土壤中纤维素分解菌的分离..

环境微生物技术实验总结报告一、国内外研究进展：①纤维素资源据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.8×1011 t，这些植物物质所含的能量相当于全球人类每年能量消耗量的20倍，食物中所含能量的200倍。

纤维素是构成植物细胞的基本成分，纤维素占全球植物总干重的30%一50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，它存在于所有植物当中。

在生物界中，结合于有机体中的碳达27×1010t，在自然界有机体中构成纤维素的碳约占40%，据此估算，在植物界中纤维素的总量约达26.0×1010t，而且自然界中的植物原料是年复一年地不断生长和更新的，可以说，纤维素在自然界中是一种最丰富的可再生的有机资源。

纤维素是一种不能被大多数动植物直接利用的多糖物质。

但对人类来说只要能将其降解成小分子物质，纤维素就会成为一种有广阔应用前景的资源。

而且这种潜在的资源数量是惊人的，其中的大多数作为绿色植物的成分在维持生态平衡中起作用而不宜利用，但是仍有数量可观的纤维素由人类生活和生产产生，它们主要存在于农作物秸秆和城市垃圾之类的废弃物中。

灾荒或战乱造成的粮食危机依然是正存在的和潜在的威胁;随着全球经济的飞速发展，地球上石油、煤炭的储量正以惊人的速度减少，能源危机成了世界大多数国家所面临的一个严峻问题;由于对资源的破坏性开采和利用，人类赖以生存的环境正在不断地恶化，对可再生资源利用的研究与开发的可持续发展战略己在世界各国逐步展开。

如何处理和利用废弃纤维素将成为一个十分紧要的问题。

②农业废弃物资源的利用现状植物纤维素资源的开发利用对解决粮食和能源短缺以及环境污染问题有极其深远的意义。

我国的纤维素资源极为丰富，每年的农作物秸秆产量达5.7x107吨，约相当于北方草原年打草量的50倍。

但是，农作物秸秆产生数量多且产生时间集中(每年到收获季节农村就会有大量的秸秆产生)，而我国的农作物秸秆主要用于燃料、畜禽饲料与自然堆肥，不仅利用效率低，而且随着农村生活水平的提高，农作物秸秆成为农村固体废弃物的主要来源。

课题3 分解纤维素的微生物的分离课题背景纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。

植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。

地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。

对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。

而要研究这些微生物，首先要将它们从土壤中种类众多的微生物中分离出来。

在本课题中，我们将探讨如何分离土壤中能够分解纤维素的微生物。

基础知识（一）纤维素与纤维素酶棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物（图2-11），此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。

许多商品纤维素都是由天然纤维素制得的，如水溶性的羧甲基纤维素钠（ CMC-Na ）、不溶于水的微晶纤维素（Avicel ）等。

纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。

正是在这三种酶的协同作用下，纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养，同样，也可以为人类所利用。

下面我们通过一个小实验来体会纤维素酶的作用。

在2支20 mL的试管中，分别放入1 cm×6 cm的滤纸条，再分别加入pH为4.8、物质的量浓度为0.1 mol/L的醋酸—醋酸钠缓冲液10 mL、11mL。

在加入10 mL缓冲液的试管中加入 1 mL纤维素酶（70~80 U/mL ）。

将2支试管固定在50 mL的锥形瓶中，在摇床上以140 r/min的转速振荡反应1h，观察结果。

你也可以用报纸、复印纸做这个实验。

如果没有摇床，你可以采用定时人工振荡的方法。

时间足够长时，你会观察到滤纸被完全分解（图2-12）。

1U表示1个酶活力单位，是指在温度为25℃，其他反应条件，如pH等，均为最适的情况下，在1 min内转化1 mmol的底物所需的酶量。

实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。

二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。

这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。

在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要： 1. 内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC 酶、EG。

这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素； 2. 外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子； 3. Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。

随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。

只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。

就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。

本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。

以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种；刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。

