黄嘌呤氧化酶法测定抗氧化能力

1、细胞氧化细胞生命活动过程中所需的能量约有95%是来自于线粒体，其来源是将细胞内的供能物质氧化、分解、释放能量，并排出CO2和H2O，这一过程称之为细胞氧化（cellular oxidation)，又称细胞呼吸（cellular respiration)。

其基本步骤有：糖酵乙酰辅酶A（CoA)的形成、进行三羧酸循环及电子传递和化学渗透偶联磷酸化作用。

酶能使细胞的氧化过程在此比较低的温度下进行，并释放出仅仅使细胞能够扑获和储存的能量。

这个受生物学控制的氧化结果起初就和简单的燃烧现象一样：复杂的分子被降解为水，二氧化碳，并释放能量。

这个过程中一些经过交换的电子永久地逃离细胞的呼吸或从呼吸中心遗漏掉并同周围的氧分子相互作用，产生有毒性氧分子—自由基。

在细胞呼吸的过程中，估计有2-5%的电子转化为过氧化物分子和其他类型的氧化自由基，自由基的持续增加就对机体组织造成大量的氧化压力。

自由基被认为与大约60种(而且至少是60种)疾病的发生有关，科学有证据证实，抗氧化剂能停止甚至逆转(在某些疾病中)由于自由基所导致的损伤。

自由基与机体细胞发生作用后，给机体留下了毁灭性的灾难。

在细胞膜上留下了许多微笑的孔洞，使细胞的分子结构发生改变，破坏了细胞的蛋白和脂类分子。

一旦我们机体细胞内有足够的抗氧化剂储备，我们就能将自由基对机体的损伤程度降到最低。

2、OS氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。

氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。

指机体在内外环境有害刺激的条件下，体内产生活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）和活性氮自由基（Reactive Ntrogen Species，RNS）所引起的细胞和组织的生理和病理反应。

ROS有超氧阴离子（.O2-）、羟自由基（.OH-）和过氧化氢（H2O2）等等；RNS有一氧化氮（NO）、二氧化碳（CO2）和过氧亚硝酸盐（.ONOO-）等等。

槲皮素-金属络合物的抗氧化研究进展摘要：槲皮素是一种黄酮醇类化合物，槲皮素同时具有很多的的生物及药理活性。

由于槲皮素结构中的共轭结构，它可以与很多常见金属离子螯合成稳定的多环状配合物，并且表现出比槲皮素本身更高的抗氧化活性。

本文通过对近年来国内外关于槲皮素的常见金属络合物（-Ca,-Cu，-Zn，-Cr，-Mg等）的制备、抗氧化/清除自由基活性的研究进行综述,并对槲皮素-金属配合物的研究现状进行分析总结，有望对该领域的深入理解以及抗氧化机理的探索研究奠定理论基础。

关键词：槲皮素-金属络合物；抗氧化；研究进展Abstract：Quercetin is a kind of flavonoids with multifarious biological and pharmacological activities. Because of the conjugated structure of quercetin, it can chelate with many common metal ions to synthesize stable polycyclic complexes. Furthermore, it’s found that the antioxidant activities of quercetin-metal complexes are significantly higher than quercetin. In this study, the preparation and the antioxidant activities (i.e. free radical scavenging capacities) of different quercetin-metal complexes (-Ca, -Cu, -Zn, -Cr, -Mg, etc.) were reviewed. On this basis, the research progress of quercetin-metal complexes was summarized, and the future development trend of this area was also analyzed. We hope the present review could benefit the deep understanding of the antioxidant activities of quercetin-metal complexes..Key words：Quercetin-metal complex; antioxidant activity; research progress.目录1 槲皮素及其金属络合物 (2)2 槲皮素金属络合物的抗氧化研究进展 (2)2.1 槲皮素-金属络合的抗氧化机制 (2)2.2 槲皮素-Zn(Ⅱ)络合物的抗氧化研究进展 (3)2.3 槲皮素-Cu络合物的抗氧化研究进展 (7)2.4 槲皮素-铬（Ⅱ）络合物的抗氧化研究进展 (7)2.5 槲皮素-镁络合物的抗氧化研究进展 (9)2.6 槲皮素-钙络合物的抗氧化研究进展 (10)3 槲皮素-金属络合物抗氧化性的对比研究 (11)3.1 不同槲皮素金属络合物的对羟基自由基（.OH）的清除率测定 (11)3.2 不同槲皮素金属络合物对超氧阴离子(O2-)自由基清除率的测定 (11)3.3 HPLC法测定不同槲皮素金属络合物对DPPH.自由基的清除率 (12)4 总结 (12)4.1 槲皮素-金属络合物抗氧化作用机制猜测 (13)4.2 槲皮素-金属络合物的抗氧化机制研究可行性策略 (13)参考文献 (14)致谢 (16)1 槲皮素及其金属络合物槲皮素(Quercetin，3，5，7，3’，4’-五羟基黄酮)，有多方面的生物学活性及很高的药用价值，是一种在蔬菜水果中大量存在的生物类黄酮，常通过酸水解得到。

