哺乳动物细胞分离纯化

RNA的分离与纯化包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料，mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品，RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。

RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%～85%；tRNA及核内小分子RNA占15%～20%；mR NA仅占1%～5%。

由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚，从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA 与mRNA上。

一、RNA制备的条件与环境为防止RNase对RNA 的水解，一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。

对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。

从RNA提取的初始阶段开始，就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂（如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂）、蛋白的水解酶（如蛋白酶K）和能与蛋白质结合的阴离子去污剂（如SDS、sarkosyl或脱氧胆酸钠等）并联合使用RNase的特异性抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的水解。

另外，在变性液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）等还原剂可以破坏RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。

二、总RNA的分离与纯化由于RNase的影响，为获得完整的RNA分子，就必须在总RNA分离纯化的最初阶段，尽可能快地灭活胞内RNase的活性。

在β-巯基乙醇的协同作用下，高浓度的(异)硫氰酸胍可以极大极快地抑制RNase的活性，能从胰腺等富含RNase的组织细胞中分离出完整的RNA分子，目前已成为常规使用的试剂。

pH8.0的Tris饱和酚用于DNA的制备，但在RNA纯化时，应使用pH4.5～5.5的水饱和酸性酚，这既有利于DNA的变性又有利于RNA的分离。

Loading Buffer煮细胞抽提总蛋白Protocol1.细胞计数（约1×106的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）；2.预冷1×PBS 500ul重悬洗一次，转至500ul EP管（2000rpm×5min）；3.去上清，后甩一次，将上清去尽；4.按每1×106的细胞加50ul loading buffer 加入2×loading；5.Vortex一下，煮10～15min一次×2～3次直至无粘丝；6.每次煮好将其放于冰上，静置约2min，Vortex一下，再甩一下；7.三次后用枪吸起，如没有粘丝，即可；8.每次上样约5ul（50ug/ul蛋白）RIPA裂解抽提总蛋白Protocol1.细胞计数（约1×107的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）；2.预冷1×PBS 1ml重悬洗2次，转至1.5ml EP管（2000rpm×5min）；3.去上清，后甩一次，将上清去尽；4.按照如下比例加入裂解试剂：RIPA：300ul/1×107细胞PMSF：3ul(1:100)Cocktail ：0.3ul(1:1000)5.吹打均匀，冰上放置30-40min，中间每10分钟Vortex一次；6.4℃预冷离心：10000rpm ×10min；7.收集上清，转移至已预冷新EP管，即为总蛋白。

【为了浓缩蛋白，加RIPA的量改为200ul或者更低，可稍微延长冰上裂解时间，而RIPA（1）＋PMSF（1：100）＋Cocktail（1：1000）的比例不变】核，浆蛋白抽提Protocol一.收核-浆蛋白收浆蛋白1.细胞计数（约1.5×107的细胞），离心收集细胞（1100rpm×5min）；2.用4℃预冷的PBS重悬，转至1.5mL的EP管中，离心（4000rpm×5min，4℃）；3.去上清，加入A Buffer1mL/1×107 cell，重悬，4℃放置10min，离心（2500rpm×3min，4℃）；4.去上清，加入A’ Buffer 250uL/1.5×107 cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×1min，4℃），吸取上清（上清是浆蛋白）；收核蛋白5.再用A’ Buffer 500uL/1.5×107 cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×1min，4℃），吸走上清，12000rpm×30sec，把上清完全吸干净；6.剩余沉淀中加入B’Buffer (或者RAPI)50uL，重悬（振荡），4℃放置40min（每隔10min振荡一次）；7.离心（12000×10min，4℃），取上清即为核蛋白，－80℃保存。

生物制药复习题（有答案）《生物技术制药》习题（课后作业）一、下列概念：⑴生物制药：⑵生物药物：包括生物技术药物，天然生化药物，微生物药物，海洋药物和生物制品。

(3)生物技术制药：采用现代生物技术,借助某些微生物、植物、动物生产医药品。

(4)生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。

（5）现代生物技术：以现代生命科学为基础, 把生物体系与工程学技术有机结合在一起，按照预先的设计，定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料, 产生对人类有用的新产品(或达到某种目的)之综合性科学技术。

