牛血清在细胞培养中的作用及产生的常见问题

1.血清中可能出现的沉淀物是什么？基于多年的实验研究，用于细胞培养的胎牛血清以及其它血清中可能会存在以下种类的沉淀物：：（1）纤维蛋白，它是经常出现的较大的沉淀物，可以达到1-2mm，可以用肉眼观察到。

因为血清都是在低温下进行收集和快速处理的，一些纤维蛋白原（可溶性的形成絮状纤维蛋白的前体）在处理过程中仍然处于溶解状态，当经过最后的过滤分装后，就会在瓶中凝结出现纤维蛋白沉淀。

（2）磷酸钙，它也是常见的一种沉淀物，通常会使血清出现浑浊，并且在37℃培养的时候会增加。

这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。

（3）胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质。

他们也是血清中出现沉淀物的常见原因。

2.血清中的沉淀物对细胞培养有什么影响？（1）细胞生长，我们的试验以及经验表明沉淀物不会影响细胞培养，我们的客户以及其它血清生产商也证明了这一点。

（2）过滤，如果血清中出现大量的沉淀物，血清将很难过滤。

一般说来，因为在血清生产时最后已经经过100nm或者40nm的过滤处理，并且经过了严格的无菌检测，因此不推荐再过滤用于细胞培养的血清。

在实验室中没有必要再过滤处理血清，在大规模的细胞培养中往往将血清直接加到培养基中一起过滤。

（3）污染，磷酸钙往往被误认为微生物污染而引起争端。

研究者可能会在血清中观察到一些絮状的沉淀，因此就会比较警觉的去做无菌试验，将血清放在培养箱中培养几天，结果可能会观察到更多的絮状沉淀，因此就断定血清被污染了。

并且当研究者将血清样品放在倒置显微镜下观察时往往可以看到一些可以运动的小黑点，因此就更加确认是血清被污染了。

于是，研究者就会花费更多的时间和精力来和生产商确认，但最终确定血清没有被污染而只是沉淀。

为了避免这些问题的发生，我们建议不要直接将血清放在培养箱中培养观察是否有菌，而是将血清加到琼脂板上进行培养以观察是否有细菌生长。

另外，也可以进行革兰氏染色，在油镜下观察，以确认是否有污染。

1、谷氨酰胺在培养基中的主要作用是什么？配液是应注意哪些问题？答：所有细胞都需要谷胺酰胺，其特殊的作用：（1）、可促进各种氨基酸进入细胞膜；（2）、所含的氨是核酸中嘌呤和嘧啶的来源；（3）、是合成ATP、ADP、AMP 时所需物质;（4）、是能源和碳源的来源。

配液时应注意：谷胺酰胺在溶液中不稳定，应放置在－20℃冰箱保存，用前加入培养液内。

已含有谷胺酰胺的培养液在4℃冰箱内放置，两周以上时重新加入原来量的谷胺酰胺。

2、胎牛血清在细胞培养中起什么作用？答：（1）.补充培养液中没有或量不足的营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必需的物质；（2）.提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇、激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。

生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等；（3）. 提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。

结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。

（4）. 含有生长基质成分使细胞易贴附在培养器皿上，例如纤粘连蛋白(fibronectin，FN)。

（5）. 对培养中的细胞起到某些保护作用：①、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。

②、有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分（蛋白酶抑制剂），起到中和作用。

③、血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。

④、血清还含有一些微量元素和离子等中和毒性物质，保护细胞不受伤害，他们在代谢解毒中起重要作用，3、完全培养基中各成分在细胞培养中的作用分别是什么？答：（1）、水：水是一种良好的溶媒，一切营养物质只有溶于水才易被细胞吸收，代谢产物也许溶于水才能排泄，生化反应也必须再溶解状态下才能很好的起作用。

水的比热高、潜热大，对调节温度起着很大作用。

细胞培养常见问题的原因及对策细胞培养中的注意事项1 冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。

