免疫组化显色系统

全自动免疫组化染色仪工作过原理引言：全自动免疫组化染色仪（Automated Immunohistochemistry Stainer）是一种用于组织学研究和病理诊断的重要设备。

它通过自动化的方法实现对组织标本的免疫染色，为医学研究和临床应用提供了高效、准确的技术支持。

本文将介绍全自动免疫组化染色仪的工作原理及其应用。

一、全自动免疫组化染色仪的组成全自动免疫组化染色仪主要由样本处理模块、试剂盘、染色盘、显微镜、相机和控制系统等部分组成。

其中，样本处理模块负责对组织标本进行预处理，包括脱水、脱脂、抗原修复等；试剂盘用于存放和供应试剂；染色盘用于容纳染色液和组织标本；显微镜和相机用于观察和记录染色结果；控制系统用于控制整个仪器的运行。

二、全自动免疫组化染色仪的工作原理全自动免疫组化染色仪的工作原理可以分为以下几个步骤：1. 样本制备：将组织标本切片后，通过组织学处理方法，如脱水、脱脂、抗原修复等，使组织标本符合染色要求。

2. 抗体染色：将标本放置在染色盘中，通过试剂盘供应抗体溶液。

全自动免疫组化染色仪通过控制系统，精确控制抗体的投放量和时间，确保染色的准确性和一致性。

3. 洗涤：染色后，仪器自动进行洗涤步骤，以去除未结合的抗体。

4. 显色：通过试剂盘供应显色液，使已结合的抗体表现出可见的颜色反应。

5. 去色：洗去多余的显色液，使染色结果更加清晰。

6. 固定：通过试剂盘供应固定液，使染色结果稳定并防止褪色。

7. 观察和记录：将染色结果放置在显微镜下观察，并通过相机记录结果。

全自动免疫组化染色仪的高分辨率相机可以捕捉到细胞和组织的微观结构，为研究和诊断提供准确的图像数据。

三、全自动免疫组化染色仪的应用全自动免疫组化染色仪在医学研究和临床应用中具有广泛的应用价值。

它可以用于研究细胞和组织的免疫表型，帮助科学家了解细胞和组织的分子特征和功能。

同时，全自动免疫组化染色仪在病理诊断中也起到了重要的作用。

通过对组织标本的免疫染色，医生可以确定疾病类型、判断疾病的严重程度和预后，为患者的治疗提供准确的依据。

免疫组化显色原理
免疫组化显色是指利用免疫学原理，通过特异性抗体与抗原之间
的结合，利用染料或物质标记来标示出目标蛋白质或细胞。

在免疫组
化显色中，常使用辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等标记
物质，并且利用色素反应的原理，对标记物质进行染色。

其中，HRP染色采用的是DAB（3-3’-二氨基联苯）染色法，AP染色则使用的是
NBT/BCIP（硝基蓝/四氯化磷杂蓝）染色法。

在DAB染色法中，HRP将DAB氧化成为可见的褐色沉淀物，这种
沉淀在组织中呈现出棕色或褐色，可以被光镜观察到。

而NBT/BCIP染
色法中，AP将NBT和BCIP还原成为可见的紫色颗粒物和暗蓝色沉淀物。

这两种染色法的选择，取决于使用的抗体和实验设计的需要。

第３６卷温卅Ｉ医学院学报第２期图１ＤＡＢ＋苏木素系统显色效果欠理想，背景非特异性着色明显（×１００）。

Ｆｉｇ．１ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＤＡＢ＋Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｃｏｌｏｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｇｏｏｄ；ｉｎｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ，ｔｈｅｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｓｔａｉｎｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙ（Ｘ１００）．图２ＡＥＣ＋苏木素系统显示：胞浆阳性定位准确、清晰，与背景反差强（Ｘ２００）。

Ｆｉｇ．２ＡＥＣ＋ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｃｏｌｏｒａｔｉｏｎｓｙｓ＝ｓｈｏｗｅｄ：ｃｙｔｏｐｌａｓｍｗａｓｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｌｏｃａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｗａｓａｎｄｂｅｔｔｅｒｗｉｔｈｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ．ｆ×２００）．极强，但色彩强度略低；甲基绿复染后，虽两种色彩对比欠强，但阳性细胞仍能明显区分；核快红复染后色彩对比增强，阳性部位胞浆显示明显，背景无干扰（见图４）。

