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卧龙自然保护区落叶阔叶林土壤微生物分布规律及功能菌的筛选韩梅;焦如珍;董玉红【摘要】利用平板分离培养技术对卧龙自然保护区落叶阔叶天然林植被下不同层次土壤微生物区系进行研究.结果表明:各样地不同土层细菌、真菌及放线菌数量均表现为FH层＞A层＞B层＞C层,而各样地不同菌类的数量均表现为细菌＞放线菌数＞真菌.利用选择性培养基羧甲基纤维素钠筛选纤维素分解菌28株;利用苯胺蓝平板脱色法及愈创木酚变色圈法筛选具有木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的细菌2株、真菌25种、放线菌3种,具有漆酶的真菌5种;在无机磷Ca3(PO4)2为唯一磷源的培养基上筛选出97株溶磷菌;在无氮培养基上筛选出固氮菌2株;溶磷菌无论种类还是数量均比纤维素分解菌、木质素分解菌及固氮菌多.【期刊名称】《林业科学》【年(卷),期】2013(049)010【总页数】5页(P113-117)【关键词】落叶阔叶林;微生物区系;功能菌筛选【作者】韩梅;焦如珍;董玉红【作者单位】中国林业科学研究院林业研究所北京100091;中国林业科学研究院林业研究所北京100091;中国林业科学研究院林业研究所北京100091【正文语种】中文【中图分类】S718.8森林是陆地生态系统的主体，是人类和多种生物赖以生存和发展的基础。
第七次全国森林资源清查结果(贾治邦，2009)显示:截至2008年，我国森林面积为1.95亿hm2，其中天然林面积 1.20亿hm2，占有林地面积的65.99%;天然林中98%为天然次生林，在我国森林中占有很重要的地位。
我国人均森林面积0.145 hm2，不足世界人均占有量的四分之一。
长江上游防护林50年来已经损毁过半(任海等，2002;贾志邦，2009)，严重影响我国长江流域的生态环境。
四川卧龙自然保护区是长江、岷江上游重要的天然次生林分布地，被誉为“生物基因库”、“天然动植物园”，物种丰富，森林植被带垂直分布明显，森林土壤也呈明显的垂直分布。
纤维素降解菌的筛选及特性研究摘要生物堆肥是大部分养殖场固废资源化利用的主要手段，具有投资小、效益高、有机固体废弃物重复资源化利用效率高等优点，但堆肥过程中也存在一些缺陷，如发酵周期长、有臭味、纤维素木质素分解不彻底等。
牛粪中含有大量未能消化的纤维素和半纤维素，它们是影响堆肥腐熟进程、决定其堆肥产品质量的关键因素。
因此，在牛粪堆肥发酵中选择添加合适的堆肥发酵菌剂和高效纤维素降解菌剂，是解决畜禽粪便堆肥周期长，降解率低等问题的有效途径。
本研究采用富集培养及纯培养法从牛粪中将纤维素降解细菌进行分离并分析其降解特性，以期获得一些高效纤维素降解菌。
采用水解圈法和3，5-二硝基水杨酸（DNS）法进行菌株筛选与酶学特性研究，结合形态学方法对其初步鉴定，分子生物学方法对其鉴定其种属，共得到降解效果良好的菌株3株，分别命名为DH01、DH02、DC02，其中DH01为枯草芽孢杆菌，其纤维素酶活性最高；DH02为苏云金芽孢杆菌，纤维素酶活性次之；DC02为贝莱斯芽孢杆菌，纤维素酶活性低于前两者。
三种菌株均能不同程度分解纤维素，因此，可为牛粪堆肥发酵提供菌种思路，具有重要应用价值。
关键词：纤维素降解菌，纤维素酶，分离，酶学特性AbstractBiological composting is the main method for the utilization of solid waste resources in most farms. It has the advantages of low investment, high efficiency, and high efficiency in the reuse of organic solid waste. However, there are also some shortcomings in the composting process, such as long fermentation cycles and Odor, incomplete decomposition of cellulose and lignin, etc. Cow manure contains a large amount of undigested cellulose and hemicellulose, which are the key factors that affect the maturity of compost and determine the quality of the compost product. Therefore, selecting and adding appropriate composting fermentation inoculants and high-efficiency cellulose degrading inoculants in the cattle manure composting fermentation is an effective way to solve