另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。

2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。

每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。

4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。

血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。

来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。

CS (calf serum) 则是指小牛血清。

HS (horseserum) 则是指马血清。

6 培养细胞时应使用5 %或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。

当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。

7 何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。

第24卷总第50期 西北民族大学学报(自然科学版)Vol.24,No.3 2003年9月 Journal of N orthw est U niversity for N ationalities(Natural Science)Sept,2003动物血清在细胞培养中的重要性及其质量控制标准马忠仁,冯玉萍,李　倬,乔自林,侯兰新,李明生,冯若飞(西北民族大学动物科学系,甘肃兰州730030)[摘　要]在动物细胞培养中,新生牛血清的应用最为广泛,所以新生牛血清是生物技术产品中重要的原辅材料之一,做好新生牛血清的质量控制是促进生物制品质量提高的重要环节1[关键词]动物血清;细胞培养;质量控制[中图分类号]Q7 [文献标识码]A [文章编号]1009-2102(2003)03-0056-03随着细胞培养技术的发展和医学科学研究水平的不断提高,对细胞培养过程中培养基的质量要求越来越高1目前培养基中主要成分动物血清的质量起着重要的作用1供组织培养、细胞培养和诊断试剂等用的动物血清主要是新生牛血清,此外,按不同研究及使用目的,还包括胎牛血清、小牛血清、成牛血清、马血清、羊血清、鸡血清、兔血清及小白鼠等实验动物血清1在动物细胞培养中,新生牛血清的应用最为广泛,所以新生牛血清是生物技术产品中重要的原辅材料之一,做好新生牛血清的质量控制是促进生物制品质量提高的重要环节11　新生牛血清在细胞培养中的主要功能 新生牛血清指采自出生24h以内、未吃初乳的健康牛犊之血清1它是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成分,具有极为重要的生理功能11)提供维持细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或量很少的营养物,以及主要的低分子营养物等12)提供结合蛋白,能识别维生素、脂类、金属和其他激素等,能结合或调整改变它们所结合的物质活力13)有些情况下其结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合,起到解毒作用14)新生牛血清是细胞贴壁、铺展在塑料、玻璃等培养基质上所需因子的来源15)构成缓冲系统,调节酸碱平衡16)提供蛋白酶抑制剂,在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活,保护细胞不受伤害12　新生牛血清的主要成分 动物血清是一种复杂的混合物,含有丰富的蛋白质、多肽、氨基酸、葡萄糖、脂肪酸及激素类物质,其[收稿日期]2003-05-17[作者简介]马忠仁(1962—),男(回族),甘肃临夏人,助理研究员,中美合资兰州民海生物有限公司总经理,从事动物科学和生物工程的研究和开发工作1——65组成成分及含量常随供血动物的性别、年龄、生理状况和营养条件不同而异1虽大部分已为人类所知,但还有一部分尚不清楚,且作用机制也有待进一步研究1就目前所知: 