细胞氧化应激检测方法
细胞氧化应激检测方法主要有以下几类：
测定由活性氧修饰的化合物：利用DCFH-DA荧光标记法、黄嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法、罗丹明123荧光染色法、硫代巴比妥酸法等检测细胞内ROS含量。

Amplex Red 荧光染色法可检测细胞内脂质氢过氧化物，而C11-BODIPY 荧光染色法、GSH试验方法等则用于检测细胞内脂质过氧化。

测定活性氧消除系统酶和抗氧化物质的量：通过免疫印迹法检测SOD的表达，氯化硝基四氮唑兰（NBT）可检测细胞内SOD的活性，DTNB可检测机体抗氧化系统的损伤。

测定含有转录因子的氧化应激指示物：这种方法通过检测氧化应激状态下的特定转录因子或其下游产物的变化来评估氧化应激程度。

此外，还有一些其他方法如蛋白质氧化损伤检测、脂质过氧化检测分析、核酸DNA/RNA损伤分析等，这些方法可以通过检测蛋白质羰基化、硝基化损伤及晚期氧化蛋白产物（AOPP），脂质过氧化的标志物壬烯（HNE）和丙二醛（MDA），
以及8-异前列腺素F2a等指标来评估细胞的氧化应激状态。

请注意，以上方法可能需要根据具体的实验条件和需求进行优化和调整。

同时，不同的方法可能具有不同的灵敏度和特异性，因此在选择方法时需要根据实际情况进行综合考虑。

影响超氧化物歧化酶活性测定的因素赵建;李想;鲁政;文镜【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2010(031)009【摘要】目的:证实在黄嘌呤氧化酶法中影响超氧化物歧化酶(SOD)活性测定的干扰因素及其对保健食品抗氧化功能评价造成误差.方法:用黄嘌呤氧化酶法测定加入白蛋白、总蛋白、甘油三酯、葡萄糖、VC、还原型谷胱甘肽6种物质对SOD检测体系的影响以及小鼠灌胃VC后的SOD比活力值.结果:在黄嘌呤氧化酶法反应体系中,SOD灭活后依然能够检测到SOD比活力值.白蛋白、总蛋白、甘油三酯、葡萄糖、VC、还原型谷胱甘肤6种物质都对该体系造成干扰.透析能够消除小鼠血清中小分子物质的干扰.结论:由于黄嘌呤氧化酶法检测SOD为非特异性反应,血清中的蛋白质、脂肪、VC、还原型谷胱甘肽等物质都对SOD活性测定产生干扰而造成正误差.可采用透析的方法去除血清中含有对SOD检测体系构成干扰的小分子物质.【总页数】3页(P216-218)【作者】赵建;李想;鲁政;文镜【作者单位】北京联合大学,生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,北京,100191;北京市药品检验所,北京,100035;北京联合大学,生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,北京,100191;北京联合大学,生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,北京,100191【正文语种】中文【中图分类】TS207.3【相关文献】1.凝胶注模成型固化过程及其影响因素--陶瓷浆料凝胶点测定及其影响因素的研究[J], 马利国;黄勇;杨金龙;苏亮;赵雷2.超氧化物歧化酶活性测定的影响因素研究 [J], 严万里;陈晓明;郭丽燕;柳芳3.国产3D面积测定仪表面积测定影响因素研究 [J], 邱烨; 孔维恒; 李祖敏; 郝欣; 郭文萍; 刘萤; 云环; 高欣; 刘鑫4.高频红外碳含量测定仪测定结果的影响因素探讨 [J], 刘淑梅5.哪些因素对血脂检查有影响?进行血脂检查时为什么要空腹12h?怎样减少血脂测定前的干扰因素对测定的影响? [J], 鄢盛恺因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一、实验背景人参，作为我国传统中药材之一，具有补气养阴、健脾益肺、安神益智等功效，被广泛应用于中医临床。

近年来，随着科学研究的深入，人参在抗疲劳、抗应激、抗氧化等方面的作用也逐渐被证实。

本实验旨在探究人参对小鼠应激反应的影响，为人参在抗应激领域的应用提供科学依据。

二、实验目的1. 观察人参对小鼠应激反应的影响；2. 探讨人参对小鼠脑组织神经递质的影响；3. 分析人参对小鼠抗氧化能力的影响。

三、实验材料与方法1. 实验动物：健康昆明种小鼠，体重18-22g，雌雄各半，随机分为4组，每组10只。

2. 实验药物：人参提取物，浓度为10mg/mL。

3. 实验方法：（1）分组：将小鼠随机分为4组，分别为对照组、模型组、人参低剂量组、人参高剂量组。

（2）造模：采用强迫游泳法建立小鼠应激模型，模型组小鼠给予生理盐水灌胃，人参低剂量组、人参高剂量组小鼠分别给予人参提取物灌胃，对照组小鼠给予等体积的生理盐水灌胃。

