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全自动免疫组化染色仪工作过原理引言：全自动免疫组化染色仪（Automated Immunohistochemistry Stainer）是一种用于组织学研究和病理诊断的重要设备。
它通过自动化的方法实现对组织标本的免疫染色，为医学研究和临床应用提供了高效、准确的技术支持。
本文将介绍全自动免疫组化染色仪的工作原理及其应用。
一、全自动免疫组化染色仪的组成全自动免疫组化染色仪主要由样本处理模块、试剂盘、染色盘、显微镜、相机和控制系统等部分组成。
其中，样本处理模块负责对组织标本进行预处理，包括脱水、脱脂、抗原修复等；试剂盘用于存放和供应试剂；染色盘用于容纳染色液和组织标本；显微镜和相机用于观察和记录染色结果；控制系统用于控制整个仪器的运行。
二、全自动免疫组化染色仪的工作原理全自动免疫组化染色仪的工作原理可以分为以下几个步骤：1. 样本制备：将组织标本切片后，通过组织学处理方法，如脱水、脱脂、抗原修复等，使组织标本符合染色要求。
2. 抗体染色：将标本放置在染色盘中，通过试剂盘供应抗体溶液。
全自动免疫组化染色仪通过控制系统，精确控制抗体的投放量和时间，确保染色的准确性和一致性。
3. 洗涤：染色后，仪器自动进行洗涤步骤，以去除未结合的抗体。
4. 显色：通过试剂盘供应显色液，使已结合的抗体表现出可见的颜色反应。
5. 去色：洗去多余的显色液，使染色结果更加清晰。
6. 固定：通过试剂盘供应固定液，使染色结果稳定并防止褪色。
7. 观察和记录：将染色结果放置在显微镜下观察，并通过相机记录结果。
全自动免疫组化染色仪的高分辨率相机可以捕捉到细胞和组织的微观结构，为研究和诊断提供准确的图像数据。
三、全自动免疫组化染色仪的应用全自动免疫组化染色仪在医学研究和临床应用中具有广泛的应用价值。
它可以用于研究细胞和组织的免疫表型，帮助科学家了解细胞和组织的分子特征和功能。
同时，全自动免疫组化染色仪在病理诊断中也起到了重要的作用。
通过对组织标本的免疫染色，医生可以确定疾病类型、判断疾病的严重程度和预后，为患者的治疗提供准确的依据。
免疫组化显色原理
免疫组化显色是指利用免疫学原理，通过特异性抗体与抗原之间
的结合，利用染料或物质标记来标示出目标蛋白质或细胞。
在免疫组
化显色中，常使用辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等标记
物质，并且利用色素反应的原理，对标记物质进行染色。
其中，HRP染色采用的是DAB（3-3’-二氨基联苯）染色法，AP染色则使用的是
NBT/BCIP（硝基蓝/四氯化磷杂蓝）染色法。
在DAB染色法中，HRP将DAB氧化成为可见的褐色沉淀物，这种
沉淀在组织中呈现出棕色或褐色，可以被光镜观察到。
而NBT/BCIP染
色法中，AP将NBT和BCIP还原成为可见的紫色颗粒物和暗蓝色沉淀物。
这两种染色法的选择，取决于使用的抗体和实验设计的需要。
第３６卷温卅Ｉ医学院学报第２期图１ＤＡＢ＋苏木素系统显色效果欠理想，背景非特异性着色明显（×１００）。
Ｆｉｇ．１ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＤＡＢ＋Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｃｏｌｏｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｇｏｏｄ；ｉｎｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ，ｔｈｅｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｓｔａｉｎｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙ（Ｘ１００）．图２ＡＥＣ＋苏木素系统显示：胞浆阳性定位准确、清晰，与背景反差强（Ｘ２００）。
Ｆｉｇ．２ＡＥＣ＋ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｃｏｌｏｒａｔｉｏｎｓｙｓ＝ｓｈｏｗｅｄ：ｃｙｔｏｐｌａｓｍｗａｓｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｌｏｃａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｗａｓａｎｄｂｅｔｔｅｒｗｉｔｈｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ．ｆ×２００）．极强，但色彩强度略低；甲基绿复染后，虽两种色彩对比欠强，但阳性细胞仍能明显区分；核快红复染后色彩对比增强，阳性部位胞浆显示明显，背景无干扰（见图４）。
２．４几种显色系统的总体比较从显色时间，阳性部位定位，复染后背景干扰情况，显色剂和复染剂反差等进行综合比较（见表１）。