1)蛋白质是牛血清中的主要成分1除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身激素类蛋白质外,主要还有白蛋白与球蛋白,白蛋白可与维生素、脂类和激素结合,并将其带入细胞;纤维粘连素可促进细胞附着;α2巨球蛋白具有抑制胰蛋白酶的作用;胎牛血清中含有的胎球蛋白能促进细胞附着;转铁蛋白能结合铁离子,减少其毒性和被细胞利用,转铁蛋白还具有抗氧化、抗肿瘤等各种生物功能12)多肽类细胞因子虽然含量少,但在细胞生长增殖和调控上起着重要作用1如血小板促生长因子能促细胞分裂,是多肽家族的主要成员之一,是主要的促细胞增殖因子;此外成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等,对细胞生长增殖和调控起着重要作用13)血清中所含的激素对细胞的作用是多方面的1如胰岛素具有促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸的作用,并且与促细胞分裂有关;类胰岛素生长因子能与细胞表达的胰岛素受体结合,从而具有胰岛素样的作用;促生长激素具有促细胞增殖效应;氢化可的松可能兼有促细胞贴附和增殖的作用1但有人证明,血清中的氢化可的松,如细胞密度高时可能有抑制细胞和诱导其发生分化的作用1此外血清皮质醇、雌二醇、睾酮、黄体酮和甲状腺激素等在细胞培养中也都执行各自应有的生理功能14)氨基酸、葡萄糖、脂肪酸等对细胞培养也有其重要的意义1脂肪酸中有磷脂质、胆固醇和前列腺素E,可能与其他生长因子结合起作用1微量元素铜、锌、钴、铝和硒等对酶有激活作用,并且可保护自由基对DNA的伤害13　牛血清的质量控制 随着人们对生物制品质量越来越高的要求,我国《中国生物制品主要原辅料质控标准》2000年版中对牛血清的质量提出比较严格的标准要求1在有些国外规程中要求牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家,并应具备适当的监测系统,要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群,证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物,血清要通过滤膜过滤除菌,保证无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染1有些国家要求无噬菌体污染,对细胞有良好的支持繁殖作用1按照以上要求,我们对动物血清的生产从原血清来源到产品生产全过程进行严格的质量控制,其动物血清质量控制标准方法如下:3.1　感官性状浅黄色澄清稍粘稠的液体,无溶血或微溶血,无异物13.2　无菌检验血清无菌检验方法———培养法(由美国HyClone实验室提供TSB、THIO培养基)1标准:阴性(-).3.3　p H值测定按《中国生物制品规程》2000年版附录中《生物制品化学及其他检定方法(p H值测定法———电位法)》进行1标准:7.3～7.8.3.4　总蛋白含量测定按《中国生物制品规程》2000年版附录中《生物制品化学及其他检定方法(蛋白质含量测定———Folin酚法)》进行1标准:3.0g/100mL～5.0g/100mL.3.5　血红蛋白含量测定按2000年版《中国生物制品主要原辅材料质控标准》中《生物材料类(牛血清———氰化高铁血红蛋白法+血浆游离血红蛋白法测定)》进行1标准:≤18.0mg/dL.3.6　内毒素含量测定按《中国生物制品规程》2000年版《生物制品细菌内毒素试验规程———鲎试剂法》进行1标准:<10.0Eμ/mL.3.7　大肠杆菌噬菌体检验按2000年版《中国生物制品主要原辅材料质控标准》中《生物材料类(牛血清———增殖法+噬斑法测定)》进行1标准:阴性(-).3.8　牛病毒外源因子的检测按2000年版《中国生物制品主要原辅材料质控标准》中《生物材料类(牛血清———培养法测定)》进行1标准:阴性(-).3.9　支原体检验按2000年版《中国生物制品主要原辅材料质控标准》中《生物材料类(牛血清———培养法+DNA染色法测定)》进行1标准:阴性(-).3.10　支持细胞增殖检查1)细胞生长曲线的绘制1①细胞最大增殖浓度测定见《中国生物制品主要原辅材料质控标准》2000年版《生物材料类(牛血清———支持细胞增殖检查)》进行1标准:≥1×106个/mL1②细胞倍增时间的测定见《中国生物制品主要原辅材料质控标准》2000年版《生物材料类(牛血清支持细胞增殖检查)》进行1标准:≤20h1③细胞克隆率测定见《中国生物制品主要原辅材料质控标准》2000年版《生物材料类(牛血清一支持细胞增殖检查)》进行1标准:≥50%1④贴壁细胞培养.