高二生物下册实验：分解纤维素的微生物的别离高二生物下册实验：分解纤维素的微生物的别离(1)实验原理：①土壤中存在着大量纤维素分解酶 ,包括真菌、细菌和放线菌等 ,它们可以产生纤维素酶。

纤维素酶是一种复合酶 ,可以把纤维素分解为纤维二糖 ,进一步分解为葡萄糖使微生物加以利用 ,故在用纤维素作为唯一碳源的培养基中 ,纤维素分解菌能够很好地生长 ,其他微生物那么不能生长。

②在培养基中参加刚果红 ,可与培养基中的纤维素形成红色复合物 ,当纤维素被分解后 ,红色复合物不能形成 ,培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈 ,从而可筛选纤维素分解菌。

(2)实验过程：土壤取样：采集土样时 ,应选择富含纤维素的环境梯度稀释：用选择培养基培养 ,以增加纤维素分解菌的浓度涂布平板：将样品涂布于含刚果红的鉴别纤维素分解菌的固体培养基上挑选产生中心透明圈的菌落：产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈,考试技巧 ,从产生明显的透明圈的菌落上挑取局部细菌 ,并接种到纤维素分解菌的选择培养基上 ,在30～37℃条件下培养 ,可获得较纯的菌种。

刚果红染色的两种方法的比拟：先培养微生物 ,在参加刚果红在到平板时参加刚果红优点显示出的眼神反映根本上是纤维素分解菌的作用操作简便 ,不存在菌落混杂问题缺点操作繁琐 ,参加刚果红溶液会使菌落之间发生混杂(1)由于琼脂和土豆汁中都含有淀粉类物质 ,可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反响(2)有些微生物具有降解色素的能力 ,长时间培养会降解刚果红 ,从而形成明显的透明圈 ,这些微生物与纤维素分解菌不易区分知识拓展：1.纤维素与纤维素酶(1)纤维素①化学本质：一种多糖。

