Bt cry3Aα基因表达载体的构建及农杆菌介导的甘薯茎段遗传转化

PKR基因表达载体构建及农杆菌介导玉米茎尖遗传转化PKR基因表达载体构建及农杆菌介导玉米茎尖遗传转化随着生物技术的快速发展，基因工程技术呈现出广阔的应用前景。

玉米作为世界上最重要的粮食作物之一，其遗传改良一直是研究人员关注的焦点。

本文旨在通过构建PKR基因表达载体，并通过农杆菌介导方式，将其导入玉米的茎尖细胞中，实现遗传转化，从而为玉米的功能基因研究和遗传改良提供基础。

首先，本研究选择了PKR基因作为目标基因。

PKR基因是编码蛋白激酶RNA依赖性蛋白激酶（PKR）的基因。

PKR参与了真核生物的免疫应答机制，对病毒感染具有重要的调控作用。

近年来，PKR基因在遗传改良作物抗病性方面的研究引起了广泛关注。

因此，构建PKR基因表达载体具有研究价值和推广应用的潜力。

其次，本研究选用了农杆菌介导的遗传转化技术。

农杆菌是一种以植物为寄主的土壤细菌，其能够在寄主细胞中转移和整合外源DNA片段。

农杆菌介导的遗传转化技术已被广泛用于作物遗传改良中，其具有转化效率高、目标基因稳定表达等优势。

因此，本研究选择了农杆菌介导技术作为玉米茎尖遗传转化的手段。

在实验过程中，首先需要构建PKR基因表达载体。

本研究利用重组DNA技术，将PKR基因的编码序列克隆到适当的表达载体中。

通过限制性内切酶切割和连接反应，将PKR基因与表达载体的适配序列连接起来，形成完整的表达载体。

然后，将该载体导入适当的大肠杆菌菌株中，通过复制和扩增，得到大量带有PKR基因的表达载体。

接下来，进行植物遗传转化实验。

将获得的PKR基因表达载体导入农杆菌中，然后进行农杆菌与玉米茎尖细胞的共培养。

在适当的条件下，农杆菌会转移并整合载体中的PKR基因到玉米茎尖细胞的基因组中。

经过筛选和鉴定，成功得到带有PKR基因的转基因玉米茎尖植株。

最后，对转基因玉米进行进一步的分子生物学和遗传学研究。

利用PCR、RT-qPCR等技术检测转基因玉米中PKR基因的存在和表达情况。

通过Western blot等蛋白质分析方法，验证PKR基因在转基因玉米中的蛋白表达水平。

专利名称：一种新型表达Cry3A杀虫蛋白的植物内生工程菌及其构建方法与应用
专利类型：发明专利
发明人：李阳,张立钦,吴酬飞,叶建仁
申请号：CN201710637658.7
申请日：20170731
公开号：CN107312739A
公开日：
20171103
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种新型表达Cry3A杀虫蛋白的植物内生工程菌及其构建方法与应用。

该工程菌的DNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明选用了针对鞘翅目害虫的Cry3A杀虫蛋白，运用T7超表达系统，通过对Cry3A密码子的优化、表达载体的筛选、插入位置的分析、诱导条件浓度等的组合优化，实现了重组工程菌的构建，使具有抑菌功效的植物内生菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK‑SH007高效表达了Cry3A蛋白。

通过生测实验，工程菌B.pyrrocinia
JK‑SH007(pHKT2‑Cry3Aa)被证明对榆树甲虫幼虫具有较好的控制效果。

申请人：湖州师范学院
地址：313000 浙江省湖州市吴兴区湖州市二环东路759号
国籍：CN
代理机构：北京众合诚成知识产权代理有限公司
代理人：袁彩君
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中国瓜菜2023，36（10）：23-31收稿日期：2022-10-31；修回日期：2023-08-30基金项目：国家自然科学基金地区项目（32160464）；榆林学院研究生创新基金（2022YLYCX09）；榆林学院高层次人才科研启动基金（18GK11）作者简介：韦明月，女，在读硕士研究生，主要从事植物抗旱生理生态研究。

E-mail ：*****************通信作者：柴乖强，男，副教授，主要从事旱区植物遗传改良与逆境生理研究。

E-mail ：*********************黄瓜β-酮脂酰辅酶A 合成酶基因CsKCS11的功能初步分析韦明月1，郭孝文1，邱嘉鑫1，宋怡颖1，柴乖强1，2，段义忠1，2（1.榆林学院生命科学学院陕西榆林719000；2.陕西省陕北矿区生态修复重点实验室陕西榆林719000）摘要：为了鉴定和挖掘黄瓜β-酮脂酰辅酶A 合成酶（β-Ketoacyl CoA synthetase ，KCS ）编码基因，以设施黄瓜为材料，通过转录组测序鉴定、基因克隆与表达载体的构建、干旱胁迫下的表达分析和转化拟南芥等方法，研究了CsKCS11的生物学功能。

