免光照10．本公司提供系列组织细胞神经系统成分染色试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定显色清晰。