哺乳动物细胞分离纯化 共20页

真核哺乳动物细胞标签蛋白纯化简介哺乳动物表达系统的突出优点是表达蛋白可正确折叠以及进行糖基化等翻译后修饰，表达产物具有生物活性，已成为表达和生产蛋白质药物，基因工程抗体，疫苗抗原和研究用目的蛋白功能的首选表达体系。

哺乳动物表达体系蛋白表达的主要流程为：PCR扩增目的片段——将基因片段克隆到表达载体上——细胞转染——细胞株的筛选和培养——纯化目的蛋白解决方案1、查找目的基因序列由于引物是根据目的基因序列来设计的，所以查找到目的基因序列是设计引物的第一步。

查找目的基因序列可以在多个网站上查到，也可以在文献中查找。

这里介绍的是比较常用的NCBI网站查找基因序列的方法。

NCBI 是美国国家生物技术信息中心，网站上具有多个生物数据库，是生物学研究常用的网站。

1.1打开NCBI网站，在下拉框选择Gene，输入目的蛋白名称；（这里以p65为例）1.2 找到对应物种，也可以选择右侧框中的物种查找；1.3 页面往下拉，找到mRNA and Protein(s)，选择正确的isoform，NMxxx表示mRNA序列，NPxxx表示蛋白质序列；1.4 新页面往下拉，点击CDS，点击右侧FASTA，即可得到目的基因的mRNA序列，复制粘贴到新的文本，以备使用。

2、选择合适的表达载体常用的真核表达载体有pCMV，pcDNA等。

表达载体一般包括启动子，多克隆位点，抗性基因，标签基因等等。

表达载体的选择原则：1）启动子是否为真核启动子；2）标签基因是否是我们需要用的标签。

常用的标签的标签有His，GST，MBP，Strep，Flag标签等，标签选择如下：3、设计引物设计引物也有多个软件可以使用，这里介绍的是常用的Primer 5软件。

设计引物的基本原则是：1）引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp；2）引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；3）引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右；4）3'端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T，否则容易导致错配；5）以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。

动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定郝春霖（武汉大学药学院，2009302590232）摘要：采用盐溶法和有机溶剂抽提分离纯化猪肝基因组DNA，并利用紫外吸收和二苯胺显色法进行核酸定量和纯度测定。

制备的样品A260/ A280值在1.8附近，纯度较高。

但由紫外吸收法数据计算出样品DNA浓度远大于二苯胺显色法的计算结果，本文对数据差异做了相关讨论。

Abstract：The genomic DNA of poker liver were isolated and purified by salting-in and organic agent extraction method. In order to determine the quantitative and to test the fineness of our sample, it has been reacted with diphenylamine to produce the color product and exposed to the UV to find its O.D value. The A260/ A280 value of the sample is about 1.8, which indicates itself highly purified. However, the data of the two different methods are so different that it confuses us. This essay discusses the differences deeply and analyzes the reasons for the results.关键词：猪肝盐溶法抽提基因组DNA 紫外吸收法二苯胺Key words:poker liver salting-in method extract genomic DNA UVpcx diphenylamine引言：制备组织基因组DNA在基因结构和功能的研究中扮演着重要角色，是分子生物学研究中最重要的实验操作技术之一，样品分离纯化的程度对后续实验结构起到决定性作用；而不同种类生物的基因组DNA提取方法各异，同一生物的不同组织或器官也因其细胞结构及成分差异，而需采用不同的提取方法。

兔胸腺HMGN2的分离纯化鉴定【摘要】目的：分离纯化鉴定兔高迁移率非组蛋白N2(High mobility group chromosomal protein N2, HMGN2)。

方法：利用液氮研磨和5%高氯酸从新鲜兔胸腺组织获得酸溶性萃取物，经反相高效液相色谱（RP HPLC）分离得到HMGN2，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting对HMGN2进行分子量测定和特异性鉴定。

并利用琼脂糖弥散抑菌实验对其杀菌活性进行鉴定。

结果：利用上述方法分离纯化出高纯度的兔HMGN2。

对大肠埃希菌临床分离株54080、大肠埃希菌ATCC25922有明显杀菌活性。

结论：建立简单分离高纯度的HMGN2的方法。

【关键词】兔胸腺；HMGN2；分离高迁移率非组蛋白(High mobility group chromosomal protein, HMG)是脊椎动物和非脊椎动物的细胞核中含量最为丰富的非组蛋白家族[9]，这一家族的成员普遍存在于高等真核生物中，目前HMG蛋白分为三个亚家族，分别为HMGA、HMGB和HMGN。

HMGN2为HMGN亚家族的成员，其基因位于染色体1q35,相对分子质量为，共由90个氨基酸组成。

已有研究表明，HMGN2结合于染色体的特异部位，是染色体纤维构成必不可少的部分[2,3]，参与DNA的复制和转录[1]，与转录活性基因有关[5]，能解开致密染色体的折叠结构从而有利于复制和转录的启动[6]。

本实验室首次发现HMGN2具有明显的抗菌活性[4]。

为了进一步研究HMGN2的生物学功能，我们利用琼脂糖弥散抗菌法鉴定内源性抗菌肽的方法，分离纯化兔胸腺HMGN2。

1 材料和方法实验材料主要材料:兔胸腺，致病性大肠埃希菌临床分离株54080、大肠埃希菌ATCC25922。

主要试剂:丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，TEMED，蛋白质Marker为Merck产品；Tris、Tricine、琼脂糖、大豆培养基、三氟乙酸、溶菌酶、牛血清白蛋白（BSA）为Simga产品；乙腈为Fisher 产品；抗HMGN2多克隆抗体为Upstate产品；色谱纯水为Millipore 超纯水；考马斯亮兰R250为上海试剂厂进口分装产品；反应试剂盒BCA Protein Assay Kit为PIERCE公司产品；其余试剂为国产分析纯。