结果表明，黄瓜CsKCS11基因（NCBI 登录号OL660537）的开放阅读框为1542bp ，编码513个氨基酸；序列分析表明，CsKCS11蛋白亲疏水性平均值（Gravy ）为-0.083，为亲水性蛋白，二级结构中α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β转角所占比例分别为44.64%、35.48%、15.20%和4.68%；系统进化分析表明，CsKCS11与冬瓜KCS11蛋白亲缘关系最近；同时将CsKCS11转化拟南芥，转基因拟南芥后代植株具有抵御干旱胁迫的能力；干旱胁迫下的表达分析表明，黄瓜CsKCS11能够被干旱胁迫诱导表达，且随着干旱胁迫时间的延长，其表达量呈现出先升高后降低的趋势，并且在干旱胁迫12h 时达到最高。

根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化研究进展邢宇俊1,2,季勤1,张云峰1,杨清2　(1.淮阴师范学院生物系,江苏淮安223300;2.南京农业大学生命科学学院,江苏南京210095)摘要　目前,利用根癌农杆菌介导方法获得了许多转基因植株,由于甘薯本身的特性致使部分甘薯的遗传转化受到限制,但在研究过程中可根据不同甘薯品种选择不同的受体、条件,用根癌农杆菌介导的方法也获得了成功。

综述了根癌农杆菌介导法的转化机理及影响根癌农杆菌转化甘薯效率的诸多因素,如:植物基因型、转化受体、菌液浓度、选择标记等,以及采用遗传工程技术改良甘薯品种的进展。

关键词　甘薯;农杆菌;遗传转化;进展中图分类号　S531 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2007)24-07412-03Research Progress in Geneti c T ransform atio n o f Sw eet Potato Mediated by A gro bacterium tum efa ciens X ING Y u -jun et a l (Departerment of Biology ,Hu aiyin T eachers College ,Huaian ,Jian gs u 223300)A bstract It is an imp ortan t way to obtain transgenic sweet potato plants by Agrobacterium tum efaciens -mediated transformation .In t his review the princi -pl e of the transfor mation mediated b y Agrob acteriu m tu mefacien s was describ ed ,t he effect of factors includ ing gen otypes of s weet potato ,kind of expl ants ,density of agrobacteriu m culture etc on the transformation efficiency of s weet p otato was d iscussed ,an d the develop ment and pros pect of genetic s weet p otato obtain ed by Agrobacteriu m tu mefaciens -m ed iated trans formation were discussed .Key w ords Sweet potato ;Agrobacteriu m tu mefacien s ;Gen etic transformati on ;E ffect factor 在甘薯品种改良中,以杂交育种为中心的常规育种发挥了一定的作用,但是栽培甘薯染色体的六倍性,具有生活力的种子生产量少;遗传上的高度杂合性和种间、种内广泛存在的杂交不亲和性,以及遗传资源匮乏,遗传基础狭窄,优异近缘野生种利用困难和病虫害、病毒病危害严重等因素限制了常规育种的发展[1]。

CryⅢA基因植物表达载体构建及马铃薯遗传转化CryⅢA基因植物表达载体构建及马铃薯遗传转化植物转基因技术是现代生物技术的一个重要分支，其应用范围广泛，不仅可以改良农作物的农艺性状，还可以提高农作物对病虫害的抗性。

