原代细胞分离纯化SOP

1. 目的建立原代细胞制备操作规程，以保证试验的顺利进行和制备的细胞生长良好，满足检验和试验需要。

2. 范围适用于实验室原代细胞的制备，如：牛肾原代细胞、牛睾丸细胞制备等。

3. 职责3.1. 质量管理部：负责本规程的起草。

3.2. 质量管理部QC人员：负责本规程的实施。

3.3. 总经理：负责本规程的审批。

4. 定义无5. 引用标准无。

6. 材料6.1. 材料准备：6.1.1．细胞培养液：见《细胞培养液的制备SOP》。

6.1.2．EDTA－胰酶：见《胰酶的制备程序》6.2．实验器具6.2.1．手术器械：眼科剪、眼科镊、手术剪、手术刀、镊子、止血钳等。

6.2.2．玻璃器皿：大平皿、三角烧瓶250ml（含盖）、三角烧瓶（含盖）500ml、烧杯（含盖）100ml、烧杯500ml（含盖）、烧杯 1000ml（含盖）、注射器、离心管（含盖）、玻璃漏斗、吸管、玻璃珠等。

6.2.3．对以上器材按其性质高压蒸汽消毒或干烤消毒6.2.4. 消毒纱布6.3．仪器6.3.1．36℃培养箱培养用6.3.2 普通冰箱贮藏试剂用7. 流程图无8. 内容8.1. 取材：无菌采取代细胞的动物组织，置于消毒器皿中。

8.2. 漂洗：用灭菌培养液反复清洗组织，后移入洁净区内。

将组织在500单位双抗菌素溶液中浸泡三次，浸泡时间分别为20min和30min。

8.3. 剪切：剪去组织被膜，然后剪下组织的所需部分，放入PBS液反复漂洗除净血渍。

将洗净的组织块移入小烧杯中，用剪刀剪成0.5-1.0mm2小块。

8.4. 消化：收集剪切后的组织小块，移到装有小玻璃珠的三角烧瓶中，用PBS液洗1-2次，加入沉淀量5-8倍量的0.25%胰蛋白酶37℃作用30-60min。

8.5. 制备细胞悬液8.5.1．方法一：弃去胰蛋白酶消化液，加入培养液轻摇三角烧瓶后弃去培养液，以降低消化液的浓度，加入培养液后剧烈摇动三角烧瓶使小玻璃珠冲击组织小块分离细胞制取细胞悬液，吸取上清细胞悬液，再加入培养液，再继续摇三角烧瓶收集上清细胞悬液，反复数次，把所收集的细胞悬液混合到一起，分到细胞培养瓶中。