２．４几种显色系统的总体比较从显色时间，阳性部位定位，复染后背景干扰情况，显色剂和复染剂反差等进行综合比较（见表１）。

表１．显色系统的效果比较Ｔａｂｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃｏｌｏｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ注：＋表示显色效果一般；＋＋表示中等；＋＋＋表示效果最好。

一表示不能组合使用３讨论为使免疫组化结果容易识别，我们用食管下端肌间神经丛（位于环形肌和纵行肌之间）的氮能神经元作为阳性细胞。

实验结果表明，同一组织，在抗体浓度、孵育时间等条件完全相同的情况下，选用不同显色系统后，其显色效果差异很大。

尤其是对一些弱表达的抗原，用常规ＤＡＢ＇ｆＥ难清晰显示出来，因此可能产生完全相反的结果［１］，也可能在某些组织与内外源性棕黄色颗粒难区分［引，同时，ＤＡＢ系统作为实验室最常用的免疫组化显色试剂，与本实验中所选用的几种显色系统比较，其显色效果欠理想。

ＡＥＣ＋苏木素系统和４一ＣＮ＋核快红系统显色效果最佳，但该类切片只能用水溶性封片剂封图３ＡＥＣ＋甲基绿系统中，胞浆阳性显示清晰，但背景细微结构显示差（×１００）。

免疫组化实验流程及常见问题1 免疫组化概念原理2 免疫组化染色步骤目录3 结果分析4 常见问题分析※免疫组化原理PART 1免疫组化概念原理※免疫组化样本种类免疫组化概念原理免疫组化学（immunohistochemistry，IHC）应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究样本种类：组织标本和细胞标本两大类，包括石蜡切片（IHC-P）和冰冻切片(IHC-P)，细胞片(ICC)。

※实验步骤流程图※样本取材固定PART 2免疫组化染色步骤※实验步骤讲解实验流程图种器官，优先取消化器官，其次取中枢神经系统器官(脑，脊髓等)，皮肤、肌肉等可放到最后取。

3.组织块大小：未经灌注的标本组织厚度不要超过1cm 。

5.固定液量：固定液体积为组织的10倍，且组织能在容器内自由移动，不贴壁不沉底，并做好清晰标记。

4.固定液：针对不同的标本特点及实验目的一定要选用正确的固定液，4%多聚甲醛，有致密外膜Carnoy 液，活检用Bouin 。

7.固定温度：常温即可，无需冷藏，切勿冷冻结冰，否则固定液结冰形成冰晶严重破坏组织形态结构6.固定时间：6-24h最佳，固定越久所需修复强度越大，容易出现非特异性。

取材及固定切片选择要保存简单--- 选石蜡片!要速度快---选冰冻片!要结构漂亮---选石蜡片!抗原不稳定---选冰冻片!抗原稳定---石蜡片冰冻片皆可!组织形态结构保存完好顺序：新鲜组织立即投入固定液内固定石蜡切片>组织-80°冷冻后投入固定液内固定石蜡切片>新鲜组织立即投入固定液内固定冰冻切片>组织-80°冷冻后直接冰冻切片。

切多厚?脱蜡步骤石蜡片3-8um ， 一般4-5um;冰冻片5- 15pm,一般8μm水温40-45 ℃, 组织平整后玻片有油漆的一面贴近组织向斜上方提起怎么捞片?烤多久?37 ℃ 过夜或 60 ℃ 1-2h 注意:使用防脱处理的玻片实验步骤切片烤片实验步骤：灭活1内源性过氧化物酶在血管瘤、肝、胎盘、阑尾炎,坏死区域和急性炎症组织含量较高 2显色系统为过氧化物酶 (HRP )系统，该步骤建议一定要做3碱性磷酸酶 (AP )系统以及免疫荧光，该步骤可以不做4在灭活时,如组织片中出现细小且密集的气泡，表示过氧化物酶含量过高，这时用 3%H2O2溶液难以完全阻断，可以用0.5%高碘酸溶液室温条件孵育10min实验步骤柠檬酸盐缓冲液( PH6.0 )和EDTA( PH8.0或9.0)修复液经验证，对于大多数的抗体来说后者使用效果更优固定时间越久，修复强度越强旧标本修复强度强于新鲜标本3修复液的选择1 抗原修复方式4消化酶的选择需格外注意的各种消化酶的最佳工作PH值2消化酶的选择抗体选择1单抗和多抗各有优势，按需选用2 一抗4°C孵育效果最佳，备选37 ℃ 1-2h 3二抗需与一抗的种属、类别或亚类相匹配，推荐驴，山羊,绵羊等种属4二抗/SABC -般37 ℃孵育30 min 封闭1 5%BSA是最常用2血清，效果最全面3封闭血清与抗同源，与一抗不能同源封片1 DAB显色用中性树胶封片2免疫荧光建议用抗荧光衰减封片剂3 AEC显色用水溶性封片剂显色1 DAB显色液现用现配2建议镜下控制反应时间3根据显色时间反向优化实验条件※抗原定位※结果分析方法PART 3结果分析抗原定位胞膜型表达胞核型表达胞质型表达胞膜-质型表达胞核-质型表达抗原定位查数据推荐：01 Option here02Option here 评分法:通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度( 0-3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1-4分为0-25%、26 -50%、51-75%、76-100%) ，最终可以分数想加，再进行比较阳性着色细胞计数法:在40X光镜下,随机选择不重叠的3-5个视野，人工或机器计数阳性着色细胞和总细胞数，比较阳性细胞比率图片软件分析:通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用图片分析软件进行分析，然后进行统计分析即可H-SCORE分析:设置组织切片上所有的深棕色为强阳性，棕黄色为中度阳性，浅黄色为弱阳性，蓝色细胞核为阴性。