其中，CryⅢA基因作为一种重要的抗虫基因，在植物遗传转化中得到了广泛的应用。

本文将介绍CryⅢA基因植物表达载体的构建以及其在马铃薯遗传转化中的应用。

首先，我们先来了解一下CryⅢA基因。

CryⅢA基因来自于一种土壤细菌Bacillus thuringiensis，它编码了一种具有杀虫活性的晶体毒素。

CryⅢA毒素主要对披蓟马等多种害虫具有杀灭作用，可以通过转基因技术将其导入农作物中，提高作物对害虫的抗性。

为了实现CryⅢA基因的遗传转化，需要构建一个能够稳定表达该基因的植物表达载体。

植物表达载体是一种能够在植物细胞中进行复制和表达的DNA分子。

构建CryⅢA基因表达载体的第一步是采集CryⅢA基因的DNA序列，并进行PCR扩增。

然后，将扩增得到的CryⅢA基因片段与植物表达载体进行连接，产生一个含有CryⅢA基因的表达载体。

这个表达载体还需要包含适当的启动子和终止子，以确保CryⅢA基因能够在植物细胞中得到高效的转录和翻译。

将构建好的CryⅢA基因表达载体导入植物细胞中的过程称为遗传转化。

目前，常用的植物遗传转化方法包括农杆菌介导的遗传转化和基因枪法。

在马铃薯中，农杆菌介导的遗传转化是最常用的方法。

首先，将构建好的CryⅢA基因表达载体导入一种常见的农杆菌，经过一系列的处理和培养，使其携带CryⅢA基因表达载体。

然后，将经过处理的农杆菌与马铃薯离体组织接种，使其与马铃薯细胞进行共培养。

随着细胞的分裂和分化，含有CryⅢA基因的DNA会随着细胞的遗传物质被传递给下一代细胞，并最终形成CryⅢA基因转化的马铃薯植株。

植物转基因技术是一种有前景的农作物改良方法。

CryⅢA 基因植物表达载体的构建及其在马铃薯遗传转化中的应用为我们提供了一种重要的抗虫策略。

2021年第3期试题分析----------------浙江省选考中“农杆菌介导的转基因植物”相关试题释疑与拓展浙江省温州市第二外国语学校(325015) 陈一波摘要结合历年浙江省生物选考中“农杆菌介导的转基因植物”相关试题，综合解析试题的相关知 识背景，梳理并拓展农杆菌介导的转基因植物生产的一般操作流程。

关键词浙江省；生物学选考；农杆菌转化法;试题文章编号 1005 -2259(2021)3 -0065 -03浙江省的生物学选考试题中，考查选修教材内 容的试题往往是甄别学生生物学学科核心素养和 学业能力的重要组成。

从2020年起这部分试题的 分值进一步增加，这类试题情境新颖且紧贴实际生 产、生活，体现了生物学学科的时代特征，它要求学 生不仅要熟练掌握教材中的基本概念、各项生物技 术中的常规操作流程,而且要适当地拓展教材有关 前沿知识内容，并能在新的问题情境中迁移应用所 学知识，试题难度较大。

2015年10月、2016年4 月、2018年4月、2018年11月、2020年7月的试题 中均考查了“农杆菌介导的转基因植物”相关内 容,属于高频考点，但每次选考中学生答题正确率 均不高。

究其原因，浙科版教材中没有具体的农杆 菌转化法的知识介绍，仅在“基因工程的应用”一 节中以图片形式简单呈现，而试题所考查的却是农 杆菌转化法中的具体操作细节，两者的落差较大。

为了更好地复习备考,笔者结合这些年的浙江省选考真题,系统地梳理利用“农杆菌转化法”生产转基因植物的一般操作流程。

1农杆菌及其感染植物组织的自然过程为什么将外源目的基因导人植物细胞时，常使用“农杆菌转化法”？农杆菌感染植物细胞时，到底是什么结构或物质进人了植物细胞？这要从农杆菌本身说起。

农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，在自然界的土壤中普遍存在。

根据感染植物后诱导植物产生冠癭瘤或发状根，农杆菌可分为根癌农杆菌和发根农杆菌两种，其细胞内的质粒上均含有一段可转移的DNA 片段。

2025年1月“八省联考”考前猜想卷生物（考试时间：75分钟试卷满分：100分）注意事项：1．答卷前，考生务必将自己的姓名、考生号等填写在答题卡和试卷指定位置上。

2．回答选择题时，选出每小题答案后，用铅笔把答题卡对应题目的答案标号涂黑。

如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其他答案标号。

回答非选择题时，将答案写在答题卡上。

写在本试卷上无效。

3．考试结束后，将本试卷和答题卡一并交回。

一、选择题：本部分共16题，每题3分，共48分。

在每题列出的四个选项中，选出最符合题目要求的一项。

1．高密度脂蛋白（HDL）为血清蛋白之一，是由载脂蛋白、磷脂和胆固醇酯等组成，可将血液中多余的胆固醇转运到肝脏处进行分解排泄。

动脉造影检测证明，高密度脂蛋白含量与动脉管腔狭窄程度呈显著的负相关。

下列有关叙述错误的是（）A．载脂蛋白是一种能与脂质结合的含有氢键的蛋白质B．磷脂分子具有亲水性的“尾部”和疏水性的“头部”C．HDL是由多种化合物组成，其含有C、H、O、N、P元素D．高水平的HDL可降低高胆固醇引起的心脑血管疾病的风险2．在偏碱性的土壤中Fe3+通常以不溶于水的Fe（OH）3形式存在，溶解度低，难以被植物吸收。