原代细胞分离培养原代细胞分离培养的原理是利用组织和器官中的细胞在体外适宜的条件下进行分离、纯化和培养的过程。

以下是所需试剂、耗材和实验仪器：1.试剂：包括胰蛋白酶、胶原蛋白酶、DMEM培养基、胎牛血清、双抗等。

2.耗材：培养瓶、培养皿、离心管、细胞筛、移液管、吸管等。

3.实验仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、粉碎机、冷冻冰箱、计时器等。

在开始实验之前，需要做好以下准备工作：1.清洁实验室：实验室内需保持清洁，所有的实验器材和器具必须经过高压灭菌处理。

2.灭菌处理：实验中所使用的所有试剂和器材都需要进行灭菌处理，以确保无菌操作。

3.准备培养基：根据实验要求准备好相应的培养基，加入一定比例的胎牛血清和双抗，混合均匀后储存备用。

4.制备组织块：将从人体或动物体内取得的待分离组织进行处理，去除筋膜、脂肪等杂质，修剪成适宜大小的组织块。

以下是原代细胞分离培养的具体步骤：1.组织块的消化：将组织块放入粉碎机中进行粉碎，然后用胰蛋白酶或胶原蛋白酶进行消化处理。

2.细胞过滤：将消化后的组织溶液通过细胞筛进行过滤，以去除未消化彻底的细胞团块和杂质。

3.细胞离心：将过滤后的细胞溶液进行离心处理，以去除上清液，收集沉淀的细胞。

4.细胞接种：将收集到的细胞接种到培养瓶或培养皿中，加入准备好的培养基，放入细胞培养箱中进行培养。

5.细胞传代：待细胞生长至一定密度后，可以通过胰蛋白酶进行细胞传代，将细胞继续培养或冻存备用。

注意事项包括：1.无菌操作：整个实验过程需在无菌环境下进行，所有的操作都需要用酒精灯进行灭菌处理，避免污染细胞。

2.细胞的活性：在分离和培养细胞时，需要保证细胞的活性，避免长时间的低氧、低营养环境。

3.细胞的冻存：如果需要长时间的保存细胞，应该将细胞冻存在-80℃的冰箱中，同时加入适当的冻存液进行保护。

4.细胞的复苏：冻存的细胞在复苏后需要进行活力检测，以确保细胞的存活率。

5.质量控制：用于细胞分离和培养的试剂、器材等都应该经过严格的质量检测和控制，以确保实验结果的可靠性。

原核抗原生产转化1取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化；2融化后100μl 感受态细胞加入约20ng 质粒DNA冰浴30min3热击：将离心管放置42 ℃水浴，热击90 秒，注意：勿摇动离心管；5．冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置 1 －2 分钟；6．复苏：每管加500μl LB培养基，在37 ℃摇床温和摇动温育45 分钟，使细菌复苏；7．涂皿：取适当体积均匀涂布于含有抗生素的平板上8．培养：倒置培养皿，于37 ℃培养过夜小量诱导1取5ml相应抗性的LB培养基于灭过菌的试管中2挑菌：用已灭菌牙签挑取转化的细菌单个菌落与1中，37℃培养3当试管中的细菌OD达到0.4-0.6时加入1mM的IPTG继续培养两个小时4收集3中细菌送QC做蓝染或者WB检测大量诱导37℃大量培养细菌，当od值达到0.4-0.6时用IPTG诱导，诱导7个小时候收菌，用生理盐水洗涤后离心取去上清，于-20保存。

Ni柱纯化（上清）1、镍琼脂糖凝胶FF 装柱2、用缓冲液50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl 10mM咪唑平衡5-20 个床体积3、将细菌破碎于(50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl)缓冲液中0.45 μm 滤膜过滤，上样，4、用缓冲液50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl再洗5-20 个床体积5、用分别含50、100、150、250mM mM 咪唑的缓冲液进行阶段洗脱，收集，用SDS-PAGE 检测融合蛋白的分子量大小和纯度6、用纯水流洗5 个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3 个柱床体积，柱子置于+4~8℃环境中保存Ni柱纯化（包涵体）1将细菌破碎于(50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl，10mM咪唑)中，在使用前加入1mM PMSF （每250毫升裂解液中加入约50克菌体，工作15s，间隔15秒，超声破碎45分钟，室温放置20分钟，16000RPM离心30分钟，保留沉淀）2用STE（50mM Tris-HCl, pH 8.0，150mM NaCl，1mM EDTA）洗涤包涵体三次3用STE+1%的tritonX100洗涤包涵体三次4用STE+2MNacl洗涤包涵体三次5用STE+ 2%的脱氧胆酸钠洗涤包涵体三次6用STE+2M尿素洗涤包涵体2次（每次洗涤完后10000rpm离心10min）7用（50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl，10mM咪唑，6M盐酸胍）过夜溶解包涵体8把溶解的包涵体16000转30min离心去沉淀，上清用0.45milipor滤器过滤上样三遍（若溶解效果不好，加入5mMDTT 在50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl，10mM咪唑，6M盐酸胍溶解，装入透析袋，在50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl，10mM咪唑8M尿素中透析，去掉DTT，再进行His柱纯化）9用缓冲液（50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl，10mM咪唑，6M盐酸胍)淋洗5-20 个床体积10. 用缓冲液（50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl，10mM咪唑，6M尿素)淋洗5-20 个床体积10用分别含50、100、150、250mM mM 咪唑的缓冲液进行阶段洗脱，收集，用SDS-PAGE 检测融合蛋白的分子量大小和纯度包涵体His柱上复性（常用）柱料：Chelating Sepharose Fast Flow（His柱）稀释buffer1：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；8MUrea稀释buffer2：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；10%甘油；0.1%PEG20000；0.3%Tween20复性buffer1：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；2MUrea；10%甘油；0.3%Tween20；10mM咪唑复性buffer2：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；1.5MUrea；10%甘油； 0.3%Tween20； 10mM咪唑复性buffer3：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；1MUrea；10%甘油；0.3%Tween20 ；10mM咪唑复性buffer4：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；0.5MUrea；10%甘油； 0.3%Tween20 ；10mM咪唑复性buffer5：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；0MUrea；10%甘油；0.3%Tween20 ；10mM咪唑淋洗buffer：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；10mM咪唑洗脱buffer：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；250mM咪唑洗脱液经SDS-PAGE检测纯度和大小。