（6）基因表达：⒈转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA为模板合成mRNA的过程。

2、翻译：以mRNA为模板,tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程（7）质粒的分裂不稳定：基因工程菌分裂时产生一定比例不含质粒的子代菌的现象,即重组分子从受体细胞中逃逸。

（8）质粒的结构不稳定：DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

重组DNA分子某一区域发生变异，导致表观生物学功能的丧失；（9）显微注射：显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。

经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。

（10）悬浮细胞：（11）补料分批培养：是指分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。

（12）连续培养行下去的一种培养方法。

（13）接触抑制：细胞在生长分裂时达到相互接触而停止分裂的现象,称为接触性抑制（14）单克隆抗体：由一个抗原决定簇刺激的、单一的B细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、高度均一的抗体。

（15）多克隆抗体：一种抗原具有多个抗原决定簇,每个抗原决定簇都能刺激一个B细胞产生一种抗体。

这样所获得的免疫血清是多种抗体的混和物。

奶山羊乳腺上皮细胞的分离、培养与鉴定一、乳腺组织的采取及处理从屠宰场切取无乳腺疾病的泌乳后期奶山羊乳腺组织，置冰盒内运回实验室，清洗消毒后，无菌操作剥开深层乳腺组织，取约5g的腺泡组织，放入PBS 液中依次漂洗5次，洗净乳汁和血液，然后将其剪切成1mm3左右的小块，用PBS液充分冲洗吹打后，静置30s，弃去上清液及少量漂浮的脂肪组织，反复多次，至上清液不混浊时即可。

（杨雪峰）二、山羊乳腺上皮细胞原代培养（1）酶消化法方法一：I 型胶原酶结合透明质酸酶消化法a.酶消化用含150 U /m L的I 型胶原酶和100 U /mL的透明质酸酶的混合液, 37 ℃消化组织块4h , 可得到大量的分散单细胞用于原代培养，收集细胞及细胞团块。

根据密度大小接种于6孔培养板,置于5 % CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养, 次日换液，以后隔日换液（曹艳红）。

b.纯化用专用消化液消化回收乳腺上皮细胞与成纤维细胞的混合物。

将细胞悬液以适宜浓度接种于培养瓶,在37℃、5% CO2和饱和湿度下静置培养。

待培养瓶基本铺满单层细胞时,先加成纤维细胞消化液,37℃消化,待成纤维细胞脱离瓶壁时,将酶液倾出。

然后加入专用消化液继续消化,待上皮细胞回缩并脱离皿底后终止消化。

细胞悬液离心浓缩后收集的细胞绝大多数为上皮细胞,继续传代培养并分离纯化,当得到乳腺上皮细胞纯细胞系时,终止纯化。

方法二（先用哪种酶消化？）：组织块剪成1mm3，置于酶消化液中（Ⅱ型胶原酶消化3.5h，0.25%胰蛋白酶消化时每隔30min收集一次细胞），37℃水浴消化后取出，用200目的滤网过滤，再1000r/min离心10min，去掉上清液，再加入培养液，吹打均匀后细胞计数接种，接种数为106/ml。

（陈秋菊）方法三：胶原酶Ⅱ消化法将组织小块剪切成糊状后，加入５倍体积的Ⅱ型胶原酶溶液，37℃消化2h，约20min摇动1次，使其充分消化。

然后用孔径75μm（200目）尼龙网过滤消化液，滤液于1500r/min离心5min，去除上清液，底部沉淀中加入细胞培养液，制成细胞悬液，细胞计数后，按5×105ml-1的细胞密度接种于培养瓶内，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。