免疫组化dab显色标准
免疫组化（IHC）染色过程中，DAB显色的标准主要包括定性、定量和定位三个方面。

1. 定性判断：根据DAB标记的染色结果，判断为阳性或阴性。

在IHC片上，根据标本抗原多寡会在细胞特定部位由浅到深呈浅黄色-棕黄色-棕褐色粗颗粒。

评分为：0分（阴性，无黄色），1分（阳性，浅黄色），2分（阳性，棕黄色），3分（阳性，棕褐色）。

2. 定量判断：根据阳性细胞的密度进行判断。

在低倍镜下，根据阳性细胞占总细胞数的比例（例如IHC标记阳性肿瘤细胞占所有细胞的比例），≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。

3. 定位判断：根据阳性细胞在组织细胞中的形态、分布进行判断。

以上信息仅供参考，建议查阅免疫组化相关书籍获取更全面和准确的信息。

免疫组化实验没学好？来看CST中国为你整理的操作要点免疫组化，简称IHC，是应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色，对组织细胞内抗原进行定位、定性及相对定量研究的实验方法。

包括石蜡切片的免疫组化技术（IHC-P）和冰冻切片的免疫组化技术（IHC-F），今天主要讲的是IHC-P。

免疫组化操作要点①标本固定——不仅仅是“切一切”和“泡一泡”温柔地取材：大刀阔斧取材的同时，视组织如珍宝，莫挤压组织，轻柔取材和镊取。

尽量避开坏死区域。

太大太厚的组织不利于均匀一致的固定，实质组织取材厚度应小于5mm。

新鲜的固定液：固定液10%中性缓冲福尔马林(NBF) 需新鲜配置，商用型固定液注意其标注的有效期，避免使用过期变质的固定液。

充分及时地固定：固定液要充足，其与组织的体积比最好大于等于20倍；取材后即刻固定。

固定时需将瓶口封住，避免甲醛挥发。

组织的固定时间不宜过长，一般过夜（12-24h）即可。

免疫组化操作要点②修复大法——不仅仅是“煮一煮”微波炉修复：简单易行效果好，CST推荐使用微波炉完成修复。

合适的修复液：根据抗体说明书使用合适的修复液。

用柠檬酸修复后，切片需浸泡在修复液中，自然冷却；而用EDTA修复后，切片可直接从修复缸中取出，直接进行下一步。

注：使用不同的修复方式和不同生产商的抗体检测人肺癌组织中EGFR的表达。

第一排为CST 的EGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb（#4267），EDTA的修复方式明显优于柠檬酸盐及胃蛋白酶，故在该抗体说明书中，标注了使用EDTA修复进行免疫组化实验。

免疫组化操作要点③对的抗体，对的使用——不仅仅是“买买买和加加加”种属和应用范围：确定该抗体可检测所需种属（Reactivity）的石蜡切片上完成组化实验（Application：IHC-P）。