原代细胞分离实验安全操作及保养规程背景介绍原代细胞分离实验是一种在生物医学研究和治疗方面广泛应用的技术。

它可用于获得细胞样本和制备细胞培养物，具有广泛的应用前景。

然而，与细胞分离实验相伴随的安全风险也需要引起重视。

本文档旨在提供原代细胞分离实验的安全操作规程和细胞培养物的保养规程，以确保实验室人员和实验物品的安全。

实验室安全操作规程1. 实验室安全标准实验室应遵守研究所或实验室的安全规章制度。

实验人员应接受必要的培训和指导，学习实验室的安全标准和操作规程。

实验人员应穿戴个人防护装备，如手套、实验外套、面罩等，以减少对人体的伤害和交叉污染的风险。

2. 原代细胞分离前的准备在进行原代细胞分离实验前，必须进行适当的准备和清洁操作。

这包括：•准备无菌工作台。

细胞分离实验需要在无菌环境下进行，以减少外源性细菌和病毒的污染。

实验室应配备无菌工作台，并在实验前进行消毒。

•准备实验仪器和材料。

细胞分离实验涉及使用各种实验仪器和材料，如离心机、显微镜、培养皿、移液器等。

在实验前应对这些仪器和材料进行适当的清洁和准备工作。

•准备培养基和试剂。

细胞分离实验需要使用特定的培养基和试剂，实验前应准备好这些材料，并确保其无菌和正确使用。

3. 原代细胞分离实验的操作规程原代细胞分离实验可以根据具体的实验需要进行多种操作，包括：•细胞消化。

细胞消化是分离细胞的主要方法之一。

在细胞消化过程中，细胞需要暴露于特定的酶消化液中，以在短时间内分离细胞。

在消化过程中，需要注意以下安全要点：–酶消化液必须是新鲜的，并使用刚刚打开的试剂瓶。

–完全消化需要时间，需要根据实验要求进行消化时间的精确确定。

–消化液中的酶可能会刺激皮肤和眼睛，使用时应戴上手套和面罩。

•细胞驯化。

分离后的细胞通常需要适应无血清的培养conditions，这个过程称为驯化。

在驯化细胞的过程中，需要注意以下安全要点：–无血清培养基可能含有病毒，因此应谨慎操作和使用防护装备。

CD4细胞分选实验计划Dynabeads洗涤（Dynabeads使用前必须清洗）1.重悬瓶中Dynabeads2.转移需要量的Dynabeads到离心管，200ul×32只×2个时间点=12.8ml，一次6.4ml，分7管洗涤。

3.加入同样体积的Buffer 1，或者至少1ml，混匀4.将离心管放在磁力架上1min，弃去上清5.移去磁力架，同样体积的Buffer 1重悬Dynabeads样品准备1x107淋巴细胞，细胞悬液体积100ul细胞分离关键步骤1.使用能提供离心和倾斜的混匀器，确保Dynabeads不会沉淀于管底2.每1x107淋巴细胞所用的Dynabeads不得少于200ul3.严格按照磁力架建议，确保成功分离从小鼠脾或淋巴结中分离CD4+T细胞本操作流程基于1x107淋巴细胞，可分离1x107至1x107个细胞。

1.将100ul(1x107)淋巴细胞（悬于Buffer 1）加入离心管中2.加入20ul热失活的FCS, 加入20ul抗体混合液3.混匀，孵育2-8℃，20min4.加入2ml Buffer 1洗涤细胞。