the problems of long composting cycle of livestock and poultry manure and low degradation rate. In this study, enrichment culture and pure culture methods were used to isolate cellulose-degrading bacteria from cow manure and analyze their degradation characteristics, in order to obtain some high-efficiency cellulose-degrading bacteria. Using hydrolysis circle method and 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method for strain screening and enzymatic characteristics research, combined with morphological methods for preliminary identification, molecular biological methods to identify its species, a total of Three strains with good degradation effects were named DH01, DH02, and DC02. Among them, DH01 is Bacillus subtilis with the highest cellulase activity; DH02 is Bacillus thuringiensis, followed by cellulase activity; DC02 is Bacillus velezs Bacillus,cellulase activity is lower than the former two. The three strains can decompose cellulose to different degrees, so they can provide strain ideas for cattle manure composting and fermentation, which has important application value.Key words: cellulolytic bacteria，Cellulase，isolation，enzymatic properties目录1. 引言 (1)2. 材料与方法 (2)2.1 试验材料 (2)2.1.1样品来源 (2)2.1.2培养基 (2)2.1.3供试溶液 (2)2.1.4供试仪器 (2)2.2 试验方法 (3)2.2.1纤维素降解菌的富集 (3)2.2.2纤维素降解菌的初筛 (3)2.2.3纤维素降解菌的复筛及酶活测定 ............................................................ 错误!未定义书签。
土壤中纤维素分解菌的分离和筛选及其部分特性的研究摘要取适量的土壤样品进行蒸馏水溶解、富集培养、刚果红纤维素培养基筛选等操作后，分离出能够分解纤维素的细菌和真菌，对这些菌进行纯培养，观察其菌落颜色、形态等特征，并对所得菌用革兰氏染色法染色。
实验后期分别通过甲基红试验、淀粉水解实验、pH梯度试验等生理生化反应，检测所得纤维素分解菌在分解过程中是否产酸、能否水解淀粉，为日后进一步的研究打下基础。
关键词土壤纤维素分解菌分离筛选前言土壤中的某些微生物有分解纤维素的能力。
地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%—60%能被这些微生物分解利用。
微生物分解纤维素主要是因为它们能够分解纤维素酶。
本次试验就是的目的就是从土壤中将这些能够分解纤维素的细菌分离出来，并对它们的形态特征、生理生化等进行研究和探讨。
1土壤中纤维素分解菌的分离及筛选1.1土样的采集土壤中的微生物，大约70%-90%是细菌。
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约3—8cm的土壤层。
因此，土壤取样时，一般要铲去表层土。
另外，土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。
综合各种因素，本小组分别从生科院南楼后的花园中和学生公寓4号楼下的落叶堆下取土壤样品。
1.2分离与筛选1.2.1土壤悬液的制备称取土样5 g，迅速倒人带玻璃珠的45 mL无菌水瓶中，振荡20 min，使土样充分打散，即成为土壤悬液。
1.2.2 富集培养在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前，先通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