（3）检测指标：1）应激反应：观察小鼠游泳时间、游泳距离、沉水时间等指标；2）脑组织神经递质：采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠脑组织中的多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）等神经递质水平；3）抗氧化能力：采用黄嘌呤氧化酶法检测小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）含量。

四、实验结果1. 应激反应：人参低剂量组、人参高剂量组小鼠游泳时间、游泳距离、沉水时间均明显优于模型组（P<0.05），表明人参具有抗应激作用。

2. 脑组织神经递质：人参低剂量组、人参高剂量组小鼠脑组织中的DA、NE、5-HT 水平均显著高于模型组（P<0.05），表明人参可以改善小鼠脑组织神经递质水平。

3. 抗氧化能力：人参低剂量组、人参高剂量组小鼠血清中的SOD、GSH-Px活性及MDA含量均优于模型组（P<0.05），表明人参具有抗氧化作用。

目录1 前言 .................................................................................. 错误！未定义书签。

2. 材料与方法 ..................................................................... 错误！未定义书签。

2.1 实验饲料 ................................................................ 错误！未定义书签。

2.2 实验过程 ................................................................ 错误！未定义书签。

2.3 样品采集和分析 .................................................... 错误！未定义书签。

2.4 数据处理和统计方法 ............................................ 错误！未定义书签。

3.实验结果 ........................................................................... 错误！未定义书签。

3.1 鱼体生化组成 ........................................................ 错误！未定义书签。

3.2过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）错误！未定义书签。

3.3肝脏丙二醛（MDA）含量.................................... 错误！未定义书签。

4 讨论 .................................................................................. 错误！未定义书签。

黄嘌呤氧化酶法测定抗氧化能力集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）发酵过程产物形成的测定(SOD活性的测定)一、实验目的1、了解SOD活性测定的原理2、学习黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性二、实验原理原理：黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺成亚硝酸盐，亚硝酸盐在对氨基苯磺酸与甲萘胺作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。

当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性抑止作用，使可形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于空白管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中SOD 的活力。

操作步骤：如表2-1。

三、实验试剂硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌呤氧化酶，醋酸等。

四、实验步骤试剂测定管对照管0.550.5575mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.8）待测样品（ml）A(取样量)00.1mol/L 盐酸羟胺溶液0.050.0575mmol/L 黄嘌呤溶液0.050.050.037U/L 黄嘌呤氧化酶0.050.05双蒸水0.2－A0.2用漩涡振荡器充分混匀，置37℃恒温水浴30min。

显色剂（ml）11总体积1.9ml ，混匀，室温放置10min ，蒸馏水调零，测A530五、计算方法计算公式：每毫升反应液中SOD 抑止率达50％时对应的SOD 量为一个SOD 活力单位（U ），待测样品中的SOD 活力由下式计算：SOD 抑制率（％）＝（A2-A1）/A2×100%SOD 活力（U/ml ）＝（A2-A1）/A2×100%÷50％×反应体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数 式中：A1:测定管的吸光值；A2:空白管的吸光值 六、注意事项：1.试管要洗干净，在测定微量样品时尤为重要。

2.要做空白管，并且放在所有测试管的中间做，取平均值。

常用试剂（1）诱导剂：分别配制 IPTG 100μmol/mL ； CuSO 4·5H 2O 250μm/mL ； ZnSO 4 100μm/mL 。

1、细胞氧化细胞生命活动过程中所需的能量约有95%是来自于线粒体，其来源是将细胞内的供能物质氧化、分解、释放能量，并排出CO2和H2O，这一过程称之为细胞氧化（cellular oxidation)，又称细胞呼吸（cellular respiration)。