按《细胞实验指南》D.L.标准:2种细胞贴壁培养5代以上,每代48h内细胞占瓶壁面积的95%以上1药品管理法对生物制品提出更严格的质量要求,特别是我国加入WTO,会有更多的国外生物制品进入中国市场,希望我国更多的生物制品也走向国际市场1产品的市场竞争主要靠质量竞争,所以对产品中的主要原材料的质量要求也会越来越高、越来越严格1为此,在贯彻执行2000年版《中国生物制品规程》和2000版《中国生物制品主要原辅材料质控标准》中对生物制品生产用主要原辅材料,其中包括生产用牛血清的质量控制要求基础之上,我们将对牛血清成分、对各种支原体、病毒及噬菌体的检验方法进行更深入的分析研究,制定出更高更严格的牛血清质量控制标准,以进一步提高我国生物制品质量在国内外市场上的竞争力1参考文献:[1]章静波.组织和细胞培养技术[M]1北京:人民卫生出版社,20021[2]中国生物制品标准化委员会.中国生物制品主要原辅材料质控标准(2000版)[M]1北京:化学工业出版社,20001[3]斯佩克特1细胞实验指南D.L[M]1黄培堂等译,北京:科学出版社,20011(转第87页)——8511313　有效　下鼻甲收缩差,粘膜表面欠平,有实质感,偶尔有鼻阻,不影响呼吸及睡眠111314　无效　治疗后症状无改善12　结果 随访3个月～1年,245例中总有效为228例(93%),其中痊愈152例(62%),显效53例(21.6%),有效23例(9.4%),无效17例(6.9%),未见复发病人(详见表1)1 表1　微波治疗效果统计单位:人、%性别病例数总有效其　中数%痊愈数%显效数%有效数%无效数%男15814692.49761.43723.4127.6127.6女878294.35563.21618.41112.65 5.7合计24522893.115262.05321.6239.417 6.93　讨论 慢性肥厚性鼻炎是鼻科常见的疾病之一,一般表现为下鼻甲粘膜明显增生肥厚,堵塞鼻道,引起鼻腔通气不畅1保守治疗效果不佳,手术治疗需要住院,费用较高,术后须鼻腔填塞,而微波直接作用于机体的局部组织,在小范围内产生高温,使其凝固变性及萎缩后结痂1数日后,新生的正常粘膜修复创面,恢复正常生理功能和通气1微波治疗具有对位准确,损伤部位边界清楚,作用范围受到局限,术中及术后不易出血,反应轻,疗效好,操作简便等优点,并可明显减轻病人的疼痛和经济负担1另外,在治疗时应注意微波热凝下鼻甲输出功率不宜过大、时间不宜过长,以防止下鼻甲萎缩过重而至萎缩性鼻炎1本组病人2例出现鼻腔粘膜粘连,检查是因为鼻中隔偏曲而与下鼻甲粘连,对此类病人应加强换药,局部滴1%麻黄素润鼻液防止鼻腔粘连1也可先行鼻中隔偏曲矫正,然后再行微波治疗肥大的下鼻甲1本组无效患者17人,可能与下鼻甲骨性肥厚个别病人下鼻甲桑椹改变或合并鼻中隔偏曲有关,故微波治疗下鼻甲肥大还不能取代传统的下鼻甲部分切除术1(接第58页)The Importance and Q u ality Control Standard onAnim al Serum in the Cellular CultureMA Zhong-ren,FEHG Yu-peng,L I Zhuo,QIAO Zi-ling,L I Ming-sheng,FENG Ruo-fei,(Animal Science Departmant of Northwest Minorities University,Lanzhou G ansu730030,China)[Abstract]Animal serum is one of the important of raw material.It playes critical roles in cell growth pro2 cess.In this article,the important function of new bovine serum in cellular culture and the important ele2 ments of it will be summarized.In addition,the standard of quality control was discussed.[K ey w ords]animal serum;cell cuiture;quality control。