②分布：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物 ,此外 ,木材、作物秸秆等也富含纤维素。

(2)纤维素酶①习惯上 ,将纤维素酶分成三类：C1酶、Cx酶和葡糖苷酶。

C1酶是对纤维素最初起作用的酶 ,破坏纤维素链的结晶结构。

Cx酶是作用于经C1酶活化的纤维素、分解-1 ,4-糖苷键的纤维素酶。

纤维素分解菌的分离与筛选廖咏梅;王佳婧【摘要】以纤维索粉或滤纸条为唯一碳源,从海南土样中初筛出能够分解纤维素的菌株共6株,采用滤纸条液体培养基,纤维素固体培养基,刚果红鉴别培养基进行复筛,获取滤纸条断裂较明显,透明圈较大,红色水解圈较大的菌株2株,编号为Q-4,Q-6.通过对不同时间Q-4,Q-6 FPA酶活力的测定,确定48 h为其最佳发酵时间,而对不同接种量Q-4,Q-6 FPA酶活力的测定,确定两株菌的最佳接种量为5％.【期刊名称】《西华师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(034)003【总页数】5页(P241-245)【关键词】滤纸酶活力;纤维素降解菌;筛选【作者】廖咏梅;王佳婧【作者单位】西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009【正文语种】中文【中图分类】Q939.9纤维素(如蔗渣、稻草、麦杆等)是地球上最丰富的可更新的资源之一，占地球总生物量的40%，是目前分布最广而又未得到充分利用的天然碳水化合物．纤维素的降解主要有酸水解法[1]，高压蒸汽处理法，焚烧法，和生物法等．前3种方法能耗高，易造成二次污染．而生物法的核心是将纤维废弃物经微生物转化为简单糖类或蛋白质等产品，具有无污染，能耗低等优点，这样既可解决环境污染，又可作为饲料，缓解粮食危机．所以对纤维素酶的研究显得尤其重要．纤维素微生物的研究始于1912年， 20世纪50年代以前主要是研究防止微生物对天然纤维的破坏作用；60到70年代主要研究利用纤维素资源生产单细胞蛋白;70年代以后，研究的重点又逐步转移到开辟新能源和防止环境污染上来．近二、三十年来，研究领域又在纤维素酶菌株的选育、纤维素酶组分及降解机制、纤维素酶合成的调节和控制以及纤维素酶应用等方面取得较大进展．纤维素的基本构造是由微纤维组成，而微纤维又由原纤维所组成．原纤维含有15-40个以结晶性或非结晶性组成的纤维素分子．而纤维素分子是由许多吡喃型的D-葡萄糖残基以1，4-β-糖苷键，相联结而成的多糖链，在纤维素链之间存在氢键．纤维素不溶于水，其基本结构单位是纤维二糖．纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它往往不是单种酶，而是三种功能不同的酶组成，这三种酶是:(1)C1酶，即β-1，4葡聚糖外切酶；(2) Cx酶，即β-1，4-葡聚糖内切酶;(3)β-葡萄糖苷糖酶，也称纤维二糖酶．Wood提出三类酶在发挥作用时表现出协同作用，单独作用则效果极差．其作用如图1所示. 纤维素酶的来源很广泛，真菌、细菌、放线菌等在一定条件下均能产生纤维素酶．但纤维素酶的比活力一般都很低，因而产酶成本高．据估计，纤维素水解成葡萄糖所需的酶蛋白要比淀粉相应水解所需的酶蛋白多100倍．这是影响纤维素酶广泛应用的重要原因之一．因而，筛选纤维素酶比活力高的菌株具有重要的意义．1 材料与方法1.1 样品来源海南土样1.2 培养基1.2.1 滤纸条液体培养基KH2PO4 0.5g ，KNO3 1.0g ，MgSO4．7H2O 0.5g ， NaCl 0.5g，，蒸馏水1 000mL，pH 7.2 ，配好液体培养基后，分装入试管中，每个试管约5mL，然后在每个试管中分别加入处理后的滤纸条(长5cm，宽0.8cm)，即为滤纸条液体培养基．滤纸条处理：用1% 醋酸浸泡滤纸24h，用碘液检查确无淀粉后，再用2% 苏打水冲洗至中性，晾干或烘干备用．1.2.2 纤维素固体培养基：NaCl 0.1 g ，NaNO3 2.5 g，MgSO4．7H2O 0.3g，纤维素粉 3g，FeCl30.01g，蒸馏水 1 000mL，琼脂 18 g， pH 7.2 左右．纤维素粉的制备：取脱脂棉20g撕碎揉成团装入1 000 mL三角瓶中，用500 mL 25%浓硫酸浸泡1-2d，并加入小玻璃珠数粒，有利于棉花的打碎，浸泡到脱脂棉没有韧性为止，用蒸馏水洗至中性为止，在恒温烘箱里(50℃左右)烘干，用研磨棒研成粉末备用．