稀释液和稀释比：查看抗体说明书，使用正确的一抗稀释液和稀释比。

免疫组化诊断不仅仅是棕色显色——沈勤根据2016年福州会议陈国璋教授讲稿编译，未经授权，不得转载。

一、免疫组化显色的解释1.阳性或者阴性均有重要意义。

2.染色定位对于评判真假阳性同样重要；有些抗体/蛋白（如P120 catenin，β-catenin）着色部位改变提示特定的病理意义。

二、免疫组化染色模式可提供额外线索一些免疫染色，着色的特定分布可为诊断提供额外的线索和标准，如：胞浆含量、细胞形态、阳性细胞分布或排列方式、阳性细胞比率、阳性着色强度。

三、Cytokeratin1.显示肿瘤细胞内胞浆物质含量小细胞癌胞浆稀少，免疫染色呈特殊改变，棕色着色纤细、不完整环绕核周或仅位于核旁点状，而非小细胞癌因胞浆丰富则着色宽阔、并完整环绕胞核。

尽管小细胞癌还可表达Syn，但不总是表达。

因此Cytokeratin染色含量可助区分小细胞癌和非小细胞癌。

2.粘膜部位病变，观察Cytokeratin显色的分布和模式可助识别微小癌灶鼻咽部粘膜活检，粘膜下Cytokeratin着色的细胞分布紊乱、失去正常组织结构，再仔细观察细胞形态，更确认为癌。

胃粘膜活检，固有层内细胞弥漫生长、失去正常腺体结构，需要鉴别印戒细胞癌和组织细胞，若pan-Cytokeratin表达呈印戒细胞样或条索状，则诊断为印戒细胞癌。

四、CK201.尿路上皮CK20表达增多/异常分布，提示异型增生和原位癌。

2.正常尿路上皮均浅表覆盖的伞细胞表达CK20；若基底层或上皮全层均着色，提示异型增生或原位癌。

五、p161.p16染色真阳性的界定包括阳性细胞的分布和方式。

2.与肛门生殖器部位感染HPV有关；不同部位癌的HPV 感染率不同，宫颈癌（～100%），肛管（70-100%），阴道癌（60%），外阴癌（50%），阴茎癌（35%）。

3.p16是周期依赖激酶抑制因子，免疫着色定位于胞核+/-胞浆。

在适当的背景下，p16阳性说明肿瘤内高危型HPV 转录活性强。

免疫组化（IHC）标准化云南省第三人民医院病理科徐开军免疫组化（IHC）是病理诊断的主要辅助手段之一。

虽然免疫组化在各个实验室已经常规开展，但是由于各个实验室选择的抗体试剂厂家、抗原修复方法、检测系统等不同，免疫组化实验技术操作方法亦不相同，染色结果会出现各种差异。

免疫组化染色技术操作步骤看似简单，但步骤较多且环环相扣，而且许多因素影响着免疫组化的结果，包括技术人员是否熟练掌握整个实验的操作程序、抗体的特异性、检测方法的敏感性、组织标本的固定、抗原的修复及修复液的PH值等众多因素。

所以，完成一张满意的免疫组化切片并非那么简单。

20世纪末，非生物素型聚合物（Polymer）检测系统的出现，可以有效地防止内源性生物素的干扰，而且灵敏度高，操作便捷，已被免疫组化实验室广泛应用。

当前，免疫组化技术标准化的讨论是建立在由福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片并使用非生物素型聚合物检测方法的基础上而展开的。

1、免疫组化染色前的处理：组织的固定、取材、脱水、包埋、切片与展片、烤片、脱蜡。

（1）组织的固定：固定的目的是防止组织、细胞自溶与腐败，凝固或沉淀组织、细胞内物质，以保持组织和细胞固有形态和结构。

对免疫组化而言更重要是保存组织、细胞内的抗原，防止抗原破坏和弥散。

需高度重视的是手术或穿刺离体组织必须马上放于标本袋固定，固定后应与病理申请单及时送交病理科。

病理医生有责任与手术送检科室进行必要的配合与沟通，避免手术后的病理标本随意丢放。

由于免疫组化的固定剂种类较多，性能各异，不同抗原其稳定性各不相同，因此，要了解不同固定剂的特征。

常采用甲醛、戊二醛、Bouin、B5等固定液。

由于中性缓冲福尔马林渗透力强、组织收缩小，能使大多数抗原物质保存较好，提高免疫组织化学检测的阳性率，因此推荐作为病理标本的首选固定液。

应避免使用含重金属的固定剂。

10%中性缓冲福尔马林配制方法：40%甲醛100ml磷酸二氢钠4g磷酸氢二钠 6.5g蒸馏水900ml固定液的量一般为组织块总体积的5-10倍，小标本固定时间为4-6小时，大标本为18-24小时。