天津市灏洋生物制品科技有限责任公司血清在细胞培养中的作用和质量要求现代生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切的关系，特别是在生物医药领域，细胞培养更具有特殊的作用和价值。

比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多都是通过细胞培养来实现的，基因工程乙肝疫苗大多是以CHO细胞作为载体；基因工程抗体药物的制备也离不开细胞培养。

细胞工程领域更离不开细胞培养技术，杂交瘤单克隆抗体的研究制备完全是通过细胞培养来实现的，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。

总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。

细胞培养的发展，培养基的质量是关键，而培养基的构成中动物血清对细胞的生长繁殖起着重要作用。

在动物血清中牛血清的应用又是最广泛的，所以牛血清的质量好坏直接影响生物制品的质量和安全性，保证牛血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节。

一、牛血清的主要成分牛血清是一种成分复杂的混合物，其大部分成分已为人所知，但还有一部分仍不清楚，而且血清的组成及含量通常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而存在差异。

牛血清主要成分有以下几类：1、蛋白质类除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外还有白蛋白、球蛋白、α-巨球蛋白（抑制胰蛋白酶的作用）、胎牛血清中含胎球蛋白（促进细胞附着）、转铁蛋白（能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用）、纤维粘连素（促进细胞附着生长）等；2、多肽类主要是一些促进细胞生长和分裂的生长因子，最主要的生长因子是血小板生长因子，还有成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，虽然在血清中含量很少，但对细胞的生长和分裂也起着重要作用；3、激素类激素对细胞的作用是多方面的。

包括：胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关；类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用：促生长激素：促进细胞增殖的效应；氢化可的松：血清中含有微量该成分，它可能具有促细胞贴附和增殖作用。

fbs灭活温度FBS，也就是胎牛血清，是目前生命科学领域中使用最广泛的细胞培养基添加物之一，它含有许多活性生物分子。

在实验室应用中，研究人员常会使用FBS来培养悬浮在生长培养基中的细胞，以促进它们的生长和分裂。

而在使用FBS的过程中，为了确保实验得到准确可靠的结果，灭活FBS就成为一项必不可少的工作之一。

而灭活温度就是在灭活FBS过程中需要考虑到的指标之一。

FBS的灭活温度是指在给定的时间内，利用一定的温度将所需要灭活的FBS进行处理，使其中的生物活性分子得到破坏或去活化，从而不会对实验结果产生负面影响。

在实验室中，我们经常使用FBS来培养细胞，但是FBS中所含有的生物活性分子和细胞因子等是否对细胞的生长与发育产生干扰，就是科学家们非常关心的问题，因此在使用FBS进行实验之前，必须进行灭活。

同时，不同的实验需要灭活的温度也有所不同，这与具体的研究目的、研究对象以及实验条件等因素有关。

在一般实验条件下，FBS的灭活温度一般为56℃，处理时间为30分钟。

这种温度和时间的灭菌处理可以起到有效的去活化作用，可以除去其中的病毒、细菌等微生物，同时也可以破坏其中的细胞因子和生长因子等生物活性分子，使其失去原有的生物活性。

但是在一些特殊的实验条件下，研究人员需要使用更高的灭菌温度和更长的处理时间，以保证FBS中的生物活性分子被彻底破坏。

尽管在56℃的灭菌温度下，FBS中的活性分子会被有效去活化，但也有些分子可能会出现部分失活或仍然保留一部分活性的情况。

因此，在使用FBS进行实验时，还需要进行一定的质量控制和质量保证。

例如，科学家们在选择FBS时，会根据其保证质量的厂商和品牌进行选择，同时在使用前还需要进行生物学和化学检测，以确保其中不包含有对实验有干扰作用的生物活性分子。

总体而言，FBS灭活温度的选择需要综合考虑实验条件、实验需求和研究对象等因素，进行适当的调整和优化，从而保证实验结果的可靠性和准确性。

在进行实验前，一定要仔细了解和掌握所要使用的FBS 的特性和品质，并进行灭活处理和质量检测工作，以避免实验结果受到干扰和误差。

细胞培养常见问题的原因及对策细胞培养中的注意事项1 冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。

另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。

2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。

每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。

4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。

血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。

来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。

CS (calf serum) 则是指小牛血清。

HS (horseserum) 则是指马血清。

6 培养细胞时应使用5 %或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。

当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。

7 何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。

一、牛血清在细胞培养基中的主要功能牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。

1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。

2. 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。

3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。

4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。

5.起酸碱度缓冲液作用。

6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。

二、牛血清的主要成份血清是一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。

1.蛋白质是牛血清中主要成份。

除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。

纤维粘连素细胞促进细胞附着；α2 巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白促细胞附着；转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。

2.多肽：血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。

3.激素：激素对细胞的作用是多方面的。

胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。

类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。

促生长激素：促细胞增殖效应。

氢化可的松：血清中含有定量的该成分，它可能兼有促细胞贴附和增殖作用，但有人证明，血清中的氢化可的松，如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化。