表１．显色系统的效果比较Ｔａｂｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃｏｌｏｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ注：＋表示显色效果一般；＋＋表示中等；＋＋＋表示效果最好。
一表示不能组合使用３讨论为使免疫组化结果容易识别，我们用食管下端肌间神经丛（位于环形肌和纵行肌之间）的氮能神经元作为阳性细胞。
实验结果表明，同一组织，在抗体浓度、孵育时间等条件完全相同的情况下，选用不同显色系统后，其显色效果差异很大。
尤其是对一些弱表达的抗原，用常规ＤＡＢ＇ｆＥ难清晰显示出来，因此可能产生完全相反的结果［１］，也可能在某些组织与内外源性棕黄色颗粒难区分［引，同时，ＤＡＢ系统作为实验室最常用的免疫组化显色试剂，与本实验中所选用的几种显色系统比较，其显色效果欠理想。
ＡＥＣ＋苏木素系统和４一ＣＮ＋核快红系统显色效果最佳，但该类切片只能用水溶性封片剂封图３ＡＥＣ＋甲基绿系统中，胞浆阳性显示清晰，但背景细微结构显示差（×１００）。
免疫组化实验流程及常见问题1 免疫组化概念原理2 免疫组化染色步骤目录3 结果分析4 常见问题分析※免疫组化原理PART 1免疫组化概念原理※免疫组化样本种类免疫组化概念原理免疫组化学（immunohistochemistry，IHC）应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究样本种类：组织标本和细胞标本两大类，包括石蜡切片（IHC-P）和冰冻切片(IHC-P)，细胞片(ICC)。
※实验步骤流程图※样本取材固定PART 2免疫组化染色步骤※实验步骤讲解实验流程图种器官，优先取消化器官，其次取中枢神经系统器官(脑，脊髓等)，皮肤、肌肉等可放到最后取。
3.组织块大小：未经灌注的标本组织厚度不要超过1cm 。
5.固定液量：固定液体积为组织的10倍，且组织能在容器内自由移动，不贴壁不沉底，并做好清晰标记。
4.固定液：针对不同的标本特点及实验目的一定要选用正确的固定液，4%多聚甲醛，有致密外膜Carnoy 液，活检用Bouin 。
7.固定温度：常温即可，无需冷藏，切勿冷冻结冰，否则固定液结冰形成冰晶严重破坏组织形态结构6.固定时间：6-24h最佳，固定越久所需修复强度越大，容易出现非特异性。
取材及固定切片选择要保存简单--- 选石蜡片!要速度快---选冰冻片!要结构漂亮---选石蜡片!抗原不稳定---选冰冻片!抗原稳定---石蜡片冰冻片皆可!组织形态结构保存完好顺序：新鲜组织立即投入固定液内固定石蜡切片>组织-80°冷冻后投入固定液内固定石蜡切片>新鲜组织立即投入固定液内固定冰冻切片>组织-80°冷冻后直接冰冻切片。
切多厚?脱蜡步骤石蜡片3-8um ， 一般4-5um;冰冻片5- 15pm,一般8μm水温40-45 ℃, 组织平整后玻片有油漆的一面贴近组织向斜上方提起怎么捞片?烤多久?37 ℃ 过夜或 60 ℃ 1-2h 注意:使用防脱处理的玻片实验步骤切片烤片实验步骤：灭活1内源性过氧化物酶在血管瘤、肝、胎盘、阑尾炎,坏死区域和急性炎症组织含量较高 2显色系统为过氧化物酶 (HRP )系统，该步骤建议一定要做3碱性磷酸酶 (AP )系统以及免疫荧光，该步骤可以不做4在灭活时,如组织片中出现细小且密集的气泡，表示过氧化物酶含量过高，这时用 3%H2O2溶液难以完全阻断，可以用0.5%高碘酸溶液室温条件孵育10min实验步骤柠檬酸盐缓冲液( PH6.0 )和EDTA( PH8.0或9.0)修复液经验证，对于大多数的抗体来说后者使用效果更优固定时间越久，修复强度越强旧标本修复强度强于新鲜标本3修复液的选择1 抗原修复方式4消化酶的选择需格外注意的各种消化酶的最佳工作PH值2消化酶的选择抗体选择1单抗和多抗各有优势，按需选用2 一抗4°C孵育效果最佳，备选37 ℃ 1-2h 3二抗需与一抗的种属、类别或亚类相匹配，推荐驴，山羊,绵羊等种属4二抗/SABC -般37 ℃孵育30 min 封闭1 5%BSA是最常用2血清，效果最全面3封闭血清与抗同源，与一抗不能同源封片1 DAB显色用中性树胶封片2免疫荧光建议用抗荧光衰减封片剂3 AEC显色用水溶性封片剂显色1 DAB显色液现用现配2建议镜下控制反应时间3根据显色时间反向优化实验条件※抗原定位※结果分析方法PART 3结果分析抗原定位胞膜型表达胞核型表达胞质型表达胞膜-质型表达胞核-质型表达抗原定位查数据推荐：01 Option here02Option here 评分法:通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度( 0-3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1-4分为0-25%、26 -50%、51-75%、76-100%) ，最终可以分数想加，再进行比较阳性着色细胞计数法:在40X光镜下,随机选择不重叠的3-5个视野，人工或机器计数阳性着色细胞和总细胞数，比较阳性细胞比率图片软件分析:通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用图片分析软件进行分析，然后进行统计分析即可H-SCORE分析:设置组织切片上所有的深棕色为强阳性，棕黄色为中度阳性，浅黄色为弱阳性，蓝色细胞核为阴性。