通过倾斜离心管多次来混匀细胞，离心300 xg，8min，4℃。

弃去上清5.800ul Buffer 1重悬细胞6.加入200ul 已洗涤过的Dynabeads7.孵育15min，18-25℃。

轻柔地倾斜离心。

8.轻轻抽吸5次以重悬磁珠结合的细胞（1000或5ml头）9.加入1ml Buffer 110.静置在磁力架上2min, 转移上清到新管中，上清中即为阴性选择的小鼠CD4+T细胞。

细胞培养标准操作程序（SOP）细胞培养标准操作程序（SOP）1．⽬的：为了保证培养细胞的正常⽣长，实验技术⼈员必须明确并正确执⾏细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。

2．适⽤范围：适⽤于来我院细胞室进⾏细胞培养⼯作的⼈员。

3．操作规程：3.1 培养液、PBS、胰蛋⽩酶的配制3.1.1 1000ml培养液的配制1、准备⽤品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电⼦分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸⽔（或新鲜反渗⽔）、NaHCO3粉、1000ml⽆菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。

紫外线照台30min。

2、将培养粉⽤900ml新鲜三蒸⽔（或新鲜反渗⽔）溶解，并冲洗袋内残留粉末。

3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen 公司的DMEM 需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌。

⽆需加⾕氨酰胺，因该培养基⾥已含有。

4、⽤1M（1mol/L）HCl 调PH⾄7.0左右（细胞适宜在PH7.2～7.4⽣长，配制好后PH值会升⾼0.2～0.3，故配时调PH⾄7.0左右）。

5、⽤新鲜三蒸⽔（或新鲜反渗⽔）定容到1000ml。

6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏⽔溶解配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏⽔溶解取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加⼊到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。

7、在⽆菌操作台⾥⽤0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶⼝⽤薄膜封⼝，盖上橡⽪塞，放-20℃保存备⽤。

注意：（1）配制培养液及调节培养液PH值所使⽤的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸⽔（或新鲜反渗⽔）配制。

⼀般于配制当天制备，以保证⽔的纯度和质量。

（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先⾼压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸⽔（或新鲜反渗⽔）的容器均不需⾼压灭菌，⼲净即可。

原代细胞纯化方法嘿，你问原代细胞纯化方法啊？那咱就来好好唠唠。

这原代细胞纯化呢，可不是一件容易的事儿哦。

一种方法是差速贴壁法。

就像挑选手下的兵一样，得把好的留下来，不好的去掉。

先把原代细胞悬液放到培养瓶里，让细胞在里面待一会儿。

这时候不同类型的细胞贴壁的速度不一样哦。

有些细胞贴得快，有些细胞贴得慢。

等一段时间后，把还没贴壁的细胞轻轻倒出来，这样就把贴壁快的细胞和贴壁慢的细胞分开啦。

就像把跑得快的人和跑得慢的人分开一样。

还有一种方法是密度梯度离心法。

这就像在玩一个分离游戏。

准备一种特殊的溶液，把细胞放进去，然后用离心机转一转。

不同的细胞在溶液里的位置不一样，就像不同的东西在水里会浮起来或者沉下去一样。

这样就可以把想要的细胞分离出来啦。

另外呢，免疫磁珠法也挺好用。

就像给细胞贴上小标签，然后用一个有磁性的东西把有特定标签的细胞吸出来。

先准备好带有特定抗体的磁珠，让磁珠和细胞混在一起。

那些有特定抗原的细胞就会和磁珠结合在一起。

然后用一个磁铁把结合了磁珠的细胞吸出来，这样就纯化了想要的细胞啦。

我给你讲个例子哈。

有个实验室的小伙伴，他要纯化一种原代细胞。

他先试了差速贴壁法，把细胞放到培养瓶里，等了一会儿，倒出没贴壁的细胞。

但是效果不是特别好。

然后他又试了密度梯度离心法，准备好溶液，用离心机转了转。

哇，这次效果好多了，分离出了比较纯的细胞。

最后他还试了免疫磁珠法，用带有特定抗体的磁珠，成功地纯化出了他想要的细胞。

他可高兴了，觉得这些方法虽然有点麻烦，但是真的很管用呢。

所以啊，原代细胞纯化方法有很多，要根据不同的情况选择合适的方法哦。

原代细胞分离方法
原代细胞分离主要有两种方法：机械分散法和消化分离法。

机械分散法适用于纤维成分很少的脑组织、部分胚胎组织等。

具体步骤如下：
1. 将组织剪碎至1mm3的组织块。

2. 用PBS清洗两次，然后用吸管吹打分散组织细胞，或把已充分剪碎分散
的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出。