4其他成份氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大。

与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意义。

三、牛血清的质量要求随着科学技术的发展和生活水平的不断提高对生物医药产品的质量要求也越来越高，所以对制备工艺中所涉及到的各种原材料的质量标准要求也越来越高，特别是对用于细胞培养基中的主要天然成份――牛血清的质量要求也不断提高。

细胞复苏时使用较高浓度的牛血清的原因以细胞复苏时使用较高浓度的牛血清的原因为标题细胞培养是生物科学中的一项重要技术，它可以帮助科学家们研究细胞的生理、病理以及药物相应等方面的问题。

而在细胞培养的过程中，添加适当浓度的血清对于细胞的生长和复苏起到了至关重要的作用。

牛血清是一种常用的细胞培养血清，它富含了许多生长因子、细胞外基质和营养物质，能够提供细胞生长所需的养分和环境。

在细胞复苏时，使用较高浓度的牛血清有以下几个原因：1. 提供丰富的营养物质：细胞在培养基中需要获得足够的营养物质才能进行正常的代谢活动。

高浓度的牛血清能够提供丰富的蛋白质、糖类、脂类等营养物质，为细胞提供充足的能量和材料，促进细胞的生长和复苏。

2. 保护细胞膜完整性：细胞膜是细胞的保护屏障，它能够控制物质的进出，并维持细胞内外环境的稳定。

在细胞复苏过程中，高浓度的牛血清中含有丰富的脂类成分，可以提供足够的脂质来修复受损的细胞膜，保护细胞膜的完整性。

3. 提供生长因子和细胞外基质：牛血清中含有多种生长因子和细胞外基质成分，如胶原蛋白、纤维蛋白等。

这些物质能够促进细胞的黏附和生长，并参与细胞信号传导、细胞分化等过程。

在细胞复苏时，添加高浓度的牛血清可以提供足够的生长因子和细胞外基质，促进细胞的复苏和重建。

4. 抑制细胞凋亡：细胞凋亡是一种正常的细胞死亡过程，但在细胞培养中，细胞凋亡会对细胞的生长和复苏产生不利影响。

牛血清中的某些成分可以抑制细胞凋亡的发生，保护细胞的生命活力，使细胞能够更好地进行复苏和生长。

细胞复苏时使用较高浓度的牛血清有助于提供丰富的营养物质、保护细胞膜完整性、提供生长因子和细胞外基质以及抑制细胞凋亡等作用。

这些因素共同作用，可以促进细胞的生长和复苏，为科学家们的细胞研究提供可靠的支持。

在实际应用中，科学家们可以根据具体的实验目的和细胞类型选择适当浓度的牛血清，以实现最佳的实验效果。

细胞培养技术的发展为生物科学研究提供了重要的工具和平台，而牛血清作为细胞培养的重要组成部分，其高浓度的应用也具有重要的意义。

1.体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种? 按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型?⑴按生长方式分为二型:粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。

悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面, 而在悬浮状态下即可生长的细胞。

（绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。

）⑵可分四型: (1)上皮型细胞 (2)成纤维型细胞 (3)游走型细胞 (4)多形型细胞2.简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程⑴通常, 体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段:①原代培养期: 也称初代培养, 是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。

此期的细胞呈现出活跃移动的特点, 可见细胞分裂, 但不旺盛。

处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。

细胞群具有明显的异质性, 细胞间的相互依存性强, 在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。

②. 传代期：通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期, 原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系。

一般情况下, 正常体细胞在传代10-50次左右后, 细胞分裂的能力就会逐渐减弱, 甚至完全丧失, 细胞便进入衰退期。

③衰退期：处于衰退期的培养细胞, 增殖速率已经变得很慢或不再增殖, 直至最后衰退死亡。

以上特点, 主要是针对体外培养的机体正常细胞, 对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言, 永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力, 这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。

⑵每代贴附生长细胞的生长过程：①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态, 也称悬浮期。

此时细胞质回缩, 胞体呈圆球形。

时间：10分钟一4小时②贴壁期：细胞附着于底物上, 游离期结束。

底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等③潜伏期：此时细胞有生长活动, 而无细胞分裂。

细胞株潜伏期一般为6～24小时。

④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长, 活力最佳, 最适合进行实验研究。