富集培养所需要的仪器有：250ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、摇床、玻璃珠、称量纸等。
选择培养基的制备比例见下：按上表比例配制50ml选择培养基。
在250ml锥形瓶中装入50ml培养基，放5—6颗玻璃珠，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层牛皮纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
银杏根际土壤中菌株的分离及纤维素降解菌的筛选作者：吴越王兰萍耿荣庆来源：《现代农业科技》2018年第23期摘要; ; 为了寻找高效的纤维素降解菌，结合运用纤维素刚果红水解圈测定和纤维素酶活力测定，从银杏根际腐殖土中分离纤维素降解菌。
结果表明，从根际土壤中共分离到放线菌15种、细菌6种、真菌7种，放线菌为土壤中的优势菌;从分离的28种菌株中筛选出4株纤维素降解菌，初步鉴定出1株高产维素降解菌为青霉菌属，可用作进一步实际应用研究的试验菌株。
关键词; ; 银杏;根际土壤;纤维素降解菌;分离;筛选;酶活力中图分类号; ; S154.3; ; ; ; 文献标识码; ; A; ; ; ; 文章编号; ;1007-5739（2018）23-0187-03纤维素（cellulose）由葡萄糖组成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖。
纤维素是世界上蕴藏量最丰富的天然高分子化合物，生产原料来源于木材、棉花、稻草、芦苇、麻、桑皮和甘蔗渣等。
纤维素是一种宝贵的可再生资源，在工业、农业、食品等领域都具有重要的应用。
迄今为止，纤维素的开发利用主要通过化学处理和生物降解2类方法，相比较于化学处理方法，生物降解法因具有对环境友好、生产成本低等优点而倍受关注[1-2]。
纤维素酶是一种能降解纤维素生成葡萄糖的复合酶，在木质纤维素资源化利用过程中发挥着重要作用。
自然界中的昆虫、软体动物、原生动物、真菌、放线菌和细菌等都能产生纤维素酶，主要是由来自土壤和动物消化道的微生物菌群产生[3-5]。
因此，筛选能产生纤维素酶的高产微生物菌株是纤维素高效利用的重要基础。
本研究从银杏根际腐殖土壤中分离纯化微生物菌株，进而利用羧甲基纤维素选择培养基筛选高纤维素酶活的纤维素降解菌，为纤维素资源的有效降解和合理利用提供基础材料。
1; ; 材料与方法1.1; ; 样品采集在校园银杏林中，靠近根部挖取带有腐烂枯枝败叶的土壤约50 g，将采集的样品装到无菌袋中并编号，放入冰盒中带回实验室4 ℃保存。
菜地土壤中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化1. 引言1.1 研究背景菜地土壤中的纤维素降解菌是一类具有潜在应用价值的微生物资源。
纤维素是植物细胞壁的主要结构组分，由纤维素酶降解可以释放出储存在其中的碳源，为微生物的生长提供能量。
纤维素降解菌在资源化利用方面具有重要意义。
随着环境污染和能源危机的日益严重，利用微生物对植物纤维素进行高效降解已成为当前研究的热点之一。
菜地土壤中自然存在着大量微生物群落，其中可能潜藏着具有高效纤维素降解能力的菌株。
通过对菜地土壤中的微生物群落进行筛选和鉴定，可以发现一些潜在的纤维素降解菌。
这些菌株可能具有特殊的降解能力和适应性，在优化的产酶条件下可以获得更高的酶产量，为纤维素降解技术的进一步应用提供支持。
对菜地土壤中纤维素降解菌的筛选及产酶条件优化的研究具有重要的理论和应用意义。
通过深入探究纤维素降解菌的机理和特性，可以为资源化利用提供新的思路和方式。
1.2 研究目的研究目的是针对菜地土壤中潜在的纤维素降解菌进行筛选，通过优化产酶条件来提高纤维素酶的产量和活性。
通过研究纤维素降解菌的产酶机理，探讨其在纤维素降解过程中的作用机制，并展望其在生物质能源、环境保护和农业生产中的应用前景。
本研究还将对菜地土壤中纤维素降解菌的分子生物学特性进行深入研究，为揭示其种属特征、代谢途径和遗传变异提供依据。
综合考虑以上目的，本研究旨在为纤维素降解菌的筛选及产酶条件优化提供科学依据，推动其在资源化利用和环境保护领域的应用与推广。
1.3 研究意义纤维素是一种广泛存在于植物细胞壁中的多糖物质，是地球上最丰富的可再生生物质资源之一。
而纤维素的高效降解一直是生物资源化利用的重要研究方向。
菜地土壤中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化研究，对于挖掘和利用纤维素降解菌具有重要的意义。
寻找能够高效降解纤维素的细菌菌株，有助于提高纤维素的利用效率，减少资源浪费，同时也有利于环境保护和生态平衡的维持。
通过优化产酶条件，提高纤维素降解菌产酶量和酶活力，不仅可以降低生产成本，还可以提高纤维素降解效率，加速生物资源转化与再利用的进程。
从⼟壤中筛选出能够分解纤维素的真菌从⼟壤中筛选出能够分解纤维素的真菌1．⼟样采集⼟样采集的⽅法与本专题课题2类似。
⼟样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微⽣物。