3. 收集细胞转入离心管中，以1000rpm/分钟离心5分钟。

4. 去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。

消化分离法适用于细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。

具体步骤如下：
1. 用Hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。

再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。

2. 加入%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜。

次日再用Hanks液洗涤，弃去
上清，共洗2-3次。

3. 加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。

以上是原代细胞分离的两种主要方法，可以根据实际需求和实验条件选择合适的方法进行操作。

原代细胞提取将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

原代细胞培养的步骤一般是：取材→分离→培养和维持，今天我们重点介绍原代细胞的取材和分离方法。

原代细胞是通过一定的方法如酶法或机械法或生长法使细胞从人体和动物的母体器官、组织或液体中分离出来，并在受控环境条件下分离的细胞在体外或其他人体和动物体内生长。

原代细胞的提取方法详细步骤：1.整个操作要在洁净通风的超净台下进行，所有的器材要高压消毒。

2.根据BALB/c小鼠的体重，将小鼠置于盛有75%乙醇的烧杯内，这一步不仅可以消毒，也可以让小鼠体毛浸湿，后续剃去皮毛的时候不会沾到剪刀或组织上。

3.用镊子轻轻挑起小鼠的心脏，装有PBS的注射器插入心尖，同时在右心耳处剪开一个小口，缓慢推动注射器，随着心脏的跳动，将体内的血液冲洗出来。

4.取出小鼠的肺部组织，将肺组织切成小米粒样的大小，置于预冷的HBSS中反复冲洗几次。

5.将小米粒大小的肺组织置于培养瓶中（培养瓶前一天用1%明胶溶液包被培养面，4度过夜，小鼠处理前，将培养瓶放置培养箱中，使其温度恢复至37度），置于培养箱37度的环境下，消化4个小时。

6.消化4小时后，加入培养基（添加培养基，可以是正常培养时的2倍量），继续培养24小时（继续培养的时间可根据细胞贴壁情况适当调整）。

7.24小时后，取出肺组织，镜下观察细胞状态，换液。

8.原代细胞的提取和培养是很慢的过程，一般需等到24小时后，才能在镜下看到些许细胞群，一周到两周后才会看到鹅卵石样的排列情况。

9.原代细胞2-3天换液一次，因为内皮细胞生长形成单层时，会出现接触抑制现象。

所以，内皮细胞生长接近单层时就可以传代了，不要等到长得非常满。

PBS溶液，0.9%生理盐水, DMEM，器材：剪刀，烧杯，保温瓶，原代细胞的取材一、取材的基本要求（1）取材要注意新鲜和保鲜新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h 内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。

若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。

对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜 (DMSO) 的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。

（2）取材应严格无菌所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。

要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。

（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。

（4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。

（5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。

取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。

（6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。

对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。

原代细胞的分离和制作人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：一、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞．二、实体组织材料的分离方法（一）机械分散法所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。

肝细胞原代培养
实验用品
1.仪器与用品：倒置相差显微镜显微镜，离心机，试管，移液枪，培养皿，手术刀片，注
射器，眼科剪，真空泵
2.试剂：DMEM高糖细胞培养液（Hyclone），PBS（自配），0.25%胰酶（碧云天）
3.材料：成年大鼠（军事医学科学院动物房）
实验步骤
1. 按照约50g/kg大鼠为大鼠注射麻醉剂,待其昏迷后，置75%酒精中浸泡3min，剖取大鼠肝脏，置于玻璃皿中，分成小块，剔除脂肪、结缔组织等杂物。