细胞的纯化方法介绍（自然纯化和人工纯化）体外培养的细胞源于人或动物或胚胎组织，体内的细胞都是混杂生长，每一种组织都有血管和间叶组织，因此，来源于上述组织的培养材料的原代细胞、传代细胞绝大多数都呈混合生长，既有上皮样细胞又有纤维样细胞，纤维样细胞又包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、滑膜细胞等，混杂的细胞会直接影响实验结果，而利用体外培养细胞进行实验研究时，为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性、和可重复性，要求采用单一种类细胞来进行实验，这样才能对某一细胞的功能、形态等变化进行一系列研究，因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步，甚至需要从混杂的细胞群中分离出单个细胞来进行培养和开展实验研究。

细胞的纯化：细胞的纯化一般分为两种，即自然纯化和人工纯化。

可根据不同细胞种类、来源、实验要求和目的选择采用。

一、自然纯化：自然纯化是利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺盛的细胞，达到细胞纯化的目的。

但这种方法常无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞。

此法花费时间长，留下的往往是成纤维细胞。

仅有那些恶变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来的，不断纯化而建立细胞系。

二、人工纯化：人工纯化是利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。

主要有以下5种方法。

1、细胞因子依赖纯化法：是通过加入某些特殊的细胞因子而纯化出只依赖于这种细胞因子生长的细胞系。

人和动物组织中某些细胞需要有特殊的细胞因子存在的环境才能长期存活和生长繁殖，如白细胞介素-2（IL-2）SHI 他细胞生长所必须的细胞因子，B细胞生长因子是B细胞的生长因子，体外培养中淋巴细胞若加入IL-2就可使T细胞生长繁殖，形成IL-2依赖的T细胞，如CTLL-2细胞系，而其他细胞则自然被淘汰，采用此法还建立了IL-6依赖的细胞系，如B9、CTD7细胞系。

mRNA的分离纯化【实验原理】真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。

真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。

哺乳动物平均每个细胞含有约1x10-5g RNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。

其中rRNA为75％～85％，tRNA占10％～16％，而mRNA仅占1%～5％，并且mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样。

真核生物mRNA有特征性的结构，即具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20~300个腺苷酸组成的poly（A）尾，通常用poly（A+）表示，这种结构为真核mRNA分子的提取、纯化，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。

一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’末端含有多poly(A)尾巴结构特性设计的。

当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT)纤维素柱，即可得到较纯的mRNA。

目前常用的mRNA的纯化方法有：（1）寡聚（dT）－纤维素柱层析法，即分离mRNA的标准方法；（2）寡聚（dT）－纤维素液相离心法，即用寡聚（dT）－纤维素直接加入到总的RNA溶液中并使mRNA与寡聚（dT）－纤维素结合，离心收集寡聚（dT）－纤维素／mRNA 复合物，再用洗脱液分离mRNA，然后离心除去寡聚（dT）－纤维素；（3）其它一些方法：如寡聚（dT）－磁性球珠法等。

本实验应用方法（1）进行mRNA的分离纯化。

【试剂与器材】（一）试剂1．0.1mol/L NaOH ，每组200mL2．寡聚Oligo（dT）-纤维素3．加样/洗涤缓冲液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL 或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。