其基本步骤有：糖酵乙酰辅酶A（CoA)的形成、进行三羧酸循环及电子传递和化学渗透偶联磷酸化作用。

酶能使细胞的氧化过程在此比较低的温度下进行，并释放出仅仅使细胞能够扑获和储存的能量。

这个受生物学控制的氧化结果起初就和简单的燃烧现象一样：复杂的分子被降解为水，二氧化碳，并释放能量。

这个过程中一些经过交换的电子永久地逃离细胞的呼吸或从呼吸中心遗漏掉并同周围的氧分子相互作用，产生有毒性氧分子—自由基。

在细胞呼吸的过程中，估计有2-5%的电子转化为过氧化物分子和其他类型的氧化自由基，自由基的持续增加就对机体组织造成大量的氧化压力。

自由基被认为与大约60种(而且至少是60种)疾病的发生有关，科学有证据证实，抗氧化剂能停止甚至逆转(在某些疾病中)由于自由基所导致的损伤。

自由基与机体细胞发生作用后，给机体留下了毁灭性的灾难。

在细胞膜上留下了许多微笑的孔洞，使细胞的分子结构发生改变，破坏了细胞的蛋白和脂类分子。

一旦我们机体细胞内有足够的抗氧化剂储备，我们就能将自由基对机体的损伤程度降到最低。

2、OS氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。

氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。

指机体在内外环境有害刺激的条件下，体内产生活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）和活性氮自由基（Reactive Ntrogen Species，RNS）所引起的细胞和组织的生理和病理反应。

ROS有超氧阴离子（.O2-）、羟自由基（.OH-）和过氧化氢（H2O2）等等；RNS有一氧化氮（NO）、二氧化碳（CO2）和过氧亚硝酸盐（.ONOO-）等等。

抗氧化中药的研究现状摘要：随着人们对氧自由基氧化对机体损伤了解的加深，抗氧化药物成为近年来分析的热点。

目前，具备抗氧化作用的西药大体有三种：①过氧化氢酶（CAT）、谷胱肽过氧化物酶（GSH-PX）等切断氧自由基生成的药物；②维生素C、为生素E、还原型血红蛋白甘肽等链式反应阻断剂；③具备两种功能的药物，如超氧化物歧化酶（SOD）。

在中医宝库里面，也有很多具备抗氧化作用的药物。

随着研究方法的增加，抗氧化中药的研究也越来越多。

本文对近年来的相关研究展开了综述。

关键词：中药；抗菌药物；研究现状1研究方法1.1体外试管法1.1.1黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶作用之下对氧自由基的清除作用，后者是鲁米诺造成萤光化学反应，加入药物之后，萤光抑制率可测量出反映药物清理氧自由基的能力。

1.1.2对氧自由基的清除作用HpD（Hematoporphyrinderivative）在光的作用下产生O2，后者使红细胞溶解，加入一定量药物后可以抑制这种红细胞的溶解，以反映药物对的清除能力。

1.1.3抗过过氧化氧作用，过氧化氢与红细胞孵育时可引发显著溶血，可通过增入一定量的药物用以缓解溶血，以体现药物抗过氧化氢的能力。

1.1.4多形核白细胞（PMN）的呼吸发生在PMAT-甲酰氨基乙酸乙酯的作用之下可产生呼吸爆发，进而激活鲁米诺萤光。

加入一定量的药物可刺激由呼吸爆发引发的萤光化学反应，从而体现药物对氧化作用发生的抑制作用。

1.1.5高密度脂蛋白（LDL）的抑制作用在一定浓度的铜离子和空气之中可水解为水解LDL（ox-LDL）。

LDL的氧化程度可通过测量硫代巴比妥反应物、二烯键融合、为生素E含量等方法来体现。

增入一定量的药物可刺激LDL的氧化反应，这体现了药物对LDL氧化动词的抑制作用。

1.2动物试验在动物实验研究方面，对凋亡、脑再灌注受损、挤压伤、肺纤维化、急性缺氧和肝肾再倒入损伤展开了研究。

主要采用的动物是鼠和兔。

指标包含：①血液之中LPO含量。

抗氧化/自由基检测的方法及步骤
一、技术简介
自由基是含有未成对电子的原子、分子或原子团。

它是线粒体在电子传递的过程中产生的，正常情况下，机体的自由基清除系统可使自由基的产生与消除保持在极低的动态平衡水平上，对机体是有利的。

但当体内蓄积过量自由基时，就会损伤细胞，导致动物组织或细胞的氧化损伤。

在抗氧化研究中，自由基的检测已成为至关重要的一环，得到了广泛的应用。

自由基检测的方法多种多样，包括自由基相关酶的测定，化学发光测定，吸光度法等。

以SOD检测为例，介绍其主要原理和实验流程。

超氧化物歧化酶（SOD）是一种抗氧化剂，其主要功能是清除机体内的自由基。

黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺成亚硝酸盐，亚硝酸盐在对氨基苯磺酸与甲萘胺作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。

当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性抑止作用，使可形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于空白管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中SOD的活力。

二、实验流程
1. 从血液或组织中提取超氧化物歧化酶（SOD）；
2. 设置测定管和对照管，加入相应的试剂；
3. 混匀，37℃恒温水浴30min；
4. 加入显色剂；
5. 吸光度检测；
6. 根据公式计算SOD活力。