1.2.3 刚果红鉴别培养基(NH4)2SO4 2g，MgSO4 0.5g ，KH2PO4 1g，NaCl 0.5g，纤维素粉 20g，刚果红 0.2g，蒸馏水 1 000 mL，琼脂 20g，pH7.0左右[2]．因为纤维素是由葡萄糖残基以β-1，4-糖苷键连接而成的现状大分子，纤维素水解酶能够水解此糖苷键使其变成纤维二糖和葡萄糖，水解后的糖类同刚果红染料可形成红色沉淀，颜色浓郁、厚重，所以此水解圈在菌落生长过程中便逐渐清晰可见，不易发生错误识别[3]．1.2.4 种子培养基蛋白胨10g ，酵母粉5g ，NaCl 5.0g ，葡萄糖 10g ，牛肉膏 5g ，pH 7.2 ，蒸馏水 1 000 mL ．1.2.5 液体发酵培养基(NH4)2SO4 2g，KH2PO4 4g，酵母膏0.5g，CaCl2.2H2O 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，纤维素粉10g，蛋白胨3g.，蒸馏水 1 000mL ，pH7.2．1.3 菌株纯化与菌落形态观察取适量的土样放入250 mL的三角瓶中，加入适量的无菌水和玻璃珠，振荡使土样均匀分散，然后采用梯度稀释的方法对样品进行稀释，再采用涂布或划线的方法进行样品的初筛，培养约48h后，挑取培养皿中不同菌落形态的菌株于刚果红鉴别培养基中，不断重复此过程直到分离出纯化的菌株为止，观察菌株的生长情况．分离纯化得到的菌株分别挑单菌落于滤纸条液体培养基、纤维素固体培养基、刚果红鉴别培养基进行复筛，选出滤纸条断裂较快，透明圈大，红色沉淀圈大的为实验对象．1.4 DNS法测定纤维素酶的活力1.4.1 纤维素酶测定原理纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物(3-氨基-5-硝基水杨酸)，在一定的范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈正比，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力．1.4.2 3，5-二硝基水杨酸显色剂(DNS显色剂)的制备称取2.5g 3，5-二硝基水杨酸溶于蒸馏水中，加入5g氢氧化钠、40g酒石酸钾钠和125mL水，加热溶解后再加入重蒸酚0.5g、无水亚硫酸钠0.125g，待全部溶解后冷却，定容至250mL，贮于棕色瓶中，放置一周后使用，用之前过滤．1.4.3 葡萄糖标准曲线的绘制用蒸馏水溶解100.0mg经干燥至恒重葡萄糖，定容到100 mL，取5支50 mL的比色管，按表1量取试剂:加入以上试剂后，在沸水中煮沸显色15 min．冷却至室温，加蒸馏水21mL，摇匀，以1mL蒸馏水代替糖作空白管．在550 nm处比色，以光密度为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，绘出葡萄糖标准曲线[4]，如图2.表1 葡萄糖标准液的制备Tab．1 Preparation of glucose standard solution试管号葡萄糖/mL 蒸馏水/mL DNS/mL0 0 1 31 0.2 0.8 32 0.4 0.6 33 0.6 0.4 34 0.8 0.2 35 1 0 31.4.4 滤纸酶(Filter Paper Activity，FPA)活力的测定在25mL试管中加入1.0mL经适当稀释的酶液如果酶活较低可不用稀释，放入一条1cm×6cm新华一号滤纸，于38℃恒温箱中保温60min，取出后加入3mL DNS指示剂，放入沸水浴中煮15min使酶失活，冷却至室温后加蒸馏水定容至25mL，摇匀于550nm下比色，测OD值，空白样的制作是在25mL的试管中加入1.0mL经适当稀释的酶液如果酶活较低可不用稀释与前面的样要保持一致，放入一条1cm×6cm新华一号滤纸后迅速加入3mLDNS指示剂并放入沸水浴中煮15min是酶失活，冷却至室温后加蒸馏水定容至25mL，摇匀．1.4.5 酶活力的计算公式为(1)其中：X为酶单位，单位IU/mL；W为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度；N为酶液稀释总倍数；T为反应时间；M为样品体积 [5]．1.4.6 粗酶液的制备分别挑取降解效果较好的菌株于种子培养基中，培养1-2d后按5%的接种量分别接于80 mL的发酵培养基中，培养适当时间的发酵液在3 000r/ min，4℃离心15 min，上清液即为用于测定的粗酶液．