如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在⼟壤中，过⼀个⽉左右也会有能分解纤维素的微⽣物⽣长。
2．选择培养在250 mL 锥形瓶中装⼊30 mL 培养基，⽤8层纱布做成瓶塞，将瓶⼝塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），⽤线绳扎紧，在121 ℃下⾼压蒸汽灭菌20 min 。
选择培养的操作：称取⼟样20 g ，在⽆菌条件下加⼊装有30 mL 培养基的摇瓶中。
将摇瓶置于摇床上，在30 ℃下振荡培养1～2 d ，⾄培养基变混浊。
此时可以吸取0.1 mL 培养液进⾏梯度稀释和涂布平板，也可以重复选择培养的步骤⼀次，然后再进⾏梯度稀释和涂布平板。
3．梯度稀释将选择培养后的培养基进⾏等⽐稀释，稀释最⼤倍数到106。
4．将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上按照马丁⽒琼脂培养基（分离真菌⽤）制备培养基。
将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml 涂布在培养基上，滴加在平板培养基上，⽤涂布器将菌液涂布均匀，在30 ℃倒置培养，⾄菌落长出。
每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照。
刚果红染⾊法：在倒平板时就加⼊刚果红。
或先培养微⽣物，再加⼊刚果红进⾏颜⾊反应。
5．挑选产⽣透明圈的菌落挑取产⽣明显的透明圈的菌落，⼀般即为分解纤维素的菌落。
接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C － 370C 培养，可获得纯培养。
可设置对照实验：⽤⽜⾁膏蛋⽩胨培养基与之对照。
纤维素降解菌的分离与筛选微生物资源的开发与利用纤维素是一种广泛存在于自然界中的高分子有机化合物，由大量的葡萄糖分子组成。
在生物学中，纤维素是植物细胞壁的主要组成部分，也是陆地生态系统中最常见的有机物质之一。
然而，由于其结构复杂、难以分解，纤维素对于生物体的降解造成了很大的挑战。
而纤维素降解菌就是一类能够分解、降解纤维素的微生物。
它们通过产生纤维素酶，将纤维素分解成更小分子的糖类，从而为自身提供能量和营养物质。
这类菌种在生物能源、环境保护、农业生产等方面具有重要的应用潜力。
因此，分离与筛选纤维素降解菌，开发和利用其微生物资源，对于推动生物技术的发展和解决环境问题具有重要意义。
纤维素降解菌的分离是研究者们开展微生物资源开发与利用工作的第一步。
在分离纤维素降解菌时，一般会从自然环境中选取一些能够产生纤维素降解酶的样品，如土壤、淡水等，进行采样。
接下来，通过在富含纤维素的培养基上进行接种和筛选培养，通过观察菌落和菌液的形态、颜色等特征，以及通过测定降解效果，最终得到纤维素降解菌的纯培养。
筛选纤维素降解菌的关键是通过对菌株的降解能力评价。
这种评价可以通过孔板筛选、固体培养基筛选以及液体培养基筛选等方式进行。
其中，孔板筛选是最常用的方法之一。
通过孔板上的纤维素固体培养基，可以筛选出具有较强纤维素降解能力的菌株。
此外，在液体培养基中添加纤维素底物，通过测定底物的降解率，也可以评价菌株的降解能力。
纤维素降解菌的开发与利用离不开对其微生物资源的研究和应用。
一方面，研究者们可以通过对纤维素降解菌的基因组学、蛋白质组学等方面的研究，了解其纤维素降解途径和关键酶系统，为进一步优化菌种提供理论基础。
另一方面，纤维素降解菌的应用潜力很广泛。
例如，通过改造纤维素降解菌的基因，可以增强其降解能力，使其在生物质能源开发中发挥更大的作用；同时，纤维素降解菌的应用还可以在纸浆工业、饲料添加剂以及餐厨垃圾处理等方面发挥积极作用。
总之，纤维素降解菌的分离与筛选是开发与利用其微生物资源的关键步骤。
一株纤维素降解茵的筛选与鉴定摘要从落叶覆盖的腐殖层土壤中富集、分离得到12株纤维素降解茵，从中筛选出一株高效降解茵(X10)，研究其最适宜的培养条件为：配制以葡萄糖+微晶纤维素(1：1)为碳源、以蛋白胨+牛肉膏(1：1)为氮源的培养基，pH值7.5，30℃下培养40h，测得纤维素降解酶酶活可达到67.44U。
通过对其16srRNA测序鉴定，该菌与氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)有99％的同源性。
纤维素降解菌的选育可为高效生产纤维素酶提供新的菌种来源。
关键词纤维素降解茵；筛选；鉴定；酶活纤维素是自然界中储存量最大、分布最广泛的可再生天然碳水化合物，其主要存在于秸秆、木材等高等植物的细胞壁中，每年通过光合作用可生产纤维素逾10亿t。
然而纤维素难以降解，导致其利用具有一定的局限性。
目前，降解纤维素最有效、最经济的方法是生物降解法，即通过细菌、放线菌以及真菌等生物产生的纤维素酶来催化降解纤维素。
因此，寻找和驯化产生高效纤维素酶的微生物是有效降解纤维素的前提条件。
该研究从土壤中筛选降解纤维素的菌株，并对其产酶条件进行研究，以为纤维素的降解和合理利用提供一定的资源。