2. 取1ml PBS于培养皿中清洗肝脏组织，洗完后吸去PBS，然后再用1ml PBS清洗一次。

3. 用眼科剪刀反复剪碎肝组织，直至剪成1mm3大小的组织块
4. 加入2ml胰酶消化，放于37℃培养箱中20min。

消化十分钟时拿出来摇晃一次。

5. 镜检，待细胞从组织解离。

将消化液全部转入10ml离心管中，再加入1ml培养基终止胰酶消化，在2000 rpm下离心3 min
6. 离心后，用枪吸去上清，加入3 ml培养基重新悬浮，静置。

7. 静置后，吸出上清至另一10 ml离心管中，在2000 rpm下再离心3 min
8. 弃去上清，小心收集离心管底细胞，加入5 ml新鲜培养基重新悬浮，接种到新培养皿中，标记后，放于37℃培养箱中培养。

实验结果
大鼠原代肝细胞
1。

原代细胞的分离与培养实验怎么做？
原代细胞是出了名的难养，对培养环境和实验操作的要求更苛刻。

原代细胞在体外通常只能传代少数几次，某些原代细胞（如神经元细胞）甚至无法进行传代。

对于研究人员来说，如何才能经济高效地培养好原代细胞，并围绕这有限几次传代的细胞设计实验，是更大的一个挑战。

原代细胞是取材于切除的动物组织，通过酶处理，在适当的条件下培养直至达到足够的数量。

分离的原代细胞有两种类型：贴壁细胞（锚定依赖性生长）和悬浮细胞（锚定非依赖性），贴壁细胞多来自器官组织，而悬浮细胞多来自血液系统的细胞。

从组织制备原代细胞，即使捱过了极其严苛的解离步骤，不严谨的分离操作可能会导致细胞生长缓慢、表型不一致甚至细胞污染，特别是由于组织中可能含有细菌等微生物，污染问题对于原代细胞的分离和培养是一个很大的隐患。

而为了让研究人员不再为这些问题头疼，现在已经出现了一些细胞公司可供应现成的原代细胞，并对应配有充分优化的培养基和实验方案，这使得原代细胞的培养和研究比以往要轻松得多。

而对于具备自主从组织中获取原代细胞的实验室，也建议以商业化的原代细胞作为对照，采用均一性和稳定性更好的P2/P3代次进行实验，并用专门的原代细胞培养基进行培养，最大限度提高原代细胞的生长。

上海生物样本库最佳实践规范及标准操作流程文件汇编（第二版）2010年5月上海生物样本库质量管理体系文件文件名称 核酸提取和纯化控制程序 编号 SOP-SC-030-01 批 准 人 批准日期 实施日期核酸提取和纯化控制程序1.目的规定DNA和RNA核酸样本提取和纯化实验应遵守的操作。

2.适用范围从人体体液、细胞、组织等标本大批量提取和纯化DNA和RNA。

，并包括对核酸样本的长期保存。

3.定义和术语3.1 DNA Deoxyribonucleic Acid即脱氧核糖核酸,是遗传信息储存及传递者。

3.1 RNA Ribonucleic Acid由脱氧核糖核酸（DNA）为模板转录合成的核糖核酸的片断。

4.职责4.1 样本库实验技术员负责从不同样本中提取和纯化DNA和RNA。

5.设备和器材见正文内容6.正文6.1 实验室设置6.1.1在实验室内，试剂贮存，核酸提取，核酸质量控制以及核酸样本保存的区域应相互隔离。

严禁不同工作区内的设备物品如加样器、试剂等的移出移进造成不同的工作区间发生交叉污染。

6.1.2进入各个工作区的所有人员和物品必须遵循严格的顺序，只能按单一方向进行，即从试剂贮存和准备区→提取区→质量分析区→标本保存区。

6.1.3工作人员穿着的工作服应经常洗涤，尽量避免不同工作区内的工作服相互混穿，造成污染。

同时，应假定样本可能含有病原微生物，样本DNA提取工作应参考P2级实验室操作规范进行。

6.2 工作区域功能和设备6.2.1 试剂贮存和准备区该工作区用于贮存溶液的制备、溶液的分装。

本工作区仪器设备配置应包括如下：A. 4℃冰箱和-20℃冰箱、混匀器、微量加样器（覆盖1～1000μl各个容量的加样器）、生物安全柜（带紫外灯）；B. 专用办公用品、专用工作服和工作鞋；C. 消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头等。