2 结果与分析2.1 纤维素分解菌的筛选根据菌株在以纤维素为唯一碳源的刚果红培养基上的生长和红色沉淀圈情况进行初步筛选，筛选出6株降解效果较好的菌株，编号分别为Q-1，Q-2，Q-3，Q-4，Q-5，Q-6分别接入斜面培养基保存备用．2.2 复筛观察各菌株的透明圈大小和滤纸条的断裂程度表2 各培养基中菌株的生长情况Tab.2 Strains’growth situation on different cultures培养基Q-1Q-2Q-3Q-4Q-5Q-6滤纸培养基(分解度) + + + +++++++纤维素固体培养基(透明圈直径)1mm1.5mm0.6mm1.8mm0.5mm2.3mm刚果红鉴别培 (红色沉淀圈直径)0.8mm1.4mm1.0mm1.5mm0.1mm2.5mm(+)滤纸边缘膨胀; (++)滤纸整齐膨胀并下弯; (+++)滤纸不定形;断裂； (++++)全成糊状．由表可知，Q-6菌株对滤纸的分解能力在六株菌中的最强；其次为Q-4和Q-5．在纤维素固体培养基中Q-6菌株的透明圈最大，其次为Q-4．在刚果红鉴别培养基中，Q-6菌株的透明圈最大，其次为Q-4．所以我们选用Q-4、Q-6为我们研究的对象．2.3 菌株菌落形态观察Q 4，Q 6菌株菌落形态观察结果如表3所示．表3 Q 4，Q 6纤维素分解菌的菌落形态Tab.3 Colonial morphology of cellulose-decomposing microorganisms比较内容Q-4Q-6菌落颜色表面白色表面绿色(培养初期为白色致密菌丝)菌落大小较大较大菌落质地,气味干燥干燥,有强烈的土腥味2.4 不同时间酶活力测定的结果在250 mL的三角瓶中装入80mL发酵培养基，按5%接种量于37℃，150 r/min 摇床上培养，在不同培养时间取样，测定发酵液的酶活力，结果如下如图3 所示，菌Q-4的滤纸酶活开始时基本上一直处于上升趋势，在第2d和第4d酶的活力出现两个峰值，在第4d达到最高峰为21.43IU/mL，此后酶活开始下降．为此选用出现第一个峰值时的时间作为测定酶活的时间．Q-6的滤纸酶活在开始时也基本上处于上升趋势，在第2d时酶活达到最高峰为22.67IU/mL，此后酶活趋于稳定．2.5 不同的接种量对菌株产酶的影响在80 mL的发酵培养基中，分别加入培养48h(48h为Q-4菌株酶活的第一高峰时间)的Q-4种子培养液，按照接种量2%，5%，10%，15%，20%接种，摇床发酵在48h后测滤纸酶活．同样在80mL的发酵培养基中，分别加入培养36h的Q-6种子培养液，按照接种量2%，5%，10%，15%，20%接种，摇床发酵在36h后测滤纸酶活．结果见图4.根据实验数据可以看出Q-4在接种量为5%时的酶活稳步增高此后在平稳中开始略有降低．Q-6在接种量为0%-15%时的酶活基本稳步增高，在接种量为15%时最高，此后开始降低．综上，纤维素是地球上最丰富而可再生的生物聚合物，经初步统计，已发现的具有降解纤维素能力的微生物有近200种．本实验筛选获得的两株菌Q-4，Q-6其FPA酶活最高分别达到20.31U，22.67U，具有较高的酶活力．通过对不同时间Q-4，Q-6 FPA酶活力的测定可以看出，Q-4培养第2d和第4d酶活都达到一个峰值，从经济效益，发酵效率来看，确定48h为其最佳发酵时间，Q-6培养第2d 酶活达到最高，所以可以确定48h为Q-4，Q-6的最佳发酵时间．通过对不同接种量Q-4，Q-6 FPA酶活力的测定可以看出，接种量为5%时FPA酶活都较高，虽然Q-6的FPA酶活在接种量为15%是达到最高，但在此之前增长都不太明显，所以从经济效益等方面来看，两株菌的最佳接种量定为5%．参考文献：[1] FAN L.T.ET A L．Cellulose Hydrolysis.New York: Spring-verlag，1987:121-147[2] 陈敏．一种改进的纤维素分解菌鉴别培养基.[J] 杭州师范学院学报(自然科学版)，2001，18(5):[3] 叶姜瑜．一株纤维素分解菌鉴别培养基．[J] 微生物学通报，1997，24(4)[4] 中山大学生物系生物化学微生物学教研室编[M].生物化学技术导论.北京：人民教育出版社，1981：24-25[5] 齐云.一株能分解纤维素的高温耐碱放线菌[J].应用与环境生物学报.2003.9(3)。