小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。

1. 实验材料与试剂剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F1培养液、胎牛血清、马血清、0.25%, 0.05%胰蛋白酶、PBS®、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL细胞培养瓶、CO恒温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0.4% Trypan Blue 染色液、抗小鼠0X4单克隆抗体和新生SD」、鼠等试剂配比：(1) DMEM 10:10:1DMEM, 10%FBS, 10%Horse Serum, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S)(2) DMEM 5:5:1DMEM, 5% FBS, 5% of Horse Serum, 1% P/S(3) SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS ( DMEM/F12 无血清培养基+生长因子)25卩g/m转铁蛋白，10nM生物素，30 nM亚硒酸钠，1卩g/ml putrescine (腐胺)，5 卩g/m胰岛素，20 nM hydrocortisone (氢化可的松)，20 nM progesterone (孕激素)，1 %P / S+生长因子(5ng/ ml的血小板衍生生长因子PDGF-AA和5ng / ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF )胰蛋白酶/ EDTA溶液0.05 %胰蛋白酶+0.02 % EDTA在W / O 内Ca2+ / Mg2 + 的HBSSDMEM/F12 con ta ining 25 卩g/ml tran sferri n, 10 nM biot in, 30 nM sodium selenite, 1 卩g/ml putrescine, 5 卩g/ml insulin, 20 nM hydrocortisone, 20 nMprogesterone, 1% P/S + Growth Factors (5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml bFGF) Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0,02% EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+37oCmicrodissecting instruments: large dissecting scissors, mouse-teeth forceps, curved forceps and fine Dumont forcepsTabletop centrifugeT75 cm2 tissue culture flasks with plug-seal （BD Falcon, 137787）culture plates （Falcon）（Saatilene, Hitech）2. 实验步骤2.1 星形胶质细胞的混合培养取新生SD」、鼠若干只（出生24h内），在无菌条件下断头,迅速剪开颅骨,取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中，用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管,用PBSR冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用、剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05%胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块；加入DMEM/F12完全培养基（含10%S台牛血清、100U/mL青霉素和100 ug/mL 链霉素）终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min,弃上清；加定量完全培养液再次制成细胞悬液，更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中，置于5%COS温细胞培养箱（37度）培养； 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。

动物细胞膜的分离纯化及其在病毒受体研究中的应用王向东;黄倢;战文斌【摘要】细胞膜是动物细胞与胞外环境之间的屏障.病毒只有与细胞膜上的病毒受体特异性结合,才能进入细胞,进而启动其增殖周期.因此,病毒受体是病毒学研究的重要组成部分.分离纯化病毒受体所在的细胞膜作为病毒受体研究的实验材料,已经在许多病毒的研究中得到应用,并取得了很好的效果.现就动物细胞膜的分离纯化及其在病毒受体研究中的应用作一综述.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2004(000)005【总页数】4页(P1-4)【关键词】病毒;受体;细胞膜;细胞膜微囊【作者】王向东;黄倢;战文斌【作者单位】中国海洋大学水产学院,青岛,266003;中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛,266071;中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛,266071;中国海洋大学水产学院,青岛,266003【正文语种】中文【中图分类】基础科学生物技术通报· 综述与专论． BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2004 年第 5 期动物细胞膜的分离纯化及其在病毒受体研究中的应用+王向东1 ，2 黄使孙铖文斌1（ 1 中国海洋大学水产学院，青岛 266003 ； 2 中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛 266071 ）摘要：细胞膜是动物细胞与胞外环境之间的屏障。

病毒只有与细胞膜上的病毒受体特异性结合，才能进入细胞，进而启动其增殖周期。

因此，病毒受体是病毒学研究的重要组成部分。

分离纯化病毒受体所在的细胞膜作为病毒受体研究的实验材料，已经在许多病毒的研究中得到应用，并取得了很好的效果。

现就动物细胞膜的分离纯化及其在病毒受体研究中的应用作一综述。

关键词：病毒受体细胞膜细胞膜微囊 Purified Animal Plasma MembranesAppliedinStudyof Virus Receptor WangXiangdong' 2HuangJie2 料ZhanWenbinl(I College ofFisheries, OceanUnicfrsityofChina,Qingda0 266003; 2Yellow Sea Fisheries ResearchInstitute,Qingda0 266071) Abstract: Animalcellsareboundedby plasma membranes.Asafirststepin virus infection,viruses attach tospe- cificreceptorsonthe plasmamembranesof cells;Cellular receptorsplay animportantrolein virus pathogenesis.'ro study the receptorsonthecells plasmamembranes, plasmamembranesvcsicicswerepurified fromsusceptible cells. It was provedthat the purifiedplasma membraneswereuseful toolfor receptorandvirus studies.Themethodof preparationof plasmamembranesandthe applicationsof plasmamembraneswerereviewedin thisarticle Keywords:Virus Cell membrane Cell membranevesicles细胞与细胞外部环境的物质交换、能量交换和信号传递都是通过细胞膜完成的。