1材料与方法1.1试验材料1.1.1样品来源。
样品取自重庆市缙云山落叶覆盖的腐殖层土壤。
1.1.2培养基。
LB培养基、刚果红培养基、羧甲基纤维素培养基。
1.2试验方法1.2.1纤维素降解菌的初筛和纯化。
纤维素降解菌的初筛和纯化按照卢月霞等的方法进行。
1.2.2纤维素降解菌的复筛。
分别将纯化后的单菌落点样于刚果红培养基中，每个平板点1个菌种，且只点3个样，降解圈直径(D)与菌落直径(d)比值的大小可以直接反应纤维素酶活的相对大小。
因此，筛选降解圈直径与菌落直径比值最大的菌落，即为纤维素高效降解菌，用CMC培养基作斜面培养，4℃保存。
1.2.316srRNA测序。
使用小量细菌基因组DNA抽提试剂盒对纤维素降解菌进行基因DNA提取，以此为模板，以通用引物8F和1495R进行PCR扩增16srRNA。
大庆师范学院本科生学业论文纤维素分解菌的筛选与研究院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学分子生物学学生姓名何俊辉学号201001122579指导教师姓名徐晶雪曲丽娜指导教师职称助理实验师2012年12月24日摘要目前，全球能源和环境向人类提出挑战之时，开发利用可再生性资源已成为人类发展中的紧迫课题。
纤维素是自然界中存在的最廉价、最丰富的天然可再生资源,存在许多高能氢键。
对纤维素分解菌的研究无疑是获得能源的另一种途径。
本实验通过对土样中菌株的筛选，分离出具有一定纤维素酶活力的微生物。
在此过程中对纤维素分解菌进行研究。
通过分子生物学的技术手段提取产纤维素酶的基因进行PCR扩增、DNA转化，把目的基因整合到受体菌株上，从而得到能分解纤维素的重组型菌种。
关键词：纤维素分解菌；分离筛选；重组菌株AbstractAt present, the global energy and environmental challenge to human, the development and utilization of renewability resource has become the urgent task of human development. Cellulose is the most cheap and abundant natural renewable resources in nature. It has many high energy hydrogen bond. To research cellulose decomposition microbes is undoubtedly another way to get energy. The experiment based on the soil samples were selected and isolate certain cellulose enzyme activity of microbes. In the process of cellulose decomposition microbes were studied. Through the molecular biology technology extraction yield of cellulose enzyme gene PCR amplification, DNA transformation, Integrating the purpose gene into the receptor strain, which can get restructuring cellulolytic strains.Key words：Cellulose decomposition microbes; Separation screening; Recombinant strains.目录摘要 (I)Abstract (I)目录 (II)引言 (1)1 材料与实验方法 (2)1.1实验材料与器材 (2)1.1.1实验样品 (2)1.1.2实验试剂 (2)1.1.3实验仪器 (3)1.2研究方法 (4)1.2.1培养基的配制 (4)1.2.2样品的采集 (5)1.2.3菌株的分离与筛选 (5)1.2.4 形态学鉴定 (5)1.2.5 微生物大小的测定 (6)1.2.6 菌种纯化 (6)1.2.7环境因素对微生物的影响 (7)1.2.8 基因组DNA提取 (7)1.2.9琼脂糖凝胶电泳 (7)1.2.10 PCR扩增 (8)1.2.11 从凝胶中分离回收DNA的方法 (8)1.2.12重组子的构建、转化与筛选 (9)1.2.13重组型纤维素分解菌株的验证 (10)2 实验结果 (10)4讨论 (11)5结论 (12)[参考文献] (13)引言纤维素是自然界中存在的最廉价、最丰富的天然可再生资源,存在许多高能氢键, 因此其水解、利用较困难,利用微生物分解纤维素能够节省资源又减少对环境造成的污染。
文章编号：2096-0387 (2018) 04-0037-04第4卷第4期 生物化工Vol .4 No .42018 年 8 月Biological Chemical EngineeringAug . 2018不同湿地土壤中真菌群落分析以及纤维素降解菌的筛选夏俊(江西省科学院应用化学研究所，江西南昌330096)摘要：目的：了解湿地不同植被覆盖土壤真菌群落特征的变化并从中获得高效的纤维素降解菌。