免疫组化显色方法嘿，咱今儿就来聊聊免疫组化显色方法。

这免疫组化啊，就像是一场微观世界里的奇妙探险！你想啊，细胞们就像是一群小精灵，而免疫组化显色方法就是我们用来发现这些小精灵秘密的神奇魔法。

先来说说直接法吧。

这就好比你直接找到了目标，一眼就看穿了它，简单直接，不绕弯子。

直接让标记的抗体和抗原结合，迅速显色，效果那叫一个立竿见影。

然后是间接法，这就有点像接力赛啦。

先让一棒抗体去找到抗原，再让带着标记的另一棒抗体去结合前面那棒，这样层层递进，最终让显色呈现出来。

就好像是经过了一番努力才找到了最终的答案。

还有什么亲和素-生物素法呀，这就像是给细胞们搭建了一个特别的舞台，让它们在上面尽情展示自己。

利用亲和素和生物素之间超强的亲和力，让显色变得更加清晰和明显。

免疫组化显色方法可不只是在实验室里玩玩哦，它在医学诊断上那可是有着至关重要的作用呢！医生们就靠着这些方法来判断疾病的情况，就像侦探靠着线索破案一样。

比如说，通过免疫组化显色可以判断肿瘤细胞的类型和特征，这对于治疗方案的制定可是极其重要的呀！你能想象如果没有这些方法，医生们该多迷茫吗？而且呀，随着技术的不断进步，免疫组化显色方法也在不断地发展和完善呢。

就像我们的生活一样，总是在不断变好。

那我们普通人了解这些有啥用呢？嘿，你想想，多了解一点知识总是没坏处的嘛！说不定哪天你就能跟别人吹吹牛，讲讲免疫组化显色方法的奇妙之处呢！总之呢，免疫组化显色方法就像是一把打开微观世界大门的钥匙，让我们能更深入地了解细胞的奥秘。

它是医学领域的重要工具，也是我们探索生命奥秘的有力武器。

咱可得好好认识认识它，对吧？。

免疫组化技术规范欧美国家相继开展了免疫组化质量控制工作，建立了一套比较完善的质量控制方法和程序。

中国病理工作者委员会（CCP）免疫组化研究中心借鉴国外的先进经验并结合我国当前的实际情况开始探索一种适合我国免疫组化质控的方法，同时，发现和推广标准化的染色程序，改善和提高免疫组化实验的可靠性，使免疫组化技术更具标准化，免疫组化结果更具可靠性和重复性。

尽管免疫组化在许多实验室中已常规开展，但它是一个多步骤、多因素决定的一种实验方法，由于各实验室采用的修复方法、染色方法、试剂厂家、抗体克隆号、检测系统等有所不同，染色结果会出现较大差异，相当部分的实验室对免疫组化标准化的认识尚欠足够重视, 致使不良的染色结果对病理诊断引起误导，因此免疫组化染色结果的可靠性受到了极大的关注。

在实际工作当中有许多因素影响着免疫组化的结果，包括技术人员是否熟练掌握整个实验的操作程序、抗体的特异性、方法的敏感性、标本的固定、组织的处理、是否进行抗原修复、修复液的PH值等等因素。

为了让每个实验室能够持续稳定地完成可靠的实验染色结果，应当将免疫组化染色技术中的全部流程纳入标准化。

一、免疫组化成功的要素病理科医生要有相当的免疫组化诊断知识和免疫组化技术经验，要清楚认识免疫组化技术是一门实验性、技术性非常强的技术，要多了解多种抗体在组织中的表达情况，以及影响免疫组化结果的各种因素，只有提高医生的免疫组化诊断水平才能避免错误的判断，才能确保免疫组化诊断的准确性。

病理技术人员是免疫组化实验成功的关键因素，操作人员要有丰富的免疫组化的理论知识及熟练的免疫组化染色技术，十分清楚每一个步骤的应用原理，使实验结果更具可靠性。

可靠的实验试剂和实验方法是每个实验室的必备条件。

由于实验方法多种多样，抗体的品种繁多，每个实验室都应当确保高质量高效价的试剂，并摸索出最佳的实验条件。

优质的免疫组化取决于有效的抗原修复、敏感的检测系统、合适的实验质控对照及熟练和有责任心的技术人员。