在长期的进化过程中，某植物形成了如图所示的铁吸收机制。

据图分析，下列说法正确的是（）A．ATPase具有运输功能但不具有催化作用B．H+的外排有利于铁化合物的溶解和吸收C．Fe2+的吸收为无氧呼吸，则降低土壤中氧气含量，植物对铁的吸收增强D．缺铁胁迫下，图中膜蛋白合成量会下降3．蔬菜或水果收获后一段时间内细胞仍进行细胞呼吸。

某研究小组探究了温度、O2浓度对储存苹果的影响，实验结果如图所示。

下列相关叙述正确的是（）A．该实验的自变量是温度，因变量是CO2相对生成量B．温度影响细胞呼吸的每个阶段，O2浓度会影响有氧呼吸的第三阶段C．3℃时苹果细胞只能进行无氧呼吸，其他实验温度下可以进行有氧呼吸和无氧呼吸D．根据实验结果可知，低温和无氧环境最适合储藏苹果4．演艺圈的女明星，有些为了保持年轻貌美，不惜重金到医疗机构非法注射人体胎盘素（可能携带梅毒等病原体）。

遗传转化的方法和技术常见的遗传转化方法和技术包括农杆菌介导法、基因枪转化法和聚乙二醇-介导法等。

其中，农杆菌介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。

其Ti质粒具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。

农杆菌介导法的具体步骤如下：1. Ti质粒的构建：利用农杆菌进行遗传转化前，必须对Ti质粒进行改造。

改造的目的有以下几点：去除T-DNA区的激素基因，因为激素基因的产物会导致转化细胞激素水平的不平衡而引起细胞的无限分裂，阻碍正常植株的再生。

保留T-DNA区的左右边界，尤其是左边界，以保证T-DNA的正常转化。

在去除的T-DNA区，增加至少一个可以在植物体内表达的选择基因，以使转化细胞易于被检测出来。

在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。

在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒，该基因只能在细菌中表达，而不能在植物中表达。

2. 外源基因的转化：除Ti质粒外，发根农杆菌的Ri质粒也已成为植物基因工程载体家庭中的新成员。

发根农杆菌感染植物伤口，向目的植物转入Ri质粒中的T-DNA，经一段时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。

发状根没有向地性，可在无激素的培养基上培养生长，生长迅速并产生许多分枝，其增长速度一个月可增殖数倍到数百倍。

发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖于其菌体中的Ri质粒。

例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向分化细胞中才能产生的有用次生代谢物质等。

3. 外源基因的转化：一般而言，农杆菌只感染双子叶植物；但利用Ti质粒作载体已将外源基因导入了水稻、玉米、吊兰、石刁柏、香蕉等某些单子叶植物中。

农杆菌介导的遗传转化技术简单，易于掌握，对植物受体要求不严，绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物的组织或器官均可，且转化频率较高，转化周期较短，是目前应用最广的一种植物遗传转化方法。

以上内容仅供参考，建议查阅专业书籍或咨询专业人士获取更准确的信息。

农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
本实验使用农杆菌介导植物的遗传转化技术，将外来基因导入到拟南芥植物中。

通过将拟南芥的幼苗浸泡在农杆菌中，再经过一定的培养条件，使外来基因被顺利地导入到拟南芥植物的细胞中，并观察到了转化成功的基因表达现象。

实验过程：
1. 构建外源基因载体——将目的基因把它克隆进载体中，构建出我们所需要的质粒；
2. 建立农杆菌表达载体——通过将农杆菌表达载体连接到质粒上，形成我们的转化载体；
3. 准备转化基质——通过将农杆菌营养培养在一定条件下，形成我们所需要的转化基质；
4. 转化拟南芥中——通过将拟南芥幼苗浸泡到农杆菌基质中，利用细胞壁酶和孔道蛋白结合作用，导入外源基因，最终实现基因转化；
5. 鉴定转化水平——通过将转化后的拟南芥植株置于含有抗生素的培养基中，筛选出转化成功的植株。

实验结果：
通过观察实验结果，我们发现拟南芥细胞成功地接受了外源基因，使其表达了目
的蛋白。

同时，通过筛选，我们也成功得到转化成功的植株。

结论：
农杆菌介导植物的遗传转化技术是一种有效的基因转化方法，可以将外源基因导入到植物细胞中，从而实现第二代遗传分析、基因功能研究、新品种选育等方面的应用。