方法：采集三个不同植 被样地中的土样，利用高通量测序方法测定并通过生物信息学分析土壤真菌群落结构，以纤维素为唯一碳源筛选纤维素降解菌 并通过ITS 测序进行菌种鉴定。
结果:在土壤中共发现6个真菌门和15个优势真菌属，筛选得到的6株产酶能力较强的纤维素 降解真菌，分别为木霉（Trichoderma sp _ )、青霉（Penicillium sp .)、棘抱曲霉（Aspergillus aciileatLis )、尖抱镰刀霉（Fusariumsp .)、黑曲霉（Asperglllusnlger )和米曲霉（Aspergi 'lluoryzae )。
结论：不同采样点的土壤菌群差异较大，与植被类型、土壤 pH 、湿度等条件有关，所得降解菌的纤维素降解能力也有很大差异。
关键词：菌群结构；纤维素降解菌；筛选中图分类号：Q939.9文献标志码：AAnalysis of Fungal Community Structure and Screening of Cellulose Degrading Fungi inDifferent Wetland SoilsXia Jun(Institute of Applied Chemistry , Jiangxi Academy of Sciences , Jiangxi Nanchang 330096)Abstract ： Objective : To understand the changes of fungal community structure in different vegetation coverage of wetlands , and obtain efficient cellulose degradation fungi from them . Methods : Soil samples from three different vegetation plots were collected and the fungal community structure was determined by high throughput sequencing and bioinformatics technology . Results : Six fungal divisions and 15 genera were identified in soil . Six strains of cellulolytic fungi were screened from the soil samples , which were Trichoderma sp ., Penicillium sp ., Aspergillus aculeatus , Fusarium sp ., Aspergillusniger and Aspergilluoryzae . Conclusion : Thesoil fungi communitiesamong different sampling sites are varied , which are related to vegetation types , soil pH and humidity . The cellulose degradation ability of degrading fungi is also very different .Key words ： Community structure ; Cellulolytic fungi ; Screening纤维素是地球上最丰富、来源最广泛的碳水化 合物，也是最大的可再生资源，占地球生物量的近 50%[1]。
纤维素、半纤维素和木质纤维素的致密结构 形成的保护层造成纤维素不易降解，而难以作为碳 源被直接转化利用[2]。
目前，以纤维素、半纤维素和 木质素形式存在的可再生性木质纤维素资源的再生转化，通过微生物降解转化为可利用性还原糖并用 以生产生物乙醇、生物柴油等可再生能源正成为世 界产业发展的一个重要趋势[3]。
目前发现的具有木 质纤维素降解能力的微生物种类十分广泛，但相关 研究多集中于真菌，如里氏木霉、白腐真菌、黑曲霉 等[4_6]。
但大部分用于纤维素酶生产的菌株存在酶作者简介:夏俊（1983—），江西南昌人，本科，工程师。
• 38 •生物化工2018 年活力较低的问题。
本项目采集来自于湿地公园树木聚集区的表层土壤，提取土壤原样基因组，通过IUumina高通量测序方法对各样品基因组中的ITS (真菌)进行测定，然后对样品中的真菌的种类以及所占比例进行分析和比较，得出各样品中真菌的组成成分，同时从土壤中筛选分离能高效降解纤维素的真菌。
1材料与方法1.1样品及培养基样品采集:在南昌湿地公园选取三处树木茂密的区域SY1、SY2、SY3,除去表面腐殖层在土层5 ~ 10cm深度取样，土样过筛去除根及石块，存储于-80丈冰箱中待用。