6.2.2 提取区该工作区用于标本贮存、核酸提取。

本工作区仪器设备配置应包括如下：A. 4℃冰箱、－20℃冰柜、高速台式冷冻离心机、混匀器、水浴箱或加热模块、微量加样器（包括1～1000μl各个容量的加样器）、可移动紫外灯（近工作台面）；B. 超净工作台和超声波水浴（处理大分子DNA）,专用办公用品、专用工作服和工作鞋；C. 消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头等。

原代rBMSCs分离、培养、扩增和冻存复苏(1) 将1周龄Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠）断颈处死，室温下浸泡于75%的酒精中20分钟。

(2) 将浸泡后的大鼠置于超净台中，解剖后分离肌肉，尽量将组织去净，获得双侧股骨及胫骨。

(3) 用组织剪剪断股骨及胫骨两侧的干骺端，保留股骨干及胫骨干。

(4) 用5ml注射器吸取完全培养基，反复冲洗骨髓腔直至骨髓腔变白，将冲洗后的培养基收集于15ml离心管中。

(5) 将含有骨髓组织的悬液通过100μm的滤网，滤去组织块。

(6) 离心滤过后的骨髓细胞悬液，转速为1000转/分钟，5分钟，可见暗红色沉淀。

(7) 弃去上清后，用3ml完全培养基重悬细胞，吹打混匀。

调整细胞密度后，分装入T25瓶中，标记为P0代，放至37℃，5%CO2浓度的培养箱中继续培养。

(8) 培养12h后进行首次换液，将原有培养基全部倒掉，并缓慢加入新培养基。

24h后进行第二次换液，倒掉全部培养基并加入新培养基，随后每两至三天换液一次，在细胞密度为80%-90%时传代。

(9) 细胞传代：传代时，弃掉培养基，用PBS清洗3遍后，加入0.25%的胰蛋白酶进行消化，消化时置于培养箱中。

2分钟后，加入等比例的完全培养基中止消化作用。

吹洗贴壁的细胞，并转移至15ml离心管中，以1000转/分钟的转速离心5分钟。

弃去上清后，用完全培养基重悬细胞团块。

进行细胞技术后，按合适比例转移至10cm培养皿或T75瓶中，标记为P1代，放入培养箱中继续培养。

随后根据细胞密度进行换液或传代，取P2至P5代状态良好的细胞进行实验。

(10) 细胞冻存：取生长密度约80%且状态良好的P2代rBMSCs进行冻存。

消化细胞并离心（与上述步骤相同），弃去上清后，加入适量细胞冻存液进行重悬，随后将细胞悬液分装至标有细胞名称、细胞数量和冻存时间等信息的冻存管中。

将冻存管放入梯度降温盒中，置于-80℃冰箱中24h后转移至液氮中。

(11) 细胞复苏：提前将水浴锅升温至37%。

原代细胞纯化方法步骤原代细胞分离的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法，下面我们就介绍酶解聚方法获得纯化的原代细胞。

（1）胰蛋白酶纯化法●在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4 mm小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。

让组织碎片沉淀，去除上清液。

重复清洗2到3次。

●将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。

加入0.25%溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100 mg组织加入1ml 胰蛋白酶）。

●在4℃孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。

●移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。

●在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。

如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。

●通过无菌不锈钢丝网（100～200 mm）过滤，分散所有剩余组织。

计数和接种细胞，进行培养。

（2）胶原酶纯化法●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4 mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗组织碎片几次。

●加入胶原酶（50～200单位/ml，溶解在HBSS中）。

●在37℃孵育4到18小时。

加入3mM CaCl2增加解离效率。

●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。

如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。

●通过离心在HBSS中清洗悬液几次。

●再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。

（3）Dispase纯化法●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4 mm小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。

●加入Dispase（0.6～2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）●在37℃孵育20分钟到几个小时。

●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。

如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase。