汉防己(华西药学药化实验)

高纯度汉防己单体生物碱的制备成果与项目的背景及主要用途防己是一种重要的中药材，具有利水消肿，祛风止痛的功效。

防己中的主要成分汉防己甲素为双苄基异喹啉类生物碱，具有消炎、镇痛、降压、抗矽肺等作用。

随着细胞分离技术及分子生物学研究的长足发展，药理研究已逐渐深入到细胞、亚细胞及分子水平，近期研究发现汉防己生物碱中汉防己甲素（Tetrandrine,Tet）是天然的非选择性钙通道阻滞剂，又是钙调蛋白的天然拮抗剂，影响钙离子的跨膜转运及在细胞内的分布，因此Tet具有更广泛的药理作用和临床应用前景，在抗肝细胞纤维化、缺氧性肺动脉高压的防治、特别是逆转肿瘤化疗多药耐药性方面引起了人们的高度重视。

目前市场上汉防己甲素的制剂有片剂和水针剂，均为地标升国标品种，存在质量标准低、质控方法简单的不足；另外，为保证主药的稳定，水针剂中加有大量抗氧化剂和络合剂，影响了临床用药安全。

因此我们采用新的原料药提取工艺，建立高纯度的汉防己甲素质量标准；改变了传统的水针剂型，开发新的冻干粉针剂，使主药贮存更加稳定，且不含任何稳定剂，增加了临床用药的安全性。

汉防己含有汉防己碱、防己诺林碱、甲基粉防己碱、二小檗胺、轮环藤酚碱等生物碱，由于结构和性质接近，分离纯化比较困难。

现有方法存在如下问题：1)提取中多数工艺需要在开放环境中大量使用强毒性的溶剂苯、氯仿等，对操作人员和环境的危害很大；2)活性炭脱色时样品损失较多；3)方法复杂，可操作性差，生产成本较高。

为此，我们建立了树脂法分离纯化工艺，改变了传统合成大孔吸附树脂的方法，引入疏水作用、偶极作用、氢键作用、功能基团的化学作用等多重作用的相互协同，合成一类弱极性吸附树脂，用于汉防己中甲素和乙素生物碱的分离，制备含量高于98%的汉防己甲素原料药。

技术原理与工艺流程简介通过改变共聚单体、致孔剂、交联剂的种类和用量，合成了一类非聚苯乙烯骨架的大孔吸附树脂，同时在聚合过程中可将所需功能基引入树脂骨架上。

实验本科实验药化I
天然药物化学实验教学进度（36学时）
实验时间：星期二、五上午10：00
实验地点：实验中心楼303, 305室
教师：熊娟（51980171）、俞媚华（51980146）、达慎思（51980151）助教：
实验项目：汉防己生物碱的提取、分离和鉴定
3/5，3/8：实验室安全规范及绪论
领取并清洗实验用仪器
汉防己生药乙醇一次提取
3/12，3/15：汉防己生药二次乙醇热提取及生物碱盐酸盐的制备
3/19，3/22：脂溶性叔胺生物碱的制备
3/26，3/29：脂溶性叔胺生物碱的纯化1
4/9，4/12：脂溶性叔胺生物碱的纯化2
4/16，4/19：生物碱的结构鉴定
交实验报告和产品/交还实验仪器、打扫卫生。

响应曲面法优化防己中汉防己甲素及汉防己乙素的提取工艺【摘要】本研究利用响应曲面法优化了防己中的汉防己甲素和汉防己乙素的提取工艺。

在实验设计阶段，我们确定了最佳的实验条件，并进行了实验步骤的实施。

通过数据分析，我们发现优化后的提取工艺显著提高了汉防己甲素和汉防己乙素的提取效率。

结果讨论部分解释了各实验条件对提取效果的影响，同时分析了影响因素。

总结指出了本研究的意义，并展望了未来在提取工艺优化方面的研究方向。

本研究为提高防己中汉防己甲素和汉防己乙素的提取效率提供了重要的指导和参考。

【关键词】响应曲面法、优化、防己中汉防己甲素、汉防己乙素、提取工艺、研究背景、研究意义、实验设计、实验步骤、数据分析、结果讨论、影响因素分析、总结、展望。

1. 引言1.1 研究背景防己中含有众多活性成分，其中防己甲素和防己乙素被认为是其主要活性成分。

这两种化合物具有广泛的药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种功能。

防己中这些活性成分的提取工艺存在诸多问题，比如提取效率低、操作复杂、耗时耗力等。

寻找一种快速高效的提取方法成为当前研究的重点之一。

响应曲面法是一种常用的优化实验设计方法，能够通过建立数学模型，快速寻找最佳工艺条件。

在防己活性成分的提取过程中，响应曲面法具有很大的应用潜力。

通过优化工艺条件，可以提高提取效率，降低成本，减少对溶剂的浪费，实现绿色可持续的生产。

本研究旨在利用响应曲面法优化防己中防己甲素和防己乙素的提取工艺，提高提取效率，降低成本，为防己活性成分的生产提供技术支持。

通过本研究，可以为防己及相关药物的开发与生产提供重要的理论和实践指导。

1.2 研究意义汉防己中含有防己甲素和防己乙素等生物活性成分，具有抗菌、抗炎、抑制肿瘤等药理作用，被广泛应用于医药、保健品等领域。

当前对防己中这些生物活性成分的提取工艺仍存在一些不足，如提取效率低、操作复杂等问题，限制了其在产业化生产中的应用。

优化防己中防己甲素和防己乙素的提取工艺具有重要的研究意义。

粉防己生物碱的提取分离和鉴别粉防己为植物防己科粉防己Stephania tetrandrd S.Moore的根，又名汉防己，是祛风解热镇痛药物，其有效成分为生物碱，主要是汉防己甲素和汉防已乙素。

汉防己生物碱具有降低血压及镇痛的作用，临床上除用作治疗高血压、心绞痛、神经性疼痛、抗阿米巴原虫外，还将粉防已生物碱的碘甲基、或溴甲基化合物作为肌肉松弛剂应用，此外汉防已甲素在动物实验中有抗癌、扩冠和解热抗炎的作用。

一、实验目的1．掌握生物碱的提取原理和实验操作方法；2．掌握生物碱的基本鉴别法；3．掌握生物碱结构与一般性质的关系；4．熟悉用柱层析分离纯化生物碱单体的方法。

二、仪器与试药（一）仪器RE-52旋转蒸发仪 SHB-循环水式多用真空泵分液漏斗（250mL）HHS型电热恒温水浴锅玻璃仪器气流烘干器圆底烧瓶（1000mL）ZF-2型三用紫外仪电热恒温干燥箱移液管（10mL、5mL）蒸发皿小玻璃蒸发器玻璃层析柱（2.0cmⅹ40cm）（二）试药粉防己乙醇盐酸氯仿无水硫酸钠滤纸丙酮中性三氧化二铝无水硫酸钠甲醇浓氨水硅胶G 凡士林脱脂棉漏斗 CMC-Na改良碘化铋钾试液汉防已甲素和汉防已乙素对照品丙酮苦味酸碘化汞钾试液雷氏铵盐试液三、主要成分的结构和性质汉防已根中总生物碱含量为1～3%，主要为汉防已甲素，含量约1～2%，汉防已乙素，含量约0.5%；轮环藤酚碱，含量为0.4%；以及其它数种微量生物碱。

轮环藤酚碱四、实验原理：1．提取：利用游离的伯、仲、叔胺生物碱具有亲脂性，能溶于乙醇的性质，用乙醇提取总生物碱；2．分离：利用水溶性生物碱（季铵类生物碱）易溶于水而难溶于有机溶剂的性质进行二者的分离；3．粉防己甲、乙素的分离：利用甲、乙素在结构上的不同（二者极性大小不同）用氧化铝柱层析来分离甲、乙素。

五、生物碱的提取分离1．总生物碱的提取、亲脂性与亲水性生物碱的分离95%乙醇300mL水浴回流提取1小时，过滤NOCH3OROCH3OCH3ONCH3CH3H HR=CH3R=H汉防己甲素汉防己乙素ONOHOCH3CH3OHOOHCH3同法提取0.5小时，过滤5～10mL浓缩物2%盐酸转移至蒸发皿中充分搅拌，残渣做生物碱反应，将滤液放在分液漏斗中先加入50mL氯仿，pH至9-10，振摇萃取，静置分层后，分出氯仿层30mL萃取1次2次，每次20mL，分出氯仿层20g无水硫酸钠，密闭，（上交）加入丙酮适量（共15mL，少量多次），水浴加热溶解，趁热倒入蒸发皿丙酮液加入中性三氧化二铝3g拌匀，水浴上小心蒸干含生物碱的三氧化二铝颗粒2．低压柱层析分离汉防已甲素和乙素低压柱层析在低压下（0.5-3kg/cm2，一般0.3-1.2 kg/cm2）采用颗粒直径介于经典柱层析（100-200μm）和HPLC（37μm）之间的薄层层析用硅胶（或氧化铝）H或G（50-75μm）作为填充剂的一种柱层析柱，其基本原理与HPLC相同，分离效果也介于经典柱与HPLC之间，用减压干法装柱，铺层紧密均匀，层析带分布集中整齐，同时薄层层析的最佳分离溶剂系统可以直接用于低压柱层析，它是一种分离效果较好，设备简单，操作方便，快速的方法。

第1篇一、实验目的1. 学习掌握汉防己中生物碱的提取方法。

2. 掌握生物碱的分离纯化技术。

3. 熟悉生物碱的鉴定方法。

二、实验原理汉防己是一种传统中药材，具有祛风除湿、利水消肿、镇痛消炎等功效。

其主要成分是多种生物碱，如汉防己碱、去甲基汉防己碱等。

本实验通过采用有机溶剂提取法提取汉防己中的生物碱，再利用低压柱层析和薄层层析等方法进行分离纯化，最后通过光谱分析等手段对分离得到的生物碱进行鉴定。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：汉防己药材、氯仿、甲醇、石油醚、硅胶、活性炭等。

2. 仪器：索氏提取器、旋转蒸发仪、低压柱层析仪、薄层层析仪、紫外可见分光光度计、红外光谱仪等。

四、实验步骤1. 汉防己药材的预处理将汉防己药材剪碎，用乙醇回流提取2小时，过滤，浓缩得到浸膏。

2. 生物碱的提取将浸膏用氯仿溶解，加入活性炭脱色，过滤，浓缩得到氯仿溶液。

3. 生物碱的分离将氯仿溶液用硅胶柱层析分离，依次用石油醚、氯仿-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，收集各个洗脱液。

4. 生物碱的纯化将收集到的各个洗脱液用旋转蒸发仪浓缩，得到生物碱粗品。

5. 生物碱的鉴定（1）紫外可见分光光度法：对生物碱粗品进行紫外可见光谱扫描，测定最大吸收波长。

（2）红外光谱法：对生物碱粗品进行红外光谱扫描，分析其官能团。

（3）质谱法：对生物碱粗品进行质谱分析，确定其分子量。

五、实验结果与分析1. 生物碱的提取通过索氏提取法，从汉防己药材中成功提取出生物碱。

2. 生物碱的分离采用低压柱层析法，将提取得到的生物碱进行分离，得到多个组分。

3. 生物碱的纯化通过旋转蒸发仪浓缩，得到生物碱粗品。

4. 生物碱的鉴定（1）紫外可见分光光度法：生物碱粗品在紫外可见光谱中具有特定的吸收峰。

（2）红外光谱法：生物碱粗品在红外光谱中具有典型的生物碱官能团吸收峰。

（3）质谱法：生物碱粗品的质谱结果显示出与其分子量相符的峰。

综上所述，本实验成功从汉防己中提取、分离和鉴定了生物碱，为汉防己的药理作用研究提供了实验依据。

汉防己甲素注射液说明汉防己甲素是从中草药粉防己的根块中提取的双苄基喹啉类生物碱，是一种天然非选择性钙通道阻滞剂，主要作用于钙离子通道，影响钙离子的跨膜转运以及在细胞内的分布利用。

研究发现汉防己甲素具有降血压、消炎、镇痛、抗纤维化、抗癌和逆转耐药等多种药理作用，临床上用于治疗肿瘤、矽肺、关节炎、高血压等疾病。

此外，汉防己甲素在保护肝细胞、抗肝纤维化、降低门静脉高压及防治门脉高压等方面具有良好治疗效果。

【成份】本品主要成份为汉防己甲素，为防己科植物粉防己（石蟾蜍）Stcphania Tctrandra Smoorc 的根中提取得到的一种生物碱。

【药理毒理】1.药理抗肿瘤药及镇痛药。

本品能提高实验动物的痛阀，具有明显的镇痛作用。

本品可使大鼠甲醛性足肿胀和关节肿胀有抑制作用。

可使大鼠急性炎症血管通透性降低，减少嗜中性白细胞游出。

其机理与抑制炎症前列腺素E的合成或释放有关。

本品可使大鼠实验性硅肺模型肺内苏丹IV及PAS阳性物明显减少和消失，肺泡间隔蛋白多糖荧光强度减弱，矽结节中心填充物减少。

本品还能通过抑制肿瘤耐药细胞表面P-糖蛋白的过度表达功能，增加化疗药物在肿瘤细胞内的积聚，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

2.毒理本品最小致死量：蟾蜍前淋巴囊注射时为1000mg/㎏～1200 mg/㎏；小鼠腹腔注射时为700mg/㎏～800 mg/㎏；家兔注射时为40mg/㎏～42 mg/㎏。

汉防己甲素可引起小鼠精子畸形率及微核率增高，对姐妹染色单体交换频率影响不大。

【抗肿瘤的临床研究】1、直接抗肿瘤作用田晖等采用MTT法测得汉防己甲素对人乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7／Adr和人口腔上皮癌耐长春新碱株KBv200及其敏感株均有程度不等的细胞毒作用，对耐药株的IC50较对应的敏感株IC50分别高2．4和1．9倍。

何琪扬等采用合盼兰计数法发现汉防己甲素对敏感急性白血病细胞株HL-60和抗三尖杉酯碱的HL-60细胞均有生长抑制作用，对抗性细胞的抑制作用强于敏感HL-60，表明抗药性细胞对汉防己甲素没有交叉抗性。

第1篇一、实验目的1. 了解汉防己生物碱的提取、分离与鉴定方法。

2. 掌握回流提取、低压柱层析等实验操作技术。

3. 学习天然产物中活性成分的提取与分离过程。

二、实验原理汉防己（Stephania tetrandra S. Moore）为防己科千金藤属植物，其根含有多种生物碱，如汉防己甲素、乙素等。

本实验采用回流提取和低压柱层析方法，从汉防己根中提取生物碱，并进行分离和鉴定。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：汉防己根粉、95%乙醇、丙酮、硅胶、氧化铝、硝酸银、氨水、氯化钡等。

2. 实验仪器：圆底烧瓶、回流装置、布氏漏斗、抽滤瓶、低压柱层析柱、超声波清洗器、电子天平、紫外分光光度计等。

四、实验步骤1. 汉防己生物碱的提取（1）称取100 g汉防己根粉，置于1000 ml圆底烧瓶中。

（2）加入500 ml 95%乙醇，回流1 h。

（3）过滤，同法提取一次，合并乙醇提取液。

（4）浓缩至干，得浸膏。

2. 低压柱层析（1）装柱：取25 cm长、内径1.8 cm的层析柱，用减压干法装硅胶约25 g（高约20 cm）。

（2）拌样加样：取汉防己碱约150 mg，加少量丙酮热溶（刚溶为度），用滴管加到1.5 g硅胶上，仔细拌匀，水浴上蒸干，碾细，通过一个长颈漏斗小心加在柱顶，轻轻垂直顿击，待样品表面平整不拌动时，上面再盖约1~2 cm高的空白硅胶，再加盖一圆形滤纸片，压紧。

（3）洗脱：开动气泵待用。

用滴管顺层析柱柱壁仔细加入溶剂，收集不同洗脱组分。

3. 汉防己生物碱的鉴定（1）紫外分光光度法：将提取的生物碱溶液在紫外分光光度计上测定其最大吸收波长。

（2）薄层色谱法：将提取的生物碱溶液点于薄层板上，与已知标准品进行对照，观察其Rf值。

五、实验结果与分析1. 提取结果：经回流提取和低压柱层析，从汉防己根中成功提取出生物碱。

2. 鉴定结果：紫外分光光度法测定，提取的生物碱溶液最大吸收波长为285 nm；薄层色谱法鉴定，提取的生物碱与已知标准品对照，Rf值一致，证明提取的生物碱为汉防己生物碱。

汉防己生物碱的提取、分离与鉴定汉防己为防己科千金藤属物Stephania tetrandra S. Mcore的根，是祛风解热镇痛药物，其有效成分为生物碱。

主要是汉防己甲素和汉防已乙素。

临床上除用作治疗高血压、神经性疼痛、抗阿米巴原虫外，还将粉防已生物碱的碘甲基、或溴甲基化合物作为肌肉松弛剂应用，此外汉防已甲素在动物实验中有抗癌和扩张血管的作用。

一、目的要求通过汉防己中几种生物碱的提取分离和鉴定，要求掌握下列知识和技能。

1．生物碱的一般提取方法。

2．纯化单体的方法及薄层层析鉴定二、已知生物碱的结构和性质汉防已根中总生物碱含量为1.5~2.3%，主要为汉防已甲素，含量约1%，汉防已乙素，含量约0.5%；轮环藤酚碱，含量为0.2%；以及其它数种微量生物碱。

1．汉防已甲素（Tetrandrine，汉防已碱，粉防已碱）无色针晶，不溶于水和石油醚，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和氯仿等有机溶剂及稀酸水中，可溶于苯，mp 216℃，有双熔点现象，自丙酮中结晶者，150℃左右熔后加热又固化，至213℃复熔。

NOCH3OROCH3OCH3ONCH3CH3H HR=CH3 R=H 汉防己甲素汉防己乙素O2．汉防已乙素（Fangchinoline, 又称防已诺林碱，去甲粉防已碱）溶解行为与汉防已甲素相似，因有一个酚羟基，故极性较汉防已甲素稍高，在苯中的溶解度小于汉防已甲素而在乙醇中又大于汉防已甲素。

籍此可以相互分离，用不同溶剂重结昌时，其晶形和溶点不同：乙醇 细棒状结晶 mp 245~40℃甲醇 细棒状结晶 mp177~9℃丙酮 六面粒状晶 mp134℃吡啶-甲醇 mp 121~2℃环已烷-EtocAc mp 156℃3．轮环藤酚碱（Cylanoline ）为水溶性季铵生物碱，不溶于极性溶剂，氯化物为无色，八面体状结昌，mp 214~6℃，碘化物为无色绢丝状结晶，mp185℃；苦味酸盐为黄色结晶，mp154~6℃。

汉防己甲素治疗尘肺的疗效及对患者免疫功能的影响摘要：目的：探讨汉防己甲素治疗尘肺的疗效及对患者免疫功能的影响。

方法：选取本院2015年12月-2016年12月间收治的88例尘肺病患为研究对象，随机分为两组，对照组给予口服尘肺宁治疗，治疗组给予口服汉防己甲素治疗。

结果：两组治疗后气紧、胸痛、咳嗽积分减少，与治疗前相比差异有意义（P<0.05），治疗组气紧、胸痛、咳嗽改善情况优于对照组，差异有意义（P<0.05）；治疗组治疗总有效率为95.5%，高于对照组75.0%，差异具有统计学意义，P<0.05；治疗组治疗后CD4、CD4/CD8上升，CD5下降，与治疗前相比，差异有意义（P<0.05），治疗组与对照组治疗后的CD4、CD8、CD4/CD8比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

结论：汉防己甲素治疗尘肺可增强呼吸功能，改善临床症状，避免发生肺部感染，疗效显著，还可调节细胞免疫功能，推广价值高。

关键词：汉防己甲素；尘肺；免疫功能[Abstract] objective：to study the han have a therapy for prevention of pneumoconiosis curative effect and its influence on patients' immune function. Selection methods：our hospital between December 2015 - December 2016 treated88 cases of pneumoconiosis patients as the research object，and randomly dividedinto two groups，control group were treated to give oral pneumoconiosis，the treatment group given oral sinomenium acutum a hormone treatment. Results：two groups after treatment integral to reduce gas tight，chest pain，cough，significant difference compared with before treatment（P < 0.05），treatment group gas tightto improve the situation is better than that of control group，chest pain，cough，significant difference（P < 0.05）；Treatment group total effective rate was 95.5%，75.0% higher than the control group，the difference is statistically significant，P <0.05；Treatment group after treatment CD4，CD4 / CD8 rise，CD5 decreased，compared with before treatment，significant difference（P < 0.05），the treatment group and control group after treatment of CD4，CD8 and CD4 / CD8 comparison，the difference was statistically significant（P < 0.05）. Conclusion：treatment of pneumoconiosis by sinomenium acutum has a can strengthen the respiratory function，improve clinical symptoms，prevent lung infection，curative effect is distinct，still can regulate cell immune function，high promotion value.Key words：sinomenium acutum own a plain；Pneumoconiosis；The immune function尘肺是因人们长期呼吸吸入粉尘，进而引发肺组织弥散性纤维化，是我国较为常见的职业病，该疾病发病率一直呈现上升趋势[1]。