Mandel 营养液：NaN032 g，K2HP04 1.5 g，CaCl2 1.5 g,MgS04 0.3 g,FeS04 • 7H20 0.005 g, MnS04 •H200.001 6g,ZnS04 •H200.001 4 g,CoCl2 0.0005 g,H20100 mL,pH5.5 〇羧甲基纤维素（CMC)平板培养基：Mandel营养液，2%羧甲基纤维素，0.08%的脱氧胆酸钠，1.5%的琼脂。
纤维素滤纸液体培养基：Mandel营养液，lc m X 6c m的滤纸条一张。
PD A培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 ~ 20 g,H201000 mL,115X1高压灭菌 30 min。
1.2基因组DNA提取及测序使用土壤基因组提取试剂盒（上海生工）按说明提取土壤基因组DNA，提取的DNA溶液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
1.3测序结果分析将测序初始序列去除接头、barcode和即引物序列，再去除低质量序列后得到的优质序列用于后续分析研究。
用mothur对所得序列进行分析，以97%相似性为标准划分操作分类单元（0TU)并进行多样性指数分析计算：群落丰度的指数Chao 和A ce;群落多样性的指数Shannon指数和Simpson 指数;测序深度指数Coverage。
在0T U聚类结果的基础上，获取每一个0T U聚类中的代表性序列与RDP classifier数据库（http://rdp_cme_/misc/resources.jsp)中的已知数据进行比对，得到各0TU 代表序列的分类学信息，并在门纲目科属种水平统计各个样品的群落组成。
1.4纤维素降解菌的筛选1.4.1初筛称取土样10 g，加人90 m L无菌水，振荡充分混合后制成1〇_3、10"4、1〇_5、10'1〇_7、1〇_8和 1〇_9稀释度的土壤溶液。
吸取200p L稀释溶液涂布于羧甲基纤维素平板培养基中，培养4天后上挑取长势明显的丝状真菌菌落接种于羧甲基纤维素平板培养基上，30丈静置培养3 ~ 4天，待菌丝长出后，再次接种于新的羧甲基纤维素培养基，直至获得纯菌株。
1.4.2刚果红染色加人10 m L染色液于培养基中，浸染30 min;染色结束后用1m〇I/L氯化钠溶液和蒸馏水洗交替脱相，洗去残留菌丝，再用氯化钠反复洗脱至洗液透明；观察菌落大小，测透明圈直径，并计算透明圈直径与菌落直径之比（H C)。
1.4.3复筛将初筛获得的菌株按10%的接种量分别接种于液体CMC培养基中，30 ^、150 r/m in培养7天后测其羧甲基纤维素酶活。
1.5菌种鉴定利用通用引物r r s i/r r s4对筛选所得菌种的保守序列进行P C R扩增，P C R引序列为r r s i (5’-T C C G T A G G G A A C C TG C G G-3’），IT S4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')ra。
PCR 反应体系为25 |jl L，反应条件为：94 T5min; 94 T3〇S，55 T；30 s,72 T；50 s;循环 30 次；72 T； 10 min。
PCR 扩增产物测序获得DNA序列后，经NCBI数据库Blast 分析鉴定所得纤维素酶真菌。
2结果与分析2.1 土壤中真菌群落结构2.1.1测序数据统计学分析利用IUumina测序方法，经优化后得到各样地土壤样品中微生物18S rDNA基因序列118 083条，平均长度为439 bp。
样品物种稀释性曲线如图1所示，土壤样品的稀释曲线已处在平稳期，因此本次测序能第4期夏俊：不同湿地土壤中真菌群落分析以及纤维素降解菌的筛选• 39 •代表土壤中真菌的真实情况。
2.1.2 土壤真菌群落结构分析土壤真菌群落多样性分析见表1，各样本的Coverage都大于0.999,表明取样深度都比较合适。
3个样本的Shannon指数平均值由高到低依次为SY2 >SY1 >SY3, Simpson指数平均值由低到高依次SY2<SY1<SY3。
由此可见，样本SY2的真菌多 样性较为丰富。
表1土壤真菌群落多样性分析样品Ace Chao Coverage Shannon Simpson SY1211.149 3209.50.999 853 3.992 7880.049 759 SY2232.361231.428 60.999 886 4.163 0430.030 445 SY3204.863 9203.750.999 734 3.637 380.065 518三个样本中共有6个真菌门（图2)。
其中 子囊菌门（Ascomycota)相对丰度最大，在各样品中均占75%以上，且SY1和SY3中的相对丰度大于SY2。
其次是担子菌（Basidiomycota)和接合菌(Zygomycota)，SY3的担子菌丰度大于SY1和 SY2,而接合菌丰度小于另外两者。
90]80-60 =50-卅40-30-■S Y1 0S Y2 □S Y3子囊菌担子菌接合菌壶菌其他鞭毛菌半知菌图2各土样中真菌门相对丰度三个真菌群落中相对丰度大于1%的优势真菌属